Cistanche Deserticola-extrakt ökar benbildningen i osteoblaster
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Te-Mao Lia, Hsin-Chih HuangbChen-Ming Suc, Tin-Yun Hoa, Chi-Ming Wua, Wen-Chi Chend, Yi-Chin Fonga,eoch Chih-Hsin Tangf,c
Abstrakt
Mål:Vi undersökte effekten avCistanche deserticola Ma. (CD) på benbildning av odlade osteoblaster.MetoderDen mineraliserade nodulbildningsanalysen användes för att undersöka in vitro-effekterna av CD på benbildning. Alkaliskt fosfatas (ALP), benmorfogenetiska proteiner (BMP)-2 och osteopontin (OPN) mRNA-uttryck analyserades genom kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion. Verkningsmekanismen för CD-extrakt undersöktes med hjälp av Western blotting. Den anti-osteoporotiska effekten in vivo av CD-extrakt utvärderades i ovariektomiserade möss.NyckelfyndCD-extrakt hade ingen effekt på proliferation, migration eller sårläkning av odlade osteoblaster, men ökade ALP, BMP-2 och OPN-mRNA och benmineralisering. Mitogenaktiverat proteinkinas (MAPK) eller nukleär faktor (NF)-kB-hämmare minskade CD-extraktinducerad benbildning och ALP, BMP-2 och OPN-uttryck. CD-extrakt påverkade dock inte osteoklastogenesen. Dessutom förhindrade CD-extrakt benförlusten inducerad av ovariektomi in vivo.SlutsatserCD kan vara ett nytt benbildningsmedel för behandling av osteoporos.
Introduktion
Ben är en komplex vävnad som består av flera celltyper som genomgår en kontinuerlig process av förnyelse och reparation som kallas "benremodellering". Två huvudcelltyper som ansvarar för benremodellering är osteoklaster, som resorberar ben, och osteoblaster, som bildar nytt ben. Benombyggnad regleras av flera systemiska hormoner (t.ex. bisköldkörtelhormon, 1, 25-hydroxivitamin D3, könshormoner och kalcitonin) och lokala faktorer (t.ex. kväveoxid, prostaglandiner, tillväxtfaktorer och cytokiner).[1]
Osteoporos uppstår när resorption och bildning av ben är okoordinerade och överskott av bennedbrytning överstiger benuppbyggnaden.[2] Nuvarande behandlingar för osteoporos inkluderar bisfosfonater, kalcitonin och östrogen, som är benresorptionshämmare som upprätthåller benmassa genom att hämma osteoklastaktivitet.[3] Effekten av dessa läkemedel för att öka eller återvinna benmassa är dock relativt liten, absolut inte mer än 2 procent per år.[3] Det finns därför ett behov av benbyggande medel, såsom teriparatid, som stimulerar ny benbildning och korrigerar förändringen i trabekulär mikroarkitektur som är karakteristisk för etablerad osteoporos.[4,5] Eftersom ny benbildning i första hand är en funktion av osteoblasten, medel som verkar genom att antingen öka proliferationen av celler i osteoblastlinjen eller inducera differentiering av osteoblasterna kan förbättra benbildningen.[5,6]
Även om mekanismerna för osteoporos fortfarande är oklara, är de sannolikt relaterade till den minskade tillgängligheten eller effekterna av bentillväxtfaktorer, såsom benmorfogenetiska proteiner (BMP).[7] BMP, som är strukturellt relaterade till den transformerande tillväxtfaktor-b-superfamiljen, identifierades ursprungligen genom sin förmåga att inducera ektopisk benbildning hos gnagare.[8] BMP spelar en viktig roll i benbildning och bencellsdifferentiering genom att stimulera aktiviteten av alkaliskt fosfatas (ALP) såväl som syntesen av proteoglykan, kollagen och osteopontin (OPN).[9] En nyligen genomförd studie fann ett samband mellan osteoporos och specifika polymorfismer i generna BMP-2, ALP och OPN, vilket tyder på att de är associerade med utvecklingen av osteoporos.[10]
Cistanche deserticola Ma.(Orobanchaceae; förkortas CD) är en inhemsk ört i Kina och används ofta inom traditionell medicin som ett terapeutiskt medel på grund av dess lugnande, smärtstillande och immunstimulerande egenskaper.[11] Moderna farmakologiska studier har visat att CD-extrakt kan stimulera immunitet,[12] rensa fria radikaler[13] och öka aktiviteten hos superoxiddismutas.[14] Antiinflammatoriska och antioxiderande medel har potential att behandla osteoporos genom att öka benbildningen och/eller undertrycka benresorptionen.[15,16] Emellertid har effekten av CD på bencellsfunktionen ännu inte fastställts. Här rapporterar vi att CD-extrakt inte påverkade proliferationen, migrationen eller sårläkningsaktiviteten hos odlade osteoblaster, men ökade ALP, BMP-2 och OPN-uttryck och benmineralisering. Dessutom visar vi att det mitogenaktiverade proteinkinaset (MAPK) och nukleär faktor (NF) -kB-signaleringsvägarna kan vara involverade i den CD-medierade ökningen av genuttryck och benmineralisering. Däremot undertryckte inte CD-extraktet osteoklastogenes in vitro. Noterbart förhindrade behandling av möss med CD-extrakt benförlust inducerad av ovariektomi in vivo. Våra data tyder därför på att CD kan användas för att stimulera benbildning för behandling av osteoporos.
Cistanche deserticola
Material och metoder
Cistanche deserticola extrakt och material
CD-extrakt köptes från Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taiwan). Extraktion och isolering av CD följdes som tidigare beskrivits (på basis av spektraldata har de identifierat den kemiska sammansättningen inklusive beta-sitosterol, daucosterol, bärnstenssyra, triacontanol, acteosid, betain och polysackarid).[17] Kaninpolyklonala antikroppar specifika för p-extracellulära signalreglerade kinaser (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminala kinaser (JNK), JNK, p-p65 och p65 köptes från Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, USA). Osteocalcin ELISA-kitet köptes från Biosource Technology (Nivelles, Belgien). De C-terminala telopeptiderna av typ-I kollagen ELISA kit erhölls från Cross Laps (Herlev, Danmark). Den dominant-negativa p38-mutanten tillhandahölls av Dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, USA). Den dominant-negativa JNK-mutanten tillhandahölls av Dr. M. Karin (University of California, San Diego, USA). Den dominant-negativa ERK2-mutanten tillhandahölls av Dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Alla andra reagens erhölls från Sigma-Aldrich (St Louis, USA).
Cell kultur
Den murina osteoblastcellinjen MC3T3-E1 köptes från American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, USA). Celler odlades i 95 procent luft, 5 procent CO2 med a-MEM som kompletterades med 20 mm HEPES och 10 procent värmeinaktiverat fetalt kalvserum, 2 mm-glutamin, penicillin (100 U/ml) och streptomycin (100 mg) /ml).
Mätning av mineraliserad knölbildning
Mineraliserad knölbildning utvärderades enligt beskrivningen.[18] I korthet odlades osteoblaster i ett medium innehållande vitamin C (50 mg/ml) och b-glycerofosfat (10 mm) under två veckor, och mediet byttes var tredje dag. Efter inkubation med CD-extrakt i 12 dagar tvättades cellerna två gånger med 20 mm Tris-buffrad saltlösning innehållande
0,15 m NaCl (pH 7,4), fixerad i iskall 75 % (v/v) etanol i 30 minuter och lufttorkad. Kalciumavsättningen bestämdes med användning av alizarin red-S-färgning. Kortfattat färgades etanolfixerade celler och matris under 1 timme med 40 mm alizarin red-S (pH 4,2) och sköljdes noggrant med vatten. Den bundna färgen eluerades med 10 % (vikt/volym) cetylpyridiniumklorid, och alizarin red-S i proverna kvantifierades genom att mäta absorbansen vid 550 nm och jämfördes med en standardkurva. En mol alizarin red-S binder selektivt ungefär två mol kalcium.
Kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid
Totalt RNA extraherades från osteoblaster med användning av ett TRIzol-kit (MDBio Inc., Taipei, Taiwan). Omvänd transkription utfördes med 2 mg totalt RNA och en oligo(dT)-primer.[19,20] Kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion (qPCR) utfördes med TaqMan® enstegs PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). Totalt cDNA tillsattes (100 ng per 25-ml reaktion) med sekvensspecifika primrar och Taqman®-prober. Alla målgenprimrar och prober köptes kommersiellt, inklusive b-aktin som en intern kontroll (Applied Biosystems). qPCR-analyser utfördes i tre exemplar på ett StepOnePlus-sekvensdetektionssystem (Applied Biosystems). Cykelförhållandena var 10-min polymerasaktivering vid 95 grader följt av 40 cykler på 95 grader i 15 sekunder och 60 grader i 60 sekunder. Tröskeln sattes över icke-mallkontrollbakgrunden och inom den linjära fasen av målgenamplifiering för att beräkna cykelnumret vid vilket transkriptet detekterades (betecknat CT).
Western blot-analys
Cellysat framställdes såsom beskrivits tidigare. [21,22] Proteiner löstes upp med SDS-PAGE och överfördes till Immobilon polyvinyldifluoridmembran (Millipore, Billerica, USA). Blotterna blockerades med 4 procent bovint serumalbumin under 1 timme vid rumstemperatur och undersöktes sedan med anti-humana antikroppar från kanin mot p-65 eller p-p65 (1:1000) under 1 timme vid rumstemperatur. Efter tre tvättar inkuberades blottarna med peroxidaskonjugerad åsna-anti-kanin sekundär antikropp (1:1000) under 1 timme vid rumstemperatur. Blotterna visualiserades genom förstärkt kemiluminescens med användning av X-OMAT LS-film (Eastman Kodak, Rochester, USA).
Ovariektomi-inducerad osteoporos
ICR-honmöss, fyra veckor gamla, 22~28 g, användes för denna studie. Möss ovariektomiserades bilateralt under trikloracetaldehyd (100 mg/kg) anestesi och kontrollmöss skenopererades (Sham) för jämförelse. Benmineraldensitet och benmineralhalt mättes efter oral administrering av olika koncentrationer av CD-extrakt varannan dag under fyra veckor. Kroppens totala benmineraldensitet och benmineralinnehåll bestämdes med en dubbelenergi röntgenabsorptiometer (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, USA) med användning av ett läge för små försökspersoner som beskrivits tidigare.[18, 23] Alla protokoll överensstämde med institutionella riktlinjer och godkändes av Animal Care Committee vid China Medical University.
Statistisk analys
Statistisk analys utfördes med Prism 4.01mjukvara. (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). De angivna värdena är medelvärde ± SEM. Statistisk analys mellan två prover utfördes med hjälp av Students t-test. Statistiska jämförelser av mer än två grupper utfördes med envägsvariansanalys med Bonfer-Ronis posthoc-test. I samtliga fall ansågs P < 0,05="" vara="">
Cistanche deserticola extrakt
Resultat
Cistanche deserticola-extrakt ökar benmineraliseringen av osteoblaster
Tillsatsen av CD-extraktet under 24 eller 48 timmar påverkade inte proliferationen av mus-osteoblast MC3T3-E1-celler i en MTT-analys (data visas inte). Eftersom osteoblastdifferentiering är en komplex process som involverar cellproliferation och migration, testade vi också migreringsförmågan hos MC3T3-E1-celler efter behandling med CD-extrakt. Med hjälp av Transwell och sårläkningsanalyser fann vi att CD-extrakt inte påverkade osteoblastmigrering (data visas inte). Bildandet av mineraliserade knölar är en av markörerna för osteoblastmognad. Alizarin red S-färgning visade att mineraliserade knölar bildades när osteoblaster odlades under två veckor i ett medium innehållande vitamin C (50 mg/ml) och b-glycerofosfat (10 mm), och detta ökades på ett koncentrationsberoende sätt genom tillsatsen av CD (Figur 1a). Därför inducerade CD-extrakt benknölbildning av odlade osteoblaster, men inte deras proliferation eller migration. Vi undersökte också rollen av CD-extrakt i RANKL-inducerad osteoklastogenes men fann ingen effekt (data visas inte).
Cistanche deserticola-extrakt ökar alkaliskt fosfatas, benmorfogenetiskt protein-2 och osteopontinexpression i odlade osteoblaster
Differentierade osteoblaster uppvisar förhöjd ALP-aktivitet, vilket korrelerar med höga nivåer av enzymuttryck.[18] Vi fann att behandling med CD-extrakt i 72 timmar signifikant ökade osteoblast ALP-aktivitet (Figur 1b). Med tanke på den avgörande rollen för BMP-2, ALP och OPN i osteoblastdifferentiering, testade vi om CD-extrakt utövar sin effekt på osteoblastdifferentiering genom att reglera BMP-2-, ALP- och OPN-uttryck. Behandling av celler med CD-extrakt ökade mRNA-uttrycket av ALP, BMP-2 och OPN på ett koncentrationsberoende sätt (Figur 1c), vilket visar att CD-extrakt inducerade differentiering av osteoblaster genom att uppreglera ALP, BMP-2 och OPN-uttryck.
Cistanche deserticola-extrakt ökar benknölbildningen genom mitogenaktiverad proteinkinasväg
Det har rapporterats att MAPK spelar en viktig roll i benbildning [24,25] så vi undersökte sedan om denna signalväg är involverad i CD-extrakt-inducerad benmineralisering. Förbehandling av celler med ERK-hämmare U0126, p38-hämmare SB203580 eller JNK-hämmare SP600125 reducerade CD-extrakt-ökad benmineralisering (figur 2a, 3a och 4a). Dessutom blockerade hämmarna också CD-extraktinducerad ALP, BMP-2 och OPN-uttryck (figur 2b–4c). Transfektion av celler med ERK2-, p38- eller JNK-mutant minskade CD-extraktökningen i ALP-, BMP--2- och OPN-mRNA-uttryck (figur 2c, 3c och 4c). Därefter undersökte vi direkt ERK-, p38- och JNK-aktiveringen efter CD-extraktbehandling. Inkubation av celler med CD-extrakt inducerade ERK-, p38- och JNK-fosforylering (figur 2d, 3d och 4d). Därför medierar ERK, p38 och JNK den ökade benbildningen som induceras av CD-behandling av osteoblaster.
Cistanche deserticola-extrakt ökar benknölbildningen genom kärnfaktor-kB-vägen
Som tidigare nämnts är NF-kB-aktivering nödvändig för benbildning.[26,27] Därefter behandlade vi osteoblaster med NF-kB-hämmarna pyrrolidin-ditiokarbamat (PDTC) och N-tosyl-L-fenylalanin klormetylketon (TPCK) köptes från Calbiochem (Darmstadt, Tyskland) för att avgöra om NF-kB-aktivering är involverad i CD-extrakt-inducerad benmineralisering. Figur 5a visar att förbehandling av osteoblaster med PDTC eller TPCK hämmade CD-extraktinducerad benknölbildning och även minskade ökningen av ALP, BMP-2 och OPN-uttryck (Figur 5b och 5c). Fosforylering av NF-kB p65-subenheten är en indikator på NF-kB-aktivering; [28] i enlighet med detta fann vi att CD-extrakt ökade p65-fosforyleringen i osteoblasterna (Figur 5d). Dessa resultat indikerade att NF-kB-aktivering är viktig för CD-extraktinducerad ALP, BMP-2 och OPN-uttryck och benknölbildning.
Hämning av benförlust av Cistanche deserticola-extrakt i ovarieektomiserade möss
För att undersöka effekten av CD-extrakt på benförlust inducerades osteoporos hos honmöss genom ovariektomi. Som förväntat uppvisade ovarieektomiserade möss minskad total benmineraldensitet och benmineralinnehåll (Figur 6a och 6b). Behandling med CD-extrakt under fyra veckor hämmade förlusten av benmineraldensitet och benmineralinnehåll på ett dosberoende sätt (Figur 6a och 6b). Blodkoncentrationer av ALP kan återspegla osteoblastisk aktivitet.[29] Såsom visas i figur 6c inhiberade CD-extrakt minskningen i serum-ALP-aktivitet inducerad av ovariektomi. Dessutom ökade CD-extrakt också nivån av osteokalcin, en markör för benbildning, och minskade nivån av C-terminala telopeptider av typ-I kollagen, en markör för benresorption (Figur 6d och 6e). Dessa fynd stöder således styrkan och effektiviteten av CD-extrakt för att förhindra benförlust in vivo.
Diskussion
Cistanche deserticolaMa, en inhemsk ört i Kina, används ofta inom traditionell medicin för olika terapeutiska behandlingar på grund av dess lugnande, smärtstillande och immunstimulerande aktivitet.[11–15] Här visade vi att CD-extrakt inducerade benmineralisering i odlade osteoblaster, men gjorde det. påverkar inte deras cellmigration eller proliferation. Dessutom fann vi att ALP, BMP-2 och OPN är målproteiner för CD-extraktinducerad signalering, vilket kräver aktivering av ERK, p38, JNK och NF-kB.
Ben är en komplex vävnad som består av flera celltyper som kontinuerligt genomgår en process av förnyelse och reparation.[30] När resorption och bildning av ben är obalanserad, åsidosätter bennedbrytning benbildning och osteoporos resultat.[30] Vi använde ovarieektomiserade möss för att undersöka den anti-osteoporotiska effekten av CD-extrakt. Ovariektomerade möss hade minskad benmineraldensitet och benmineralinnehåll i kroppen, vilket lindrades genom behandling med CD-extrakt. CD-extrakt ökade också serumnivåerna av den osteogena markören ALP och osteokalcin. Därför är CD:n ett benbildningsmedel som förhindrar benförlust orsakad av ovariektomi in vivo.
Även om mekanismerna för osteoporos inte är helt klara, är de sannolikt relaterade till den minskade tillgängligheten eller minskade effekterna av bentillväxtfaktorer, såsom ALP, BMP-2 och OPN. Dessa tre faktorer spelar viktiga roller i processen för benbildning och ombyggnad,[31] och det har dokumenterats väl att stimulering av osteoblastcelldifferentiering huvudsakligen kännetecknas av ökat uttryck av ALP, BMP-2 och OPN.[32 ] I den här studien fann vi att CD-extrakt ökade ALP-, BMP--2- och OPN-uttryck och förbättrade benmineralisering. Därför medierar CD-extrakt benbildning delvis genom att uppreglera uttrycket av ALP, BMP-2 och OPN.
Det har rapporterats att p38 är involverat i regleringen av ALP-uttryck under differentieringen av osteoblastceller; [33] på samma sätt är ERK1/2 viktig för proliferation och differentiering av osteoblaster. [34,35] JNK är involverad i osteoklastbildning .[36] Vi visade här att CD-extrakt inducerade ERK-, p38- och JNK-fosforylering, och hämmare av dessa enzymer antagoniserade den CD-extraktmedierade potentieringen av benmineralisering, vilket tyder på att ERK-, p38- och JNK-aktivering spelar en obligatorisk roll i CD-extraktinducerad benbildning genom att osteoblaster. Dessutom reducerade enzyminhibitorerna och dominant-negativa mutanter av ERK, p38 och JNK CD-extraktförstärkt ALP, BMP-2 och OPN-uttryck. Dessa data tyder på att aktivering av ERK-, p38- och JNK-vägarna krävs för ökningen av ALP, BMP-2 och OPN-uttryck och mognad orsakad av CD-extrakt i osteoblaster. ERK har rapporterats öka osteoblastproliferation och differentiering.[34,35] Vi upptäckte dock ingen effekt av CD-extrakt på osteoblastproliferation. Därför kan andra vägar ha motverkat ERK-effekten efter CD-extraktstimulering, eller vara nödvändiga för proliferation. I detta avseende har vi funnit att PI3K- och Akt-hämmare också minskar CD-extraktinducerad benmineralisering och ALP-, BMP--2- eller OPN-mRNA-uttryck (data visas inte). Därför kan dessa vägar krävas för CD-extraktinducerad benbildning.
NF-kB har visat sig kontrollera osteoblastfunktionen i ben.[37] Resultaten av denna studie visar att NF-kB-aktivering bidrar till CD-extraktinducerad benmineralisering och ALP, BMP-2 och OPN-uttryck i odlade osteoblaster och att hämmare av den NF-kB-beroende signalvägen (PDTC och TPCK) ) hämmade CD-extrakt-inducerad benmineralisering och ALP, BMP-2 och OPN-uttryck. p65 fosforyleras vid Ser536 av en mängd olika kinaser i flera signalvägar, vilket ökar p65-transaktiveringspotentialen.[38] Resultaten av denna studie visade att CD-extrakt ökade fosforyleringen av p65. Sammantaget tyder dessa resultat på att NF-kB-aktivering krävs för CD-extraktinducerad benbildning i odlade osteoblaster. Vi fann också att ERK-, p38- och JNK-hämmare omvände CD-extraktinducerad NF-kB-luciferasaktivitet (data visas inte), i överensstämmelse med att dessa enzymer är uppströmsmediatorer av CD-extraktinducerad NF-kB-aktivering. Därför inducerar CD-extrakt benbildning genom ERK/p38/JNK/- och NF-kB-vägarna.
Slutsatser
Denna studie visade att CD-extrakt inducerar osteoblastdifferentiering och mognad men inte proliferation eller migration. CD-extrakt ökade också uttrycket ALP, BMP-2 och OPN och benmineralisering. Vi visade att ERK-, p38-, JNK- och NF-kB-vägarna är involverade i CD-extraktmedierad benbildning och ALP, BMP-2 och OPN-uttryck. Dessutom förhindrade CD-extrakt in vivo benförlust inducerad av ovariektomi. Därför kan CD vara fördelaktigt för att stimulera benbildning vid behandling av osteoporotiska sjukdomar.
