Del 1: Acteosid undertrycker RANKL-medierad osteoklastogenes genom att hämma C-Fos-induktion och NF-KB-väg och dämpa ROS-produktion

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*

Abstrakt

Flera studier har rapporterat att inflammatoriska cytokiner är viktiga mediatorer för osteoklastogenes, vilket orsakar överdriven benresorption och osteoporos.Acteosid från cistanche ört, den huvudsakliga aktiva föreningen i Rehmannia glutinosa, som används flitigt i traditionell orientalisk medicin, har antiinflammatoriska och antioxidanta potentialer. I den här studien fann vi detakteosidinhiberade markant osteoklastdifferentiering och bildning från benmärgsmakrofager (BMM) och RAW264.7 makrofager stimulerade av receptoraktivatorn av nukleär faktor-kappaB (NF-kB) ligand (RANKL).Akteosidförbehandling förhindrade också benresorption av mogna osteoklaster på ett dosberoende sätt. Acteosid (10 mM) försvagade RANKL-stimulerad aktivering av p38-kinas, extracellulära signalreglerade kinaser och c-Jun N-terminalt kinas, och undertryckte även NF-kB-aktivering genom att hämma fosforylering av p65-subenheten och hämmaren kBa. Dessutom RANKL-medierade ökningar i uttrycket av c-Fos och nukleär faktor av aktiverade T-celler, cytoplasma 1 (NFATc1), och i produktionen av tumörnekrosfaktor-a, interleukin (IL)-1b , och IL-6 uppenbarligen hämmades av akteosidförbehandling. Vidare muntligtakteosidminskad ovariektomi-inducerad benförlust och inflammatorisk cytokinproduktion för att kontrollera nivåerna. Våra data tyder på att acteosid hämmar osteoklastdifferentiering och mognad från osteoklastiska prekursorer genom att undertrycka RANKL-inducerad aktivering av mitogenaktiverade proteinkinaser och transkriptionsfaktorer som NF-kB, c-Fos och NFATc1. Sammantaget tyder dessa resultat på att acteosid kan fungera som ett anti-resorptivt medel för att minska benförlust genom att blockera osteoklastaktivering.

cistanche akteosid

Introduktion

Ben ombildas ständigt av balanserad osteoklast- och osteoblastaktivitet [1]. Osteoklaster uppstår från hematopoetiska prekursorceller från monocyt/makrofaglinjen, medan osteoblaster är av mesenkymal linje [2]. Onormal osteoklastaktivering eller minskad osteoblastogenes kan störa benhomeostasen och så småningom orsaka sjukdomar som osteoporos, artrit och skelettcancer [3,4]. Osteoporos är en vanlig skelettsjukdom som leder till ökad risk för frakturer. Den vanligaste formen av osteoporos orsakas av östrogenbrist hos kvinnor i klimakteriet. Läkemedel som kortikosteroider och antiepileptika kan också orsaka obalans mellan benresorption och bildning, vilket kan resultera i osteoporos [5].

Många anti-resorptiva inhibitorer inklusive bisfosfonater, kalcitonin, östrogen och selektiva östrogenreceptormodulatorer har använts för att behandla osteoporos. Dessa hämmare upprätthåller benmassan genom att hämma osteoklastfunktionen [6]. Östrogenersättningsterapi är den mest populära behandlingen för att förebygga och behandla postmenopausal osteoporos. Långvarig östrogenersättningsterapi kan dock öka risken för endometrie- och bröstcancer. Därför har många utredare fokuserat sina ansträngningar på att utveckla ett nytt anti-resorptivt medel som inte har biverkningar [7–10]. Eftersom osteoklaster fungerar vid benresorption, har specifikt hämmande osteoklaster ansetts vara huvudmålet i många studier.

Osteoklaster är multinukleära jätteceller som bildas av mononukleära progenitorer av monocyt/makrofagerfamiljen via sekventiell proliferation, differentiering och fusion av hematopoetiska prekursorceller [11]. Makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) och receptoraktivator av nukleär faktor (NF)-kB (RANK) ligand (RANKL) är väsentliga faktorer för osteoklastdifferentiering [12]. Dessutom bidrar flera inflammatoriska cytokiner, såsom tumörnekrosfaktor (TNF) och interleukin (IL)-1b, till osteoklastogenes genom att modulera induktionen av RANKL, osteoprotegerin och M-CSF [7,13]. RANKL-bindning till cellytans RANK-receptor resulterar i RANKL/RANK/TNFR-associerade faktorer (TRAF)-komplex som sekventiellt aktiverar NF-kB och mitogenaktiverade proteinkinaser (MAPKs), inklusive c-Jun N-terminalt kinas (JNK), p38 kinas och extracellulärt signalrelaterat kinas (ERK) [14]. Denna aktivering spelar en nyckelroll för att förmedla osteoklastdifferentiering, aktivering och överlevnad. RANKL aktiverar också uttrycket av transkriptionsfaktorer såsom en nukleär faktor av aktiverade T-celler, cytoplasmatisk 1 (NFATc1) och c-Fos, som är väsentliga för osteoklastutveckling [7,9]. Därför anses RANKL-signalering vara det huvudsakliga målet för anti-resorptiva medel som undertrycker osteoklastaktivering och benförlust.

Akteosidär den huvudsakliga aktiva substansen i Rehmannia glutinosa, som används flitigt inom traditionell orientalisk medicin [15,16]. Acteosid är en stark antioxidant och har antihepatotoxiska, antiinflammatoriska och antinociceptiva aktiviteter [17–20]. Vi har tidigare funnit att akteosid minskar tyrosinasaktivitet och melaninbiosyntes genom att reglera ERK-signalering [21], skyddar mot reaktiva syrearter (ROS)-medierad tandköttsskada [22], och undertrycker mykotoxin-medierad cellskada [23]. Dessa effekter är nära relaterade till nukleosiders förmåga att ta bort ROS och reglera MAPK-medierad signalering. I synnerhet föreslås ROS för att förmedla RANKL-inducerade signalvägar och cellulära händelser i osteoklaster. Förbehandling med antioxidanter hämmade RANKL-inducerad aktivering av NF-kB, ERK och IkBa, vilket undertryckte osteoklastogenes [24]. Dessa fynd tydde starkt på att, förutom antiinflammatorisk aktivitet, antioxidantaktivitet är avgörande för ett anti-resorptivt medel, sålunda kan acteosid undertrycka RANKL-inducerad osteoklastogenes.

I den aktuella studien undersökte vi om akteosid har en terapeutisk effekt på benförlust. Vi undersökte effekterna av akteosid på osteoklastdifferentiering och benresorption och de relaterade cellulära mekanismerna med hjälp av in vitro och in vivo experimentella system.

Cistanche acteosid undertrycker RANKL-inducerad osteoklastogenes

Material och metoder

Etikförklaring

Djurvård och användningsmetoder godkändes av Chonbuk National University Committee on Ethics in the Care and Use of Laboratory Animals (tillståndsnummer CBU 2010-0007). Alla experiment i denna studie utfördes enligt riktlinjerna från kommittén för djurvård och användning vid universitetet.

Möss, kemikalier och laboratorieartiklar

Fyra veckor gamla ICR-honmöss köptes från Orient Bio Inc. (Seoul, Korea) och hölls vid 2261uC och 5565 procent luftfuktighet i en 12 timmars ljus/mörkercykel med fri tillgång till mat och vatten. Akteosid (3,4-dihydroxi-bfenetyl-Oa-rhamnopyranosyl-(1R3)-4-O-caffeoyl-bD-glukopyranosid; C29H36O15) (Fig. S1) isolerades från bladen av Rehmannia glutinosa. Akteosid löstes i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) före användning. RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 och M-CSF köptes från R & D Systems (Minneapolis, MN, USA). Antikroppar specifika mot c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa och b-aktin erhölls från Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA ). Antikroppar för p-p38 och p38 köptes från Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Calcium Assay och Osteocalcin (OC) EIA-kit köptes från BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) respektive Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA), för att bestämma biokemiska serumparametrar. Mustartratresistent surt fosfatas (TRAP) analyskit (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA) användes också för att mäta TRAP5b-nivån i serum. Om inget annat anges erhölls ytterligare kemikalier från Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), och laboratorievaror var från SPL Life Sciences (Pochun, Sydkorea).

Cellkulturer

Benmärgsceller erhölls från tibiae och femora av 6 veckor gamla hona ICR-möss enligt metoder som beskrivits tidigare [25]. Benmärgssuspensionen inkuberades i en 100-mm odlingsskål i närvaro av 50 ng/ml M-CSF. Efter 3 dagar användes vidhäftande celler som benmärgsmakrofager (BMM) för att inducera osteoklastisk differentiering. Vissa benmärgsceller inkuberades också i 48 timmar utan M-CSF, och vidhäftande celler odlades i ett osteoblastdifferentieringsmedium, som beskrivits på annat håll [25]. RAW264.7 makrofagceller odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin och antibiotika. Dessa celler användes som en motsvarig cellinje för BMM för att utforska effekten av akteosid på osteoklastogenes.

Osteoklastisk differentiering och TRAP-färgning

BMM förbehandlades med olika koncentrationer (0–50 mM) avakteosidi 2 timmar innan stimulering med 100 ng/ml RANKL. Odlingsmediet ersattes med färskt medium dag 2 och 5. Efter 7 dagars inkubation fixerades odlingarna i 4 procent PBS-buffrad paraformaldehyd och färgades med TRAP med användning av ett Sigma Aldrich-kit enligt tillverkarens instruktioner. TRAP-positiva celler räknades med hjälp av optisk mikroskopi, och celler som innehöll 3 eller fler kärnor ansågs vara osteoklaster. RAW 264.7-celler exponerades också för 100 ng/ml RANKL efter förbehandling med akteosid i 2 timmar, och efter 7 dagars inkubation bearbetades cellerna för TRAP-färgning.

Mätning av cellviabilitet

Cellviabiliteten bestämdes med användning av vattenlösligt tetrazoliumsalt (WST)-8-reagens. Kortfattat behandlades BMM eller RAW264.7-celler odlade i ett tillväxtmedium innehållande 10 procent FBS och antibiotika med 10 mM akteosid eller en fenolisk förening såsom quercetin, luteolin, apigenin eller epigallocatechin-3-gallat (EGCG). WST-8-reagens tillsattes i kulturerna efter 48 timmars inkubation. Efter inkubation i ytterligare 4 timmar mättes den WST-8--specifika absorbansen vid 450 nm med användning av en mikroplattläsare (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA).

Benresorptionsanalys

BMM (16105 celler/ml) suspenderades i a-MEM innehållande 50 ng/ml M-CSF och 100 ng/ml RANKL, och delades sedan över en 24-brunnsplatta belagd med kalciumfosfatnanokristaller (OAAS{{6} }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Sydkorea) vid en densitet av 26104 celler/cm2 med och utan akteosid. Efter inkubering i 7 dagar avlägsnades cellerna från plattorna med 5% natriumhypoklorit, och gropbildning observerades under ett optiskt mikroskop. Det resorberade området mättes också med en bildanalysator och uttrycktes som en procentandel av kontrollvärdet.

Western blot-analys

Hela proteinlysat framställdes i en lysbuffert som beskrivs på annat håll [26]. Cytosoliska och nukleära proteiner framställdes som beskrivits tidigare [25]. Lika mängder proteinextrakt separerades med 12–15 procent SDS-PAGE och blottades på polyvinyldifluoridmembran. Blotarna undersöktes med primära antikroppar över natten vid 4uC före inkubering med sekundär antikropp i blockerande buffert under 1 timme. Plumparna var

utvecklad med förbättrad kemiluminescens (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, Storbritannien) och exponerad för röntgenfilm (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA).

MAPK-aktivitetsanalys

Celler förbehandlades medakteosidi 2 timmar och stimuleras sedan med RANKL i ytterligare -30 min. MAPK-aktiviteter bestämdes med användning av immunometriska analyskit, såsom p-p38 kinasanalyskit (Assay Designs, Inc., MI, USA), p-ERK enzymanalyskit (assaydesign) och p-SAPK/JNK sandwich ELISA kit (Cell Signaling Technology, MA, USA). Alla procedurer följde tillverkarens instruktioner och absorbansen mättes med en mikroplattläsare.

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

DNA-proteinbindningsreaktioner utfördes under 3 0 min vid rumstemperatur, med 10–15 mg protein i 20 ml buffert innehållande 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml poly (dI-dC), 5 procent glycerol 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 30, 000 cpm av [a-32P] dCTP-märkta oligonukleotider och Klenow-fragmentet av DNA-polymeras. Proverna separerades på 6 procent polyakrylamidgeler, som torkades och exponerades för röntgenfilm (Eastman Kodak Co.) i 12–24 timmar vid 270uC. Oligonukleotidprimersekvenserna specifika för NF-kB var 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTG GCC TGG A-39 och 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGG ACC GGA CCT GGA A -59.

NF-kB Luciferasanalys

RAW264.7-makrofager i 24-brunnsplattor transfekterades med 0,8 mg kB-luciferasreportervektor med användning av 2 ml Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Vid 24 timmar efter transfektion stimulerades cellerna med RANKL i närvaro och frånvaro av akteosid under 24 timmar. Celler återsuspenderades i 100 ml reporterlysbuffert

(Promega, Madison, WI, USA). Lika mängder proteinprov placerades i 96-brunnsmikroplattor och blandades med luciferassubstrat. Luminescens mättes med användning av en mikroplatta-luminometer (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland). I detta experiment användes en permeabel NF-kB-inhibitorpeptid (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA) som en positiv kB-inhibitor.

Mätning av cytokiner

BMM eller RAW264.7-celler stimulerades med RANKL i närvaro av akteosid i 24-brunnsodlingsplattor. Efter 48 timmars inkubation samlades odlingssupernatanter upp och bedömdes med ELISA med användning av TNF-a-, IL-1b- och IL-6-specifika OptEIATM-kit enligt tillverkarens instruktioner.

Realtid omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR)

mRNA-uttrycket av osteoklastiska markörer, såsom c-Fos, NFATc1 och TNF-a, bestämdes med realtids-RT-PCR. I korthet extraherades totalt RNA från makrofager med Trizol-reagens enligt tillverkarens instruktioner (Invitrogen). cDNA syntetiserades med 1 mg totalt RNA med användning av SuperScript omvänt transkriptas II och primrar (Invitrogen). Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) användes för att detektera ackumulering av PCR-produkt under cykling med ABI 7500 sekvensdetektionssystem (Applied Biosystems). Efter denaturering vid 95uC under 10 minuter var PCR

utförs med fyrtio 3-stegscykler av denaturering vid 95uC i 15 sekunder, hybridisering vid 60uC i 1 sekund och förlängning vid 72uC i 30 sekunder. Alla PCR-reaktioner utfördes åtminstone i tre exemplar, och expressionsnivåerna normaliserades till hushållsgenen HPRT i samma reaktion. Denna studie använde samma primersekvenser som beskrivs på annat håll [7].

Mätning av intracellulär ROS

En stamlösning av 29,79-diklordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Tyskland) framställdes i DMSO och lagrades vid 220uC i mörker. I korthet odlades BMM (106 celler/ml i 6-brunnsplattor) med 50 ng/ml M-CSF i 24 timmar och behandlades sedan med olika koncentrationer (0–10 mM) avakteosid2 timmar före stimulering med 100 ng/ml RANKL. Efter 1 timmes saminkubation inkuberades dessa celler därefter med 25 mM DCFH-DA under 30 minuter. Den gröna fluorescensen av 29,79-diklorfluorescein (DCF) registrerades vid 515 nm (FL 1) med ett FACS VantageH-system (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) och 10,000 händelser räknades per prov.

Induktion av ovariektomi-inducerad osteoporos

ICR-honmöss (6 veckor gamla) användes för denna studie. Möss fick en skenoperation (Sham, n =10) eller kirurgisk ovariektomi (OVX, n=20) under anestesi. En vecka efter operationen delades OVX-mössen slumpmässigt in i 2 grupper om 10 möss vardera: bilateral OVX och bilateral OVX kompletterad med 200 ml

PBS innehållande 1 mM akteosid oralt (AC-grupp). Oral akteosid administrerades en gång var tredje dag i 8 veckor efter operationen, och

samma mängd PBS administrerades till Sham- och OVX-grupperna. Efter 1 dag efter den senaste administreringen avlivades mössen och sedan analyserades biokemiska parametrar i serum och 3-dimensionell benstruktur.

Bestämning av biokemiska parametrar i serum

Blodprover uppsamlades via hjärtpunktion och serum uppsamlades genom centrifugering. Serumprover lagrades vid 280uC för analyser av biokemiska parametrar. Serumnivåerna av IL-1b och IL-6 uppskattades genom att använda ELISA-kitet enligt beskrivningen ovan, medan aktiviteten av alkaliskt fosfatas (ALP) bestämdes genom att använda en biokemisk kolorimetrisk analys som mäter mängden p -nitrofenol framställd från ett p-nitrofenolfosfatsubstrat, som beskrivs på annat håll [27]. För att uppskatta biomarkörerna för benbildning och resorption bestämdes även serum OC, kalcium och TRAP5b nivåer enligt tillverkarens instruktioner.

Analyser av benstruktur och morfometriska parametrar

Lårbenet hos möss (Sham-, OVX- och AC-grupper) dissekerades och fylldes med fysiologisk saltlösning för mekanisk testning. Den mekaniska styrkan hos lårbenet mättes enligt beskrivning på annat ställe [28]. Frakturbelastningen registrerades som toppkraften i newton vid den punkt som mittskaftet av höger lårbensfraktur. Dessutom analyserades det lätta lårbenet hos varje djur histomorfometriskt med användning av ett mikrodatortomografisystem (mikro-CT) (SkyScan 1076 mikrofokusröntgensystem, Kontich, Belgien). Kort sagt, benen i 4 procents formaldehydlagring torkades ytligt på pappersväv innan de lindades in i plastfilm eller parafilm för att förhindra uttorkning under skanning. Varje plastförpackat ben placerades i plast/polystyrenskumrör som monterades vertikalt horisontellt i 1076 skannerprovkammaren för

mikro-CT-avbildning. Scanning utfördes med användning av 100 kV källspänning och 140 mA källström med 35 mm upplösning.

Tredimensionella modeller av lårbenets trabekulära ben rekonstruerades med SkyScan CT Analyzer version 1.11. De strukturella parametrarna som trabekulär benmineraldensitet (BMD, g/cm3), procent benvolym (benvolym (BV)/vävnadsvolym (TV), procent ), tjocklek (Tb.Th, mm), separation (Tb.Sp) , mm) och antal (Tb.N, 1/mm) mättes sedan.

Osteogen differentierings- och mineraliseringsanalys Benmärgsceller odlade i {{{{10}}}}brunnsodlingsplattor behandlades med DAG (10 nM dexametason, 50 mM askorbinsyra och 20 mM b-glycerofosfat) i närvaro av 10 mM akteosid. Efter 2 veckors differentiering fixerades cellerna med iskall 70 procent (vol/vol) etanol under 1 timme och färgades med 0,2 procent alizarin rött S i destillerat vatten under 30 minuter vid rumstemperatur. Efter att cellerna avfärgats och lufttorkades utvärderades cellodlingsplattorna med ljusmikroskopi med användning av ett inverterat mikroskop (Nikon TS100, Japan). För att kvantifiera mängden rött färgämne eluerades fläcken med 10 procent acetylpyridiniumklorid genom skakning under 20 minuter och absorbansen mättes vid 560 nm. Mängden kalcium avsatt i cellskikten mättes också med användning av ett Calcium C-kit (Wako Chemical Inc. Osaka, Japan) enligt tillverkarens instruktioner. Dessutom bestämdes uttrycket av benspecifika mRNA-markörer, såsom runt-relaterad transkriptionsfaktor-2 (Runx2), osterix, bensialoprotein (BSP) och OC genom realtids-RT-PCR. Oligonukleotidprimrar för dessa markörer designades med produktstorlekar mindre än 200 bp med Primer Express Software 3.0 (Applied Biosystems) som beskrivs på annat håll [27].

cistanche acteosid ökar benbildningen

Resultat

Akteosid hämmar osteoklastbildning av makrofager på ett dosberoende sätt

För att verifiera effekten av akteosid på BMM-differentiering till osteoklaster odlades cellerna med olika koncentrationer (0–20 mM) av akteosid i 7 dagar i närvaro av 50 ng/ml M-CSF och 100 ng/ml RANKL. Akteosid minskade antalet osteoklaster på ett dosberoende sätt. När cellerna förbehandlades med 10 mM akteosid under 2 timmar, minskade osteoklastantalet med 43 procent jämfört med celler kompletterade med M-CSF och RANKL (Fig. 1A). Fig. IB visar den RANKL-medierade osteoklastdifferentieringen och dess inhibering genom kombinerad behandling med akteosid. I enlighet med detta resultat minskade akteosidförbehandling den RANKL-stimulerade differentieringen av RAW264.7-celler och osteoklastbildning (fig. 1C och D). När den antiosteoklastiska potentialen för akteosid på BMM jämfördes med antiosteoklastpotentialen för flera fenoliska föreningar vid samma koncentration (10 mM), visade luteolin den högsta aktiviteten (Fig. 2A). Luteolin, quercetin eller apigenin i sig minskade emellertid cellernas livsduglighet (Fig. 2B). Alla föreningarna hämmade osteoklastisk differentiering av RAW264.7-makrofager med följande relativa aktiviteter: luteolin. quercetin=apigenin .

310bb742834b96757ffeffe92b86828