Cistanche Deserticola-polysackarider har en neuroprotektiv effekt

för mer information:Ali.ma@wecistanche.com

Yue Liu, et al

Abstrakt:

Ischemi stroke är en sjukdom med hög morbiditet och dödlighet.Cistanchedeserticolapolysackarider(CDP) har ett brett utbud av fördelaktiga effekter, inklusive leverskydd och immunhomeostas. Så vitt vi vet, den skyddande effekten av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)på neuroner skadade av syre-glukosbrist/reperfusion (OGD/RP) har inte undersökts. I denna studie skadade OGD/RP en PC12-cellmodell. Kortfattat, CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)({{0}}.05, 0.5 och 5 ug/ml) administrerades före reperfusion. Den skyddande effekten av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)utvärderades sedan på basis av cellviabilitet, läckage av laktatdehydrogenas (LDH), [Ca2 plus] I, mitokondriell membranpotential (MMP) och cellapoptos, andedoxstatus efter reperfusion utvärderades genom att analysera reaktiva syrearter (ROS), katalas ( CAT), glutationperoxidas (GSH-Px) och total antioxidantkapacitet. Baserat på det faktum att Parkinsons sjukdom-associerat protein DJ-1 deltar i endogen antioxidation och utförneuroprotektivaeffekter efter ischemiastroke undersökte vi interaktionen mellan CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)och DJ{{0}}. DJ-1-uttryck detekterades genom ELISA och Western blot-analys, och translokationen av DJ-1 utvärderades genom immunfluorescens. Resultaten visade att CDP (0.05, 0.5 och 5 ug/ml) försvagade PC12-celldöd, bevarade MMP och kalciumhomeostas; hämmade oxidativ stress och minskad cellapoptos. Dessutom stimulerade CDP (5 ug/ml) markant DJ{10}-utsöndring och uttryck. Sammantaget antydde resultaten att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)utövar aneuroprotektivaeffekt mot OGD/RP-inducerad skada genom att hämma oxidativ stress och reglera DJ-1-vägen

Nyckelord:Cistanche deserticola, polysackarider, neuroprotektiv, syrebrist/reperfusion av glukos, oxidativ stressDJ-1

Klicka för att Cistanche UK produkter

1. Introduktion

Ischemisk stroke är den näst vanligaste dödsorsaken och den primära orsaken till långvarigt funktionshinder globalt [1]. Döden till följd av stroke förväntas stiga till 7,8 miljoner år 2030 [2]. I Kina dör 58 till 142 per 100000 människor i stroke varje år. Sålunda måste effektiva strategier som omvänd ischemi-reperfusionsskada utvecklas. Omfattande bevis stöder att oxidativ stress är en viktig faktor som främjar utvecklingen och progressionen av hjärninfarkt under reperfusion[3,4]. Därför upptäcker effektivneuroprotektivamedel som kan minska ROS och undertrycka oxidativ stress har väckt stort intresse för forskning. Parkinsons sjukdom-associerat proteinDJ-1 förmedlar neuroskydd genom att stimulera anti-apoptotiskt och antioxidativt genuttryck [4,5]. DJ-1 kan translokeras till mitokondrierna genom oxidativ stress och mitogenstimulering och kan utsöndras till den extracellulära matrisen under patologiska tillstånd, såsom bröstcancer, melanom och OGD/RP-skada [6]. Dessutom är DJ-1 användbar vid terapeutisk inriktning för ischemisk neurodegeneration på grund av dess avgörande roll i antioxidation [4,7]. Under de senaste 10 åren har flera grupper bekräftat att DJ-1 harneuroprotektivaeffekter på in vivofokala cerebral ischemimodeller och in vitro OGD/RP-modeller [6–9]. Samtidigt upphäver vissa läkemedel, inklusive ciklosporin A och natriumfenylbutyrat, neuronal celldöd via DJ-1 uppreglering inischemi stroke [9,10 ].

Cistanchedeserticola, den integrerade torkade växten avCistanchedeserticolaYCMa och Cistanche tubulosa Wight, produceras huvudsakligen i ökenområdena i norra och nordvästra Kina [11]. C. deserticola är ätbar och har blivit hedrad som "öknarnas ginseng". I akupunktsrecept, används det som behandling för kronisk njursjukdom, sexuell impotens, kvinnlig infertilitet, leukorré, metrorragi och senil förstoppning [12].C. deserticola polysackarider, en viktig aktiv komponent isolerad frånCistanche deserticola. CDP, modulerar immunfunktion och lipidbalans och ger skydd mot åldrande, oxidation och leverskador. Dessutom CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)förhindrar ischemi-reperfusionsskada i hjärtat och levern [13,14]. Nyligen genomförda studier rapporterade att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)är icke-toxiska[12,15,16], och andra fytokemikalier extraherade från C. Deserticola, inklusive echinakosid, isoakteosid, acteosid och salidrosid, uppvisarneuroprotektivaeffekter [11,12]. Den potentiella användningen av CDP för förbättring av ischemisk strokeskada har dock inte rapporterats.

I den aktuella studien antar vi att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)hämmar oxidativ stress för neuroskydd. De potentiella skyddande effekterna av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)inischemi strokeskada undersöktes med användning av OGD/RP-skadade PC12-celler. Underliggande interaktioner associerade med DJ-1 undersöktes sedan.

2. Metoder

2.1. Cellodling och OGD/RP-modell

PC12-celler odlades i RPMI 1640-medium innehållande 10 procent FBS vid 37 grader i en normoxisk inkubator innehållande 5 procent CO2. Mediet byttes ut var 48:e timme. OGD/RP-modell framställdes. PC12-cellerna tvättades och exponerades för Earles balanserade saltlösning. Därefter överfördes cellerna till en anaerob kammare innehållande 5 procent CO2 och 95 procent N2 vid 37 grader i 4 timmar och fick sedan genomgå återsyresättning. Under detta steg tillsattes samma volym odlingsmedium till cellerna. Efter reoxygenering placerades cellerna på en normoxisk inkubator i 24 timmar.

2.2. Drogadministration

CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)köptes från Yuanye Biological Technology Co., Shanghai, Kina (C23J7Y18405, > 98 procent renhet). Nimodipin, ett förstahandsförebyggande läkemedel för ischemi stroke, användes som en positiv kontrollförening [17–19]. Nimodipininjektion kom från Bayer Company. Celler delades slumpmässigt in i sex grupper, nämligen kontrollen, vehikel (OGD/RP), Nimo (5 ug/ml), CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)(0.05 ug/ml), CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)(0,5 ug/ml) och CDP (5 ug/ml). Nimodipin och CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)tillsattes före reperfusion. Kontrollgruppen odlades i ett normalt medium och inkuberades under ett normoxiskt tillstånd.

2.3. Cellviabilitet: MTT- och NRU-analyser

PC12-celler (6 × 103 per brunn) såddes i en 96-brunnsodlingsplatta. Cellerna behandlades i enlighet med varje grupps krav. MTT (Solarbio, Kina) sattes till cellerna i en koncentration av 5 mg/ml och inkuberades i 4 timmar vid 37 grader. Formazan är reduktionsprodukten av succinatdehydrogenas i levande celler [20]. DMSO tillsattes för upplösning av genererat blått formazan. Absorbans vid en våglängd på 490 nm detekterades med Microplate Reader (Thermo, USA) efter att cellerna skakades i 10 minuter vid 25 grader. Cellviabilitetsresultat manifesterades som en procentandel av kontrollgruppen [21].

Neutral red uptake (NRU) analys utfördes enligt tidigare publicerat protokoll [22]. När reperfusionsperioderna var avslutade sattes neutralt rött (Solarbio, Kina) till cellerna i en koncentration av 5 0 ug/ml. Blandningen inkuberades under 3 timmar. Därefter tvättades cellerna snabbt av med en lösning innehållande 0,5 procent formaldehyd och 1 procent kalciumklorid. Cellerna sattes därefter till en blandning innehållande 1 procent etylsyra och 50 procent vattenfri etanol. Plattorna avlästes vid 540 nm absorbans efter att cellerna skakades i 20 minuter vid 37 grader. Resultaten av cellviabilitet manifesterades som en procentandel av kontrollgruppen.

Cistanche deserticola polysackariderha enNeuroskyddande effekt

2.4. Bedömning av cytotoxicitet

LDH är ett cytoplasmatiskt enzym som katalyserar oxidationen av laktattopyruvat. LDH släpps snabbt ut i den extracellulära vätskan när cellmembranet skadas. Därför utförs LDH-detektion vanligtvis för cytotoxicitetsutvärdering. [23]. Den experimentella proceduren följde kommersiella kit-instruktioner som tillhandahålls av LDH-analyskitet (Jiancheng, Kina). Absorbansen för varje prov detekterades vid 440 nm med en mikroplattläsare. Procent av celldöd beräknades med hjälp av följande formel: Viabilitet (procent)=(OD-behandling − ODT-behandlingsblank)/(OD Max LDH-aktivitet − OD Max LDH-aktivitet blank) × 100 procent.

2.5. Detektion av intracellulär Ca2 plus koncentration

Den intracellulära koncentrationen av Ca2 plus mättes med Fluo-3/AM [15]. PC12-cellerna tvättades med PBS tre gånger och inkuberades sedan med 2 μM Fluo -3/AM (Beyotime, Kina) i 30 minuter vid 37 grader i mörker. Cellerna tvättades sedan med PBS tre gånger för rensning av extracellulärt färgämne. Fluorescensintensiteten för Fluo-3/AM bestämdes på ett konfokalt lasermikroskop (Olympus, Japan). Mjukvarupaket Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer och ImageJ användes för beräkning av gråskalevärden

2.6. Mätning av MMP

JC-1 (5,5',6,6'-tetrakloro-1,1',3,3'-tetraetyl-imidakarbocyanin; Beyotime, Kina) är en bekväm spänningskänslig sond som vanligtvis används för färgning celler och utvärdera MMP [24]. PC12-cellerna tvättades två gånger med kall PBS och inkuberades sedan med en blandning innehållande 50 procent medium och 50 procent arbetsvätska under 15 minuter vid 37 grader i mörker. Sedan kasserades blandningen och ersattes med ett nytt medium. Röda och gröna fluorescensbilder togs genom laserskanningskonfokalmikroskopi. Den relativa andelen röda och gröna fluorescenssignaler användes för MMP-mätning [25]. ProgramvarupaketOlympus FV10-ASW 4.1 Viewer och ImageJ användes för beräkning av gråskalevärden.

2.7. Apoptosdetektionsanalys, Hoechest33342 och flödescytometrianalys

Hoechst33342, ett DNA-bindande färgämne, användes för undersökning av cellapoptos [26]. Efter reperfusion tvättades PC12-cellerna med PBS tre gånger och inkuberades med Hoechst33342 (Beyotime, Kina) i en koncentration av 5 ug/ml under 15 minuter vid 37 grader i mörker. Sedan observerades cellerna under ett konfokalt lasermikroskop. Theapoptotiska celler uppvisade intensiv blå fluorescens och kärnkondensation. För varje färgningsexperiment infångades tre slumpmässiga fält och kvantifierades. Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer och ImageJ användes för beräkning av gråskalevärden. Procentandelen av de apoptotiska cellerna beräknades genom följande formel: apoptotisk mängd/total mängd × 100 procent [27].

2.8. Mätning av ROS-generering

Den fluorescerande sonden 2',7'-diklorfluoresceindiacetat (DCFH-DA; Jiancheng, Kina) kan penetrera cellmembran och kan hydrolyseras till icke-fluorescerande DCFH. DCFH oxideras av intracellulär ROS till fluorescerande DCF [29]. Efter reperfusion tvättades cellerna två gånger med PBS och inkuberades sedan med DCFH-DA vid en slutlig koncentration av 10 μM i 45 minuter vid 37 grader i mörker. Fluorescens observerades med en fluorescensspektrofotometer med en excitationsvåglängd på 485 nm och en emissionsvåglängd på 535 nm.

Cistanche deserticola polysackariderha enNeuroskyddande effekt

2.9. Bestämning av oxidativ stressindikatorer: CAT-, GSH-Px- och T-AOC-nivåer

Cellerna skrapades och återsuspenderades i PBS. De erhållna cellsuspensionerna sonikerades 45 gånger på is och centrifugerades vid 1000 r/min under 10 min vid 4 grader. Supernatanterna behölls och användes för detektion [24]. Det totala proteininnehållet i cellsupernatanten mättes med ett BCA-proteinanalysreagenskit (KeyGEN, Kina). Aktiviteten för CAT-, GSH-Px- och T-AOC-nivåer mättes enligt tillverkarens instruktioner (Jiancheng, Kina). Absorbansen för varje prov detekterades med en mikroplattläsare.

2.10. Mätning av extracellulär DJ-1-koncentration

PC12-celler (6 × 103 per brunn) såddes i 96-brunnsodlingsplattor. Efter reperfusion samlades cellsupernatanten upp och analyserades av DJ-1/PARK-7 ELISA Kit (Raybio, USA) ) enligt tillverkarens instruktioner [9]. Absorbansen för varje prov detekterades med Microplate Reader vid en dubbelvåglängd av 450 nm eller 540 nm.

2.11. Western blot-analys

Cellulära proteiner extraherades med iskall lyseringsbuffert enligt tillverkarens instruktioner (KeyGEN, Kina). Proteinkoncentrationen bestämdes med ett BCA-proteinanalysreagenskit. Lika mängder proteinlysat (20 ug) från varje grupp upplöstes i 12% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores och överfördes därefter till ett nitrocellulosamembran. Membranet inkuberades med PBS innehållande 5 procent skummjölk i 2 timmar vid rumstemperatur och undersöktes sedan med anti-PARK7/DJ-1 antikroppar (ab76008, Abcam; spädning 1:1000) över natten vid 4 grader. Därefter tvättades membranet tre gånger med PBST och inkuberades med sekundär antikropp get-anti-kanin-IgG (SA00001-2, Proteintech Group; spädning 1:5000) vid rumstemperatur under 2 timmar. Antikroppsanti- -Tubulin(10759-1-AP, Proteintech Group; spädning 1:1000) ansågs vara kontroll. Proteinband visualiserades med förstärkt kemiluminescens (ECL) reaktionsreagens. Banddensiteter mättes med QuantityOne Analysis programvara v.4.6.9.

2.12. Immuncytokemianalys

PC12-cellerna fixerades i 4 procent paraformaldehyd i 15 minuter vid rumstemperatur efter reperfusionsbehandlingen [9]. Efter att överskott av paraformaldehyd avlägsnats, inkuberades cellerna i PBS innehållande 0,3 procent Triton X-100 under 10 minuter vid rumstemperatur. Därefter tvättades cellerna med PBS tre gånger innan de inkuberades med 5 procent normalt getserum under 1 timme. Cellerna inkuberades sedan med monoklonal anti-ATP-syntaskedja från kaninmus (MABS1304, EMD Millipore, spädning 1:200) för färgning av mitokondrier och inkuberades därefter med anti-PARK7/DJ-1-antikropp (spädning 1: 100) för sondering av protein DJ-1. Cellerna tvättades och inkuberades med get anti-kanin IgG-Alexa 488 (grön; A11034, Invitrogen; spädning 1:1000) och get anti-mus IgG-Alexa 594 (röd; A11032; Invitrogen; spädning 1:1000) för 90000 min. Slutligen tvättades cellerna tre gånger med PBS och monterades på objektglas med ett monteringsmedium innehållande DAPI. Immunofluorescerande bilder visualiserades med användning av ett konfokalt lasermikroskop.

Cistanche deserticola polysackariderha enNeuroskyddande effekt

2.13. Data/statistisk analys

Alla värden visades som medelvärde ± SD. Signifikans bestämdes genom en enkelriktad variansanalys (ANOVA), följt av Dunnetts multi-jämförelsetest. p < .05="" ansågs="" vara="" statistisk="" signifikans.="" experimentella="" data="" analyserades="" med="" hjälp="" av="" spss="" 17.0="" statistisk="">

3. Resultat

3.1. CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)hämmade OGD/RP-inducerad cellskada

PC12-cellerna exponerade för OGD/RP uppvisade en signifikant minskning i antal. Cellformen ändrades och cellmembranet bröts. I MTT-analysen, cellviabiliteterna i CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)grupper ({{0}},05, 0,5 och 5 ug/ml) var 58,91 procent ± 5,40 procent, 61,13 procent ± 3,81 procent respektive 68,57 procent ± 3,24 procent, p < 0,05="" (fig.="" 1a)="" ,="" och="" det="" med="" fordon="" hade="" 51,68="" procent="" ±="" 3,89="" procent.="" dessa="" värden="" indikerade="" att="">(Cistanchedeserticolapolysackarider)skyddade cellerna mot OGD/RP-skada och minskade celldöd. Vidare var cellviabiliteten i Nimo-gruppen 77,02 procent ± 5,22 procent, vilket är nästan lika med det i 5 ug/ml CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)behandlad grupp.

I NRU-analysen, cellviabiliteterna i CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)grupper ({{0}},05, 0,5 och 5 ug/ml) var 52,03 procent ± 4,72 procent, 58,49 procent ± 2,50 procent respektive 69,17 procent ± 3,91 procent (Fig. 1B) och att med fordon hade 47,14 procent ± 2,88 procent. Värdena indikerade den koncentrationsberoende skyddseffekten av CDP.

I motsats till en vehikel (44,73 procent ± 3,30 procent), reducerades LDH-frisättningen signifikant i CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)grupper. I CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)grupper ({{0}},05, 0,5 och 5 ug/ml), LDH-läckagehastigheter var 32,41 procent ± 3,70 procent, 27,13 ± 2,79 procent respektive 23,13 procent ± 4,59 procent, p < 0,01="" (fig.="" ic).="" dessutom="" var="" ldh-läckagehastigheten="" i="" nimo-gruppen="" 21,99="" procent="" ±="" 4,02="" procent,="" vilket="" var="" nästan="" lika="" med="" det="" i="" den="" 5="" ug/ml="" cdp-behandlade="">

3.2. CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)försvagad OGD/RP-inducerad ökning av [Ca2 plus]i

De intracellulära Ca2 plus-nivåerna i PC12-cellerna ökade till 4146,60 ± 195,97 efter OGD/RP-skada i motsats till kontrollgruppen (373,62 ± 75,69). CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)grupper ({{0}},05, 0,5 och 5 ug/ml) kan dosberoende minska den intracellulära Ca2 plus-nivån till 2921,25 ± 222,19, 2015,85 ± 230,53 och 1768,43 ± 426,12 respektive Cig. ). Dessutom minskade Ca2 plus-nivån i den 5 ug/ml CDP-behandlade gruppen till en nivå som var jämförbar med den i Nimo-gruppen (1591,19 ± 213,21).

3.3. CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)försvagad OGD/RP-inducerad avledning av MMP

Jämfört med kontrollgruppen (1,67 ± 0.89), uppvisade vehikelgruppen (0.48 ± 0.10) mer grön FL-fluorescens än röd FL fluorescens (Fig. 2B och D). Förhållandena mellan röd och grön FL-fluorescens minskade till 1,11 ± 0,26 och 1,18 ± 0,16 i 0,5 och 5 ug/ml CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)behandlade grupper, p < 0,01.="" grön="" fl-fluorescens="" minskade="">

3.4. CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)förhindrade OGD/RP-inducerad cellapoptos

Celler som uppvisar kondenserade kromatiner eller fragmenterade kärnor poängsattes som apoptotiska celler [30]. Hoechst33342 analysresultat avslöjade utseendet av kondenserade kärnor efter OGD/RP (Fig. 3A och C). En hög FL-fluorescensintensitet observerades i kärnorna i vehikelgruppen. FL-fluorescensintensiteten för kärnor försvagades i 5 ug/ml CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)behandlad grupp. Vi analyserade apoptotisk hastighet i PC12-cellerna genom andra cytometri med FITC-Annexin V/PI dubbelfärgning (Fig. 3B och D). Kontrollgruppen hade en cellapoptotisk frekvens på 4,16 procent ± 0,24 procent, medan vehikelgruppen hade 22,98 procent ± 0,66 procent. I den 5 ug/ml CDP-behandlade gruppen var cellapoptosfrekvensen 7,86 procent ± 1,16 procent.

3.5. CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)försvagad OGD/RP-inducerad intracellulär ROS-ackumulering och bevarad redoxstatus

Effekterna av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)på oxidativ stress demonstrerades på basis av ROS-generering, GSH-Px, CAT-aktiviteter och T-AOC-nivåer. ROS-nivåerna i OGD/RP-skadade PC12-celler ökade och blev signifikant högre än i kontrollgruppen (p < 0,01).="" samtidigt="" är="" ros-nivåerna="" i="">(Cistanchedeserticolapolysackarider)grupper ({{0}},05, 0,5 och 5 ug/ml) minskade på ett dosberoende sätt (p < 0,01;="" fig.="" 4a).="" vidare="" ökade="" cdp="" också="" signifikant="" t-aoc="" (p="">< 0,05;="" fig.="" 4b),="" cat="" (p="">< 0,05;="" fig.="" 4c)="" och="" gsh-px="" (p="">< 0,05;="" fig.="" 4d)="" jämfört="" med="" vehikel="" grupp.="" aktiviteten="" hos="" endogena="" antioxidanter="" i="">(Cistanchedeserticolapolysackarider)grupper ökade.

3.6. CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)stimulerade utsöndringen av DJ-1 och förbättrade DJ:s uttryck-1

DJ-1-koncentrationsförändringar i cellsupernatanten upptäcktes och avslöjade det möjliga sambandet mellan DJ-1 och CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider). DJ-1-frisättning observerades från OGD/RP-skadade PC12-celler (Fig. 5). DJ-1 var avsevärt uppreglerad i 5 ug/ml CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)-behandlade gruppen (38,66 ± 8,44 pg/ml) och ökade signifikant än i vehikelgruppen (18,33 ± 3,80 pg/ml, p < 0,01) och kontrollgruppen (9,67 ± 3,96 pg/ml, p < 0,01) .

För att undersöka effekterna av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)på det intracellulära uttrycket av DJ-1 mätte vi DJ-1-proteinnivåerna med Western blotting. DJ-1 proteinuttrycksnivåer ökade signifikant 24 timmar efter reperfusion. Däremot ökade 5 ug/ml CDP-efterbehandlingen signifikant överuttrycket av DJ-1 jämfört med vehikelgruppen (p < 0,01,="" fig.="">

3.7. CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)förbättrad DJ-1-translokation till mitokondrierna

PC12-cellerna färgades med anti-PARK7/DJ-1- och anti-ATP-syntas-kedjeantikroppar (fig. 7 och 8). Anti-ATP-syntas-kedja-antikroppen länkar till mitokondriellt komplex I, och det bindande antigenet var lokaliserat i mitokondriernas inre membran. Resultaten visade att DJ-1 förflyttades till mitokondriernas inre membran efter OGD/RP-förolämpning (Fig. 8). Under tiden visade DJ-1 och mitokondrier dubbelfärgning att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)underlättad DJ- 1 mitokondriell translokation och samlokalisering (Fig. 8). Dessa resultat indikerade direkt interaktion mellan DJ-1 ochneuroprotektivaeffekt av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)(Fig. 9).

4. Diskussion

I denna studie rapporterade vi från första hand att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)reducerar effektivt OGD/RP-inducerad PC12-cellskada via uppreglering av DJ-1-protein. CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)förbättrad cellviabilitet, minskad cellmembranskada, bibehållen intracellulär Ca2 plus homeostas, förhindrade MMP-förlust, minskad cellapoptos, undertryckt oxidativ stress, främjat uttryck av DJ-1 och förbättrad DJ-1-translokation till mitokondrierna. DJ-1 har nyligen varit inblandad i regleringen avneuroprotektivaeffekt och mitokondriell integritet. Dessa resultat gav övertygande bevis påneuroprotektivaeffekterna av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)mot ischemi. Dessutom spelar interaktionen mellan CDP och DJ-1 enneuroprotektivaroll i OGD/RP-inducerad PC12-cellskada. Ovanstående resultat kan utveckla vår förståelse för den gynnsamma effekten av CDP och kan ge användbar information för behandling av stroke i framtiden.

Ischemi stroke har tillskrivits en komplex serie av biokemiska och molekylära mekanismer, inklusive excitotoxicitet, kalciumöverbelastning och oxidativ stress [31]. OGD/RP används ofta som en in vitro-modell av ischemi-reperfusion och används för att utforska neurologiska och biokemiska förändringar. PC12-cellinjen är känslig för OGD/RP-skada [2]. Det uppvisar ett antal egenskaper och egenskaper hos sympatiska neuroner [32] och därmed allmänt använda neuronala cellinjer för forskning relaterad till mekanismerna för neurologisk skada på grund av stroke [33,34]. Flera studier har visat att oxidativ stress spelar en viktig roll vid stroke och hjärnischemiskador [35–37]. Parkinsons sjukdom-associerat protein DJ-1 kan hämma ischemisk neurodegeneration och beteendestörning genom att minska ROS-medierad neuronal skada [7]. Därför använde vi OGD/RP-skada PC12-cellmodellen för att undersökaneuroprotektivaeffekt av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider).

Graden av skada i PC12-celler inducerad av OGD/RP utvärderades med MTT-, NRU- och LDH-frisättningsanalyser. Administration av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)({{0}}.05, 0.5 och 5 ug/ml) förbättrade cellöverlevnad och minskade LDH-frisättning. De fördelaktiga effekterna av CDP-behandling inkluderade också en minskning av intracellulär kalciumöverbelastning och bevarande av MMP. Abnormaliteter av intracellulär Ca2 plus koncentration, särskilt mitokondriell kalciumöverbelastning, har kopplats till neuronal apoptos och död inducerad av ischemi stroke [38]. MMP kan återspegla effektiviteten hos elektrontransportkedjan och har indikerats som ett patologiskt störningsindex för detta system [39]. Både förhöjningar av intracellulär Ca2 plus-koncentration och MMP-förlust kan leda till destabilisering av neuronstrukturen och så småningom resultera i cellskador eller celldöd [21,40]. I denna studie visade resultaten att CDP signifikant hämmade den intracellulära Ca2 plus överbelastningen och ökade MMP-nivåer i OGD/RP-skada PC12-celler. Apoptos spelar en viktig roll i den komplexa patofysiologin av cerebral ischemi-reperfusionsskada. Ökande data tyder på att apoptos har varit inblandad i mitokondriell dysfunktion; försvinnandet av MMP är en tidig händelse som resulterar i cellapoptos [8,39]. Apoptos är en process av energiberoende programmerad celldöd för att göra sig av med överflödiga celler. Många neuroner i den ischemiska stroke kommer att genomgå apoptos [41]. I denna studie utförde vi Hoechst33342 och Annexin V-FITC/PI-färgning för att undersöka effekten av CDP på ​​apoptos [23,28]. Resultaten visade att CDP bibehåller kärnans integritet och minskar cellapoptoshastigheten. Alla dessa resultat indikerade att den anti-apoptotiska aktiviteten av CDP bidrog till den gynnsamma effekten vid neuronal skada i PC12-celler.

Celler som genomgår ischemiskador orsakade av överdriven ROS-ackumulering, vilket kan leda till lipidperoxidation, cellmembranskada, kalciumöverbelastning och mitokondriell dysfunktion, vilket i slutändan resulterar i cellapoptos och död [42]. Konsumtionen av endogena antioxidanter, såsom SOD, CAT och GSH-Px, indikerade också förekomsten. Fig. 9. Möjliga mekanismer för de skyddande effekterna av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)mot OGD/RP-inducerad PC12-cellskada. Behandling av CDP undertrycker oxidativ stress, stabiliserar Ca2 plus koncentration och MMP, förbättrar DJ-1 uttryck och lokalisering i mitokondrierna. Y. Liu et al. Biomedicine & Pharmacotherapy 99 (2018) 671–680 678av oxidativ stress under ischemi-reperfusion. I denna studie visade OGD/RP-gruppen en signifikant ökning av ROS och en minskning av CAT, GSH-Px och T-AOC jämfört med den 5 ug/ml CDP-behandlade gruppen. Vi observerade dock avsevärda minskningar av ROS-generering och konsumtion av endogena antioxidanter (CAT, GSH-Px och T-AOC) i CDP-grupperna. De fördelaktiga effekterna i 5 ug/ml CDP-gruppen var nära de i Nimo-gruppen. Resultaten antydde att CDP hämmar genereringen av ROS och återställer enzymatisk antioxidantförsvar.

DJ-1 är en nyckel redox-reaktivneuroprotektivaprotein inblandat i regleringen av oxidativ stress vid stroke. De fördelaktiga effekterna av DJ-1-överuttryck inkluderar cellöverlevnad från ischemi-reperfusion och bevarande av mitokondriell funktion och morfologi, såsom utfällning av mitokondriers permeabilitetsövergång poröppning [39,43]. Tidigare studier har visat att den skyddande effekten av DJ-1 i celler som exponeras för OGD/RP är relaterad till dess antioxidantegenskaper och mitokondriertranslokation [43–45]. DJ -1 utför effektivt endogent neuroskydd för att lindra mitokondriella defekter via translokation [46]. Flera studier har visat att DJ-1-translokation kan ha en effekt på mitokondriell rörelse, förbättra cell-cell-interaktion och främja andra cellpro-överlevnadsprocesser.

DJ-1 påverkar flera processer, såsom cellmigrering och vidhäftning, kemotaxi, proliferation och apoptos, i både in vitro- och in vivo-modeller [6,9,47,48]. Med hjälp av OGD/RP-skadade PC12-cellers strokemodell undersökte vi ett potentiellt samband mellan CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)och DJ-1. DJ- 1-överuttryck identifierades med ELISA och Western blotting. Tillsammans med denna funktion visade ett stort fynd i experimenten att det signifikanta överuttrycket av DJ-1 inträffade när CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)(5 ug/ml) administrerades före reperfusion. Detta antydde en evneuroprotektivaeffekt i förhållandet mellan CDP och DJ-1. Dessutom har vi observerat att DJ-1 belägen i mitokondrierna under förhållanden av OGD/RP och rikligt uttryck av DJ-1 minskade cellulär känslighet för ROS och hämmade oxidativ stress [45]. Resultaten antydde att CDP reglerar och förbättrar DJ-1, som fungerar som en molekylär länk mellan mitokondrierdysfunktion och oxidativ stress och ger en progression av sekundär celldöd som är inneboende i stroke [5,47,49–51]. Parallellt med stabilisering av DJ-1 i mitokondrierna, CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)behandling ökade cellöverlevnad, stabiliserade Ca2 plus homeostas, förbättrade MMP-avledning och förhindrar mitokondrierelaterad apoptos [43]. Sammantaget indikerade våra resultat att CDP utövar en romanneuroprotektivamekanism vid behandling av ischemisk stroke.

5. Sammanfattning

Våra resultat indikerade att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)skyddar PC12-celler mot OGD/RP-inducerade skador genom dess antioxidanteffekter, som delvis tillskrivs den DJ-1-medierade vägen. Dessa effekter inkluderar en minskning av frekvensen av cellmembranskada, bevarande av [Ca2 plus ]I-homeostas, förbättring av MMP-dissipation, hämning av cellapoptos, dämpning av intracellulär ROS och modulering av DJ-1-nivåer. Resultaten indikerade också att interaktionerna mellan CDP och DJ-1 förstärker neuroskydd och bibehåller mitokondriell integritet. Därför kan sårbara neuroner skyddas av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarider)via förbättringen av DJ-1 uttryck under ischemi stroke.

Erkännanden

Denna studie stöddes av National Natural Science Foundation of China (anslag 81360649), National Science and Technology Key Program (anslag 2015BAK45B01) och Ningxia Hui Autonomous Region Science and Technology Support Program (bidrag 2016BZ07).

Cistanche deserticola polysackariderha en Neuroskyddande effekt

Referenser

[1] HD Tsai, JS Wu, MH Kao, JJ Chen, GY Sun, WY Ong, TN Lin, Clinacanthus nutans skyddar kortikala neuroner mot hypoxiinducerad toxicitet genom att nedreglera HDAC1/6, Neuromol. Med. 18 (2016) 274–282.

[2] J. Zhao, R. Liu, Stroke 1-2-0: ett snabbt svarsprogram för stroke i Kina, Lancet Neurol. 16 (2017) 27–28.

[3] PM George, GK Steinberg, Novel stroke therapeutics: unraveling stroke pathophysiology and its impact on clinical treatments, Neuron 87 (2015) 297–309.

[4] H. Yao, T. Ago, T. Kitazono, T. Nabika, NADPH-oxidasrelaterad patofysiologi i experimentella modeller av stroke, Int. J. Mol. Sci. (2017) 18.

[5] J. Cao, M. Ying, N. Xie, G. Lin, R. Dong, J. Zhang, H. Yan, X. Yang, Q. He, B. Yang, The oxidation states of DJ{{ 1}} diktera cellens öde som svar på oxidativ stress utlöst av 4-hpr: autofagi eller apoptos? Antioxid redox tecken. 21 (2014) 1443–1459.

[6] Y. Kaneko, H. Shojo, J. Burns, M. Staples, N. Tajiri, CV Borlongan, DJ-1 lindrar ischemisk celldöd in vitro, möjligen via mitokondriella vägen, Neurobiol, Dis. 62 (2014) 56–61.

[7] D. Yanagisawa, Y. Kitamura, M. Indian, K. Takata, T. Taniguchi, S. Morikawa, M. Morita, T. Inubushi, I. Tooyama, T. Taira, et al., DJ{{ 1}} skyddar mot neurodegeneration orsakad av fokal cerebral ischemi och reperfusion hos råttor, J. Cereb. Blodflöde. Träffade. 28 (2008) 563–578.

[8] Y. Kaneko, N. Tajiri, H. Shojo, CV Borlongan, syre-glukos-berövade primära neurala celler från råtta uppvisar DJ-1-translokation till friska mitokondrier: ett potent stroketerapeutiskt mål, CNS Neurosci. Ther. 20 (2014) 275–281.

[9] N. Tajiri, CV Borlongan, Y. Kaneko, Cyclosporine A behandling upphäver ischemi-inducerad neuronal celldöd genom att bevara mitokondriell integritet genom uppreglering av det Parkinsons sjukdomsassocierade proteinet DJ-1, CNS Neurosci. Ther. 22 (2016) 602–610.

[10] RX Yang, J. Lei, BD Wang, DY Feng, L. Huang, YQ Li, T. Li, G. Zhu, C. Li, FF Lu, et al., Pretreatment with sodium Phenylbutyrate Lindrar cerebral ischemi/ reperfusionsskada genom att uppreglera DJ-1-protein, Front. Neurol. 8 (2017) 256.

[11] C. Gu, X. Yang, L. Huang, Cistanches Herba. En neurofarmakologisk granskning, Front. Pharmacol. 7 (2016) 289.

[12] Z. Li, H. Lin, L. Gu, J. Gao, CM Tzeng, Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): En av de bästa farmaceutiska gåvorna inom traditionell kinesisk medicin, Front. Pharmacol. 7 (2016) 41.

[13] Q. Liu, J. Li, J. Wang, J. Li, JS Janicki, D. Fan, Effekter och mekanismer av kinesisk örtmedicin för att lindra myokardischemi-reperfusionsskada, Evid.- Based Compl. Alt. (2013) (2013) 925625.

[14] HS Wong, KM Ko, Herba Cistanches stimulerar cellulär glutationredox-cykling av reaktiva syrearter som genereras från mitokondriell andning i H9c2-kardiomyocyter, Pharm. Biol. 51 (2013) 64–73.

[15] T. Wang, X. Zhang, W. Xie,Cistanchedeserticola YC Ma, "Desert ginseng": en recension, Am. J. Chin. Med. 40 (2012) 1123–1141.

[16] L. Gu, WT Xiong, C. Wang, HX Sun, GF Li, X. Liu,Cistanchedeserticolaavkok lindrar den testikeltoxicitet som induceras av hydroxiurea hos möss av hankön, asiatiska J. Androl. 15 (2013) 838–840.

[17] E. Herzfeld, C. Strauss, S. Simmermacher, K. Bork, R. Horstkorte, F. Dehghani, C. Scheller, Utredning avneuroprotektivapåverkan av nimodipin på Neuro2a-celler med hjälp av en operationsliknande stressmodell, Int. J. Mol. Sci. 15 (2014) 18453–18465.

[18] G. Vahabzadeh, N. Rahbar-Roshandel, SA Ebrahimi, M. Mahmoudian,Neuroskyddandeeffekt av noskapin på cerebral syre-glukosbristskada, Pharmacol. Rep. 67 (2015) 281–288.

[19] CP Wang, LZ Zhang, GC Li, YW Shi, JL Li, XC Zhang, ZW Wang, F. Ding, XM Liang, Mulberroside A skyddar mot ischemisk försämring i primär kultur av råttkortikala neuroner efter att syre-glukosbrist följt genom reperfusion, J. Neurosci. Res. 92 (2014) 944–954.

[20] X. Qi, R. Zhou, Y. Liu, J. Wang, WN Zhang, HR Tan, Y. Niu, T. Sun, YX Li, JQ Yu, Trans-cinnamaldehyd skyddade PC12-celler mot syre- och glukosbrist /reperfusion (OGD/R)-inducerad skada via anti-apoptos och antioxidativ stress, Mol. Cell Biochem. 421 (2016) 67–74.

[21] R. Chang, R. Zhou, X. Qi, J. Wang, F. Wu, W. Yang, W. Zhang, T. Sun, Y. Li, J. Yu, Protective effects of aloin on oxygen and glukosbrist-inducerad skada i PC12-celler, Brain Res. Tjur. 121 (2016) 75–83.

[22] M. Agrawal, V. Kumar, AK Singh, MP Kashyap, VK Khanna, MA Siddiqui, AB Pant, Trans-resveratrol skyddar ischemiska PC12-celler genom att hämma de hypoxirelaterade transkriptionsfaktorerna och öka nivåerna av antioxidantförsvarsenzymer, ACS Chem. Neurosci. 4 (2013) 285–294.

[23] KW Zeng, LX Liao, MB Zhao, FJ Song, Q. Yu, Y. Jiang, PF Tu, Protosappanin B skyddar PC12-celler mot syre-glukosbrist-inducerad neuronal död genom att upprätthålla mitokondriell homeostas via induktion av ubiquitin-beroende p53 proteinnedbrytning, Eur. J. Pharmacol. 751 (2015) 13–23.

[24] NT Ma, R. Zhou, RY Chang, YJ Hao, L. Ma, SJ Jin, J. Du, J. Zheng, CJ Zhao, Y. Niu, et al., Protective effffects of aloperine on neonatal rat primary odlade hippocampusneuroner skadade av syre-glukosbrist och reperfusion, J. Nat. Med. 69 (2015) 575–583.

[25] Y. Wang, W. Ma, A. Jia, Q. Guo, Parecoxib skyddar musens kortikala neuroner mot OGD/R-inducerad neurotoxicitet genom att uppreglera Bcl-2, Neurochem. Res. 40 (2015) 1294–1302.

[26] MP Ponnusamy, P. Seshacharyulu, A. Vaz, P. Dey, SK Batra, MUC4 stabiliserar HER2-uttryck och upprätthåller cancerstamcellspopulationen i äggstockscancerceller, J. Ovarian Res. 4 (2011) 7.

[27] R. Wang, L. Peng, J. Zhao, L. Zhang, C. Guo, W. Zheng, H. Chen, A. Gardenamide, Skyddar RGC-5-celler från H(2)O( 2)-inducerad oxidativ stressförolämpning genom att aktivera PI3K/Akt/eNOS signalväg, Int. J. Mol. Sci. 16 (2015) 22350–22367.

[28] LP Sun, X. Xu, HH Hwang, X. Wang, KY Su, YL Chen, Diklormetanextrakt av propolis skyddar cellen från oxidativ stress inducerad av syre-glukosbrist Y. Liu et al. Biomedicine & Pharmacotherapy 99 (2018) 671–680 679via reducerande apoptos, Food Nutr. Res. 60 (2016) 30081.

[29] L. Wang, Y. Zhang, T. Asakawa, W. Li, S. Han, Q. Li, B. Xiao, H. Namba, C. Lu, Q. Dong,Neuroskyddandeeffekt av neuroserpin i syre-glukosbrist- och reoxygenation-behandlade råttaastrocyter in vitro, PLoS One. 10 (2015) e0123932.

[30] Z. Zhiwen, W. Haitao, S. Fu, Z. Lihua, JL Peter, Q. Remi, Z. Wenhua, Litiumjoner dämpar serum-deprivation-inducerad apoptos i PC12-celler genom reglering av Akt/FoxO1-signaleringen pathways, Psychopharmacology (Berl) 12 (2015) 625–633.

[31] EJB Dariush Mozaffffarian, S. Alan, et al., Sammanfattning av hjärtsjukdom och strokestatistik 2016 uppdatering. En rapport från American Heart Association, Circulation 133 (2016) 447–454.

[32] JE Jumblatt, TA, Reglering av bindningsställen för muskarinligand genom nervtillväxtfaktor i PC12 feokromocytomceller, Nature 297 (1982) 152–154.

[33] S. Afrazi, S. Esmaeili-Mahani, V. Sheibani, M. Abbasnejad, Neurosteroid allopregnanolone dämpar hög glukosinducerad apoptos och förhindrar experimentell diabetisk neuropatisk smärta: in vitro och in vivo studier, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 139 (2014) 98–103.

[34] X. Liu, X. Zhu, M. Chen, Q. Ge, Y. Shen, S. Pan, Resveratrol skyddar PC12-celler mot OGD/R-inducerad apoptos via den mitokondriemedierade signalvägen, Acta Biochem Biophys Sin . 48 (2016) 342–353.

[35] PW Kleikers, K. Wingler, JJ Hermans, I. Diebold, S. Altenhofer, KA Radermacher, B. Janssen, A. Gorlach, HH Schmidt, NADPH oxidases as a source of oxidative stress and molecular target in ischemi/reperfusion skada, J. Mol. Med. (Berl) 90 (2012) 1391–1406.

[36] FC Liu, HI Tsai, HP Yu, Organskyddande effekter av rödvinsextrakt, resveratrol, vid oxidativ stress-medierad reperfusionsskada, Oxid. Med. Cell Longev. (2015) 568634.

[37] LK Seidlmayer, VV Juettner, S. Kettlewell, EV Pavlov, LA Blatter, EN Dedkova, Distinct mPTP activation mechanisms in ischemi-reperfusion: bidrag av Ca2 plus plus , ROS, pH och oorganiskt polyfosfat, Cardiovasc. Res. 106 (2015) 237–248.

[38] F. Su, AC Guo, WW Li, YL Zhao, ZY Qu, YJ Wang, Q. Wang, YL Zhu, Lågdosetanolförkonditionering skyddar mot syrebrist/reoxygenationsinducerad neuronal skada genom att aktivera storkonduktans , Ca2 plus plus -aktiverade K plus plus kanaler in vitro, Neurosci. Tjur. 33 (2017) 28–40.

[39] Y. Li, M. Wang, S. Wang, Effekt av hämmande mitokondriell fission på energimetabolism i hippocampusneuroner från råtta under ischemi/reperfusionsskada, Neurol. Res. (2016) 1–8.

[40] C. Rui, L. Yuxiang, H. Yinju, Z. Qingluan, W. Yang, Z. Qipeng, W. Hao, M. Lin, L. Juan, Z. Chengjun, et al., Protective effffects of Lycium barbarum polysackaride på neonatal råtta primärt odlade hippocampus neuroner skadade av syre-glukosbrist och reperfusion, J. Mol. Histol. 43 (2012) 535–542.

[41] BR Broughton, DC Reutens, CG Sobey, Apoptotiska mekanismer efter cerebral ischemi, Stroke 40 (2009) e331–339.

[42] Jordan M. Willcox, AJS Summerlee, Relaxin skyddar astrocyter från hypoxi in vitro, PLoS One. 9 (3) (2014) e90864.

[43] X. Zhang, D. Yuan, Q. Sun, L. Xu, E. Lee, AJ Lewis, BS Zuckerbraun, MR Rosengart, Kalcium/calmodulin-beroende proteinkinas reglerar PINK1/Parkin och DJ{{3} } vägar för mitofagi under sepsis, FASEB J. 31 (2017) 4382–4395.

[44] S. Vasseur, S. Afzal, J. Tardivel-Lacombe, DS Park, JL Iovanna, TW Mak, DJ-1/ PARK7 är en viktig mediator av hypoxi-inducerade cellulära svar, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009) 1111–1116.

[45] Z. Xianghong, Y. Du, S. Qian, X. Li, L. Emma, ​​J. Anthony, Brian Lewis, S. Zuckerbraun, Matthew R. Rosengart, Calcium/calmodulin-dependent protein kinase regulates the PINK1/ Parkin- och DJ-1-vägar för mitofagi under sepsis, FASEB J. (2017). [

46] MS Choi, T. Nakamura, SJ Cho, X. Han, EA Holland, J. Qu, GA Petsko, JR Yates 3rd, RC Liddington, SA Lipton, Transnitrosylation från DJ-1 till PTEN dämpar neuronal celldöd i Parkinsons sjukdomsmodeller, J. Neurosci. 34 (2014) 15123–15131.

[47] RK Dongworth, UA Mukherjee, AR Hall, R. Astin, SB Ong, Z. Yao, A. Dyson, G. Szabadkai, SM Davidson, DM Yellon, DJ Hausenloy, DJ-1 skyddar mot celldöd efter akut hjärtischemi-reperfusionsskada, Cell Death Dis. 5 (2014) e1082.

[48] ​​A. Di Cello, M. Di Sanzo, FM Perrone, G. Santamaria, E. Rania, E. Angotti, R. Venturella, S. Mancuso, F. Zullo, G. Cuda, F. Costanzo, DJ{ {1}} är en pålitlig serumbiomarkör för att urskilja högrisk endometriecancer, Tumor Biol. 39 (2017) 1010428317705746.

[49] H. Aleyasin, MW Rousseaux, PC Marcogliese, SJ Hewitt, I. Irrcher, AP Joselin, M. Parsanejad, RH Kim, P. Rizzo, SM Callaghan, et al., DJ-1 skyddar nigrostriatal axel från neurotoxinet MPTP genom modulering av AKT-vägen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107 (2010) 3186–3191.

[50] RM Canet-Aviles, MA Wilson, DW Miller, R. Ahmad, C. McLendon, S. Bandyopadhyay, MJ Baptista, D. Ringe, GA Petsko, MR Cookson, The Parkinsons sjukdom protein DJ-1 ärneuroprotektivapå grund av cystein-sulfinsyra-driven mitokondriell lokalisering, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 9103–9108.

[51] M. Liu, B. Zhou, ZY Xia, B. Zhao, SQ Lei, QJ Yang, R. Xue, Y. Leng, JJ Xu, Z. Xia, Hyperglykemi-inducerad hämning av DJ-1 uttryck äventyrade effektiviteten av ischemisk postkonditionering kardioprotection hos råttor, Oxid. Med. Cell Longev. (2013) (2013) 564902.