Cistanche Deserticola-polysackarid dämpar osteoklastogenes och benresorption via hämmande RANKL-signalering och produktion av reaktiva syrearter

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song et al

Osteoporos är en metabolisk sjukdom som kännetecknas av osteopeni och försämring av benets mikrostruktur. Osteoklaster är de primära effektorcellerna som bryter ned benmatris och deras onormala funktion leder till utveckling av osteoporos. Ansamling av reaktiva syrearter (ROS) under cellulär metabolism främjar osteoklastproliferation och differentiering, och spelar därför en viktig roll vid osteoporos.Cistanchedeserticolapolysackarid(CDP) har antitumör, antiinflammatorisk och antioxidant aktivitet. Emellertid är effekten av CDP på ​​osteoklaster oklar. I denna studie användes tartratresistent surt fosfatasfärgning, immunfluorescens, omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion och western blot-analys för att visa att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)hämmade osteoklastogenes och hydroxiapatitresorption. Dessutom CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)hämmade också uttrycket av osteoklastmarkörgener inklusive Ctsk, Mmp9 och Acp5, och hade ingen effekt på receptoraktivatorn för uttryck av nukleär faktor KB (RANK). Mekanistiska analyser visade att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)ökar uttrycket av antioxidantenzymer för att dämpa RANKL-medierad ROS-produktion i osteoklaster och hämmar kärnfaktorn hos aktiverade T-celler och mitogenaktiverad proteinkinasaktivering. Dessa resultat tyder på att CDP kan representera ett läkemedelskandidat för behandling av osteoporos orsakad av överdriven osteoklastaktivitet.

NYCKELORDbenresorption,Cistanchedeserticolapolysackarid, MAPK, osteoklast, reaktiva syreämnen

cistanche bodybuilding

1|INTRODUKTION

Balansen mellan benbildning, medierad av osteoblaster, och benresorption, medierad av osteoklaster, spelar en avgörande roll för att upprätthålla benmetabolisk homeostas (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). När benresorptionen överstiger benbildningen uppstår osteoporos som kännetecknas av minskad benmassa och benmikrostrukturella skador (Ikeda, 2008). Osteoporos är en vanlig sjukdom hos äldre individer och postmenopausala kvinnor och dess patogenes har inte helt klarlagts (Cooper & Melton, 1992). Östrogenbrist är en primär orsak till osteoporos (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). Dessutom kan reaktiva syrearter (ROS) induceras av receptoraktivator av nukleär faktor κB-ligand (RANKL) och är associerade med osteoklastbildning (Yip et al., 2005), och kan således bidra till utvecklingen av osteoporos (Manolagas, 2010). Vissa studier har funnit att Nrf2-antioxidantbrist ökar ROS-nivåerna och främjar RANKL-inducerad osteoklastdifferentiering (Hyeon, Lee, Yang, & Jeong, 2013). Därför bör minskning av ROS-produktion under osteoklastdifferentiering utvärderas som en terapeutisk strategi för behandling av osteoporos.

Osteoklaster härrör från monocyt- eller makrofagernas hematopoietiska linje och är de enda multinukleära cellerna som utför benresorption (Teitelbaum, 2000). Därför är forskning som involverar osteoklastbildning av stor betydelse för att utveckla effektiva behandlingar för benmetabolismsjukdomar (Lorenzo, 2017). Makrofagkolonistimulerande faktor (M‐CSF) och RANKL, producerad av osteoblaster och aktiverade T-celler, är viktiga cytokiner som reglerar osteoklastogenes (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL inducerar uttrycket av nukleär faktor hos aktiverade T-celler (NFATc1), som är en kritisk transkriptionsfaktor som är aktiv under osteoklastbildning (Ishida et al., 2002). Aktiverad NFATc1 främjar uttrycket av osteoklastmarkörgener såsom tartratresistent surt fosfatas (TRAcP) och katepsin K (CTSK) som reglerar osteoklastogenes och osteoklastfunktion (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

Cistanchedeserticolapolysackarid(CDP) är isolerad från köttiga stjälkar avCistancheoch besitter immunreglering, antitumör, antiaging och andra farmakologiska effekter (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)hade en hämmande effekt på lipopolysackarid-inducerad kväveoxid (NO) produktion i mus mikrogliaceller (BV-2 celler; Nan et al., 2013). Dessutom ett fenyletanoid-rikt extrakt (ECD) avCistancheförbättrade simkapaciteten hos möss genom att minska muskelskador, fördröja mjölksyraackumulering och förbättra energilagring (Cai et al., 2010). Emellertid är effekterna av CDP på ​​osteoklastfunktion och aktivitet fortfarande okända.

I denna studie visade vi att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)hämmar RANKL-inducerad osteoklastdifferentiering och benresorption. Den underliggande mekanismen var att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)förbättrar uttrycket av antioxidantenzymer för att dämpa ROS-produktion och undertrycker sedan RANKL-aktiverad NFAT och mitogenaktiverad proteinkinas (MAPK)-signaleringskaskader. Dessa resultat tyder på att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)kan användas för att behandla osteoporos orsakad av överdriven osteoklastisk benresorption.

maca ginseng cistanche

2|MATERIAL OCH METODER

2.1|Material

CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)(renhet > 98 procent) köptes från Solarbio (Beijing, Kina) och framställdes i en stamkoncentration av 1 mM i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Antikroppar är specifika för c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosforylerad (p)-ERK, p-p38, p-JNK och -aktin erhölls från jultomten Cruz Biotechnology (San Jose, CA). Antikroppar mot V-ATPas d2 producerades som tidigare beskrivits (H. Feng et al., 2009). 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-5-(3-karboximetoxifenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium (MTS) och luciferasanalyssystemet erhölls från Promega (Sydney, Australien) . Rekombinant M-CSF köptes från R&D Systems (Minneapolis, MN). Rekombinant GST-rRANKL-protein uttrycktes och renades som tidigare beskrivits (Xu et al., 2000).

2.2|Cell kultur

RAW264.7-celler (musmakrofagceller) erhölls från American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) och odlades i modifierat minimalt essentiellt medium (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Australien) kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin och 100 ug/ml streptomycin (komplett medium). Benmärgshärledda monocyter (BMM) isolerades från 6 veckor gamla C57BL/6J-möss, som avlivades enligt förfaranden som godkänts av Animal Ethics Committee vid University of Western Australia (RA/3/100/1244). Långa ben dissekerades fria från mjukvävnader och benmärgen spolades från lårbenet och skenbenet, som sedan odlades i ett komplett medium i närvaro av M-CSF (50 ng/ml).

2.3|Osteoklastogenesanalys

BMM ströks ut på odlingsplattor med 96 brunnar med en täthet av 6 × 103 celler per brunn och behandlades med ett komplett medium innehållande M-CSF (50 ng/ml) och GST-rRANKL (100 ng/ml), i närvaro av eller frånvaro av varierande koncentrationer av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>tre kärnor) identifierades som osteoklaster.

2.4|Cytotoxicitetsanalyser

BMM såddes i 96-brunnars plattor med 6 × 103 celler per brunn och lämnades över natten för att vidhäfta. Följande dag inkuberades cellerna med varierande koncentrationer av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid). Efter ytterligare 48 timmar tillsattes MTS-lösningen (20 ul/brunn) och inkuberades med celler under 2 timmar. Absorbansen vid 490 nm bestämdes med en mikroplattläsare (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2,5|Immunfluorescerande färgning

BMM såddes med en densitet av 6 × 103 celler per brunn i närvaro av M-CSF (50 ng/ml) över natten. Celler stimulerades sedan med M-CSF och GST-rRANKL (100 ng/ml) tills mogna osteoklaster bildades. Osteoklasterna behandlades sedan med varierande koncentrationer av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)i 48 timmar innan fixering med 4 procent paraformaldehyd, permeabilisering med 0,1 procent Triton X-100–PBS och blockering med 3 procent bovint serumalbumin i PBS. Preparerade celler inkuberades med rhodamin-konjugerat falloidin i 45 minuter i mörker för att färga för F-aktin. Celler tvättades sedan med PBS, kärnor motfärgade med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) och monterades med täckglas för konfokalmikroskopi.

cistanche upplevelse

2.6|Hydroxiapatitresorptionsanalys

För att mäta osteoklastaktivitet stimulerades BMM (1 × 105 celler per brunn) odlade på kollagenbelagda plattor med sex brunnar (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) med GST-rRANKL (100 ng/ml) och M-CSF (50 ng/ ml) tills mogna osteoklaster genererades (Zhou et al., 2016). Celler lossades sedan försiktigt från plattan med användning av celldissociationslösning (Sigma-Aldrich) och lika många mogna osteoklaster såddes på individuella brunnar i hydroxyapatitbelagda 96-brunnars plattor (Corning Osteoassay, Corning, NY). Mogna osteoklaster inkuberades i ett medium innehållande GST-rRANKL och M-CSF med eller utan CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)vid de angivna koncentrationerna. Efter 48 timmar färgades hälften av brunnarna immunhistokemiskt för TRAcP-aktivitet, såsom beskrivits ovan, för att bedöma antalet multinukleära celler per brunn. De återstående brunnarna blektes i 10 minuter för att avlägsna celler och möjliggöra mätning av de resorberade områdena. Resorberade områden fotograferades under standardljusmikroskopi och programvaran Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD) användes för att kvantifiera den procentuella arean av hydroxiapatityta som resorberats av osteoklasterna.

2.7|Luciferas reporteranalyser

För att undersöka NFATc1-transkriptionsaktivering transfekterades RAW264.7-celler stabilt med en NFATc1-responsiv luciferasreporterkonstruktion (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Transfekterade celler odlades i 48-brunnars plattor med en densitet av 1,5 × 105 celler per brunn och förbehandlades med olika koncentrationer av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)i 1 timme. Efter förbehandling stimulerades celler med GST-rRANKL (100 ng/ml) i 24 timmar, och luciferasaktivitet mättes med användning av luciferasreporteranalyssystemet enligt tillverkarens protokoll (Promega).

2.8|Kvantitativ analys av omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (RT-PCR).

Totalt RNA isolerades från celler med hjälp av Trizol-reagens enligt tillverkarens protokoll (Thermo Fisher Scientific). Komplementärt DNA syntetiserades med användning av Moloney murint leukemivirus omvänt transkriptas med 1 ug RNA-mall och oligo-dT-primrar. Polymeraskedjereaktionsamplifiering av specifika sekvenser utfördes med hjälp av följande program: 94 grader i 5 minuter, följt av 30 cykler på 94 grader i 40 sekunder, 60 grader i 40 sekunder och 72 grader i 40 sekunder, och ett sista förlängningssteg med 5 min vid 72 grader. Den detaljerade informationen om specifika primrar visas i tabell 1. Relativa budbärar-RNA-nivåer beräknades genom normalisering till uttrycket av hushållsgenen Hmbs.

2.9|Western blot-analys

BMM odlades i komplett medium med M-CSF i plattor med sex brunnar och stimulerades med GST-rRANKL (100 ng/ml) under de angivna tiderna. Celler lyserades i radioimmunoprecipitationslysbuffert och proteiner löstes upp genom natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores och överfördes till poly(vinylidenfluorid)-membran (GE Healthcare, Silverwater, Australien). Membranen blockerades i 5 procent skummjölk i 1 timme och undersöktes sedan med olika specifika primära antikroppar med försiktig skakning över natten vid 4 grader. Membran tvättades och inkuberades därefter med pepparrotsperoxidaskonjugerade sekundära antikroppar. Antikroppsreaktivitet detekterades sedan med förstärkt kemiluminescensreagens (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) och visualiserades med en Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2,10|Intracellulär ROS-detektion

Intracellulära ROS-nivåer detekterades med ett 2′,7′-diklorfluoresceindiacetat cellulär ROS-detektionsanalyssats (Abcam, Melbourne, Australien). BMM (5 × 103 celler per brunn) odlades i 96-brunnars plattor och behandlades med RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) och CDP i 72 timmar. Intracellulära ROS-nivåer mättes med 2′,7′-diklorfluoresceindiacetat, som oxideras till fluorescerande DCF i närvaro av ROS. Celler tvättades i Hanks buffert och inkuberades i mörker i 30 minuter med 10 µM DCFH-DA. Bilder erhölls med konfokalmikroskopi.

2.11|Statistiska analyser

Alla data är representativa för minst tre experiment utförda i tre exemplar om inget annat anges. Data uttrycks som medelvärde ± SD. Envägsvariansanalys följt av Student–Newman–Keuls post hoc-tester användes för att bestämma betydelsen av skillnader mellan resultat, med p < 0.05="" ansett="" som="">

3|RESULTAT

3.1|CDP hämmar RANKL-inducerad osteoklastogenes och osteoklastfusion

För att avgöra om CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)kan undertrycka RANKL-inducerad osteoklastbildning, utförde vi först en osteoklastogenesanalys med hjälp av mus BMM (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMMs behandlades med RANKL och M-CSF i 5 dagar med ökande koncentrationer av CDP. CDP minskade antalet TRAcP-positiva multinukleära celler när koncentrationen av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)nådde 5 µM eller högre (Figur la,b). För att utvärdera CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)toxicitet och bekräfta att dessa resultat inte var en återspegling av celldöd eller antal, utförde vi en MTS-analys. BMMs behandlades med RANKL och M-CSF i 48 timmar med olika doser av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid). CDP hade ingen effekt på BMM-proliferation vid en koncentration av 15 µM eller mindre (Figur 1c).

För att testa effekterna av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)vid osteoklastfusion inducerades osteoklaster med RANKL- och M-CSF-behandling, med eller utan varierande doser av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid). Osteoklaster färgades med rhodamin-falloidin och DAPI för att bedöma antalet kärnor per osteoklast (Figur 2a). Både antalet osteoklaster och det genomsnittliga antalet kärnor per osteoklast minskade efter CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)behandling (5–10 µM; figur 2b,c). Därför CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)hade hämmande effekter på RANKL-inducerad osteoklastogenes och osteoklastfusion på ett dosberoende sätt.

3.2|CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)dämpar RANKL-inducerad osteoklastisk hydroxiapatitresorptionsaktivitet

En hydroxiapatitresorptionsanalys utfördes för att detektera effekten av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)på osteoklastfunktion (Figur 3a). Efter en 24-timmars inkubation förändrades inte antalet osteoklaster per brunn medan hydroxiapatitresorptionsområdet minskade signifikant genom behandling med 5 och 10 µM CDP jämfört med kontrollgrupper (Figur 3b, c). Dessa resultat visar att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)har starkt hämmande effekter på både osteoklastbildning och osteoklastresorptionsaktivitet utan några cytotoxiska effekter.

3.3|CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)hämmar osteoklastmarkörgenexpression

För att ytterligare undersöka de hämmande effekterna av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)på osteoklastogenes och osteoklastisk benresorption, behandlades BMM med RANKL och M-CSF i 5 dagar med varierande koncentrationer av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid). RT-PCR utfördes sedan för att detektera uttrycket av osteoklastmarkörgener. Uttrycket av Nfatc1, en avgörande transkriptionsfaktor under osteoklastogenes, hämmades av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)på ett dosberoende sätt (Figur 4a). Dessutom CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)(5 och 10 µM) nedreglerade uttrycket av benresorptionsrelaterade gener, inklusive Mmp9, Ctsk och Acp5 (Figur 4b-d).

3.4|CDP undertrycker NFATc1-aktivitet och nedströms proteinuttryck

För att undersöka effekten av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)på RANKL-inducerad NFATc1-aktivitet utfördes en luciferasreporteranalys. Behandling med CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid), vid koncentrationer på 5 µM och högre, hämmade signifikant RANKL-inducerad NFATc1-aktivitet (Figur 5a). Dessutom visade western blot-analys att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)signifikant undertryckt proteinuttryck av NFATc1 och c-Fos i BMMs behandlade med RANKL och M-CSF i 3 och 5 dagar (Figur 5b). Dessutom nedreglerades uttrycket av osteoklastfunktionsrelaterade proteiner, såsom V-ATPase-d2 och CTSK, i närvaro av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)jämfört med kontrollgrupper. CDP hade dock ingen effekt på RANK-uttryck (Figur 5b).

3,5|CDP främjar uttrycket av antioxidantenzymer för att avlägsna ROS-produktion under RANKL-inducerad osteoklastogenes

För att utforska den underliggande mekanismen för CDP-beroende osteoklastogeneshämning, behandlades BMM med RANKL (100 ng/ml) och M-CSF (50 ng/ml) tillsammans med PBS eller CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)i 72 timmar. Vi undersökte effekten av CDP på ​​intracellulär ROS-produktion stimulerad av RANKL. Intracellulära ROS-nivåer ökades genom RANKL-behandling, som försvagades av CDP (5 och 10 µM; figur 6a). Både antalet ROS-positiva celler och intensiteten av ROS-färgning minskade med CDP-behandling på ett dosberoende sätt (Figur 6b, c). Western blot-analys visade att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)främjade tioredoxin (TRX1) och glutationreduktas (GSR) uttryck samtidigt som uttrycket av inducerbart kväveoxidsyntas (NOS2) undertrycktes i BMM som behandlades med RANKL och M-CSF i 3 dagar (Figur 6d).

För att ytterligare utforska om CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)undertryckt osteoklastdifferentiering genom att minska ROS-produktionen, vi behandlade sedan BMM med peroxid (10 µM) för att imitera den höga ROS-statusen i celler. BMM inducerades av RANKL och M-CSF i 3 dagar och resultaten av western blot-analys och RT-PCR visade att peroxid främjade NFATc1 och c-Fos uttryck jämfört med kontrollgrupperna. I enlighet med resultaten i figur 5 undertrycktes uttrycket av NFATc1 och c-Fos av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)medan peroxid räddade den hämmande effekten av CDP (Figur 6e,f). Dessa data indikerade att CDP undertryckte uttrycket av NFATc1 och c-Fos genom att rensa ROS-produktion.

3.6|CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)undertrycker MAPK-vägar under RANKL-inducerad osteoklastogenes

Därefter undersökte vi effekten av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)behandling på RANKL-medierat TRAF6-uttryck och MAPK-vägaktivering. Efter inkubation i serumfritt medium under 2 timmar, stimulerades BMM med RANKL, med eller utan CDP, i 60 minuter. Stimulering med CDP (10 µM) hade ingen effekt på TRAF6-uttryck och försvagad fosforylering av JNK2 och ERK1/2 vid 10 och 20 minuter (Figur 7). Dessutom hämmades p38-fosforylering signifikant av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)behandling på 60 min jämfört med kontrollgrupper (Figur 7). Dessa data visar att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)undertrycker RANKL-inducerade MAPK-signalvägar, i överensstämmelse med dess hämmande effekt på osteoklastbildning och aktivitet.

4|DISKUSSION

Cistanche, känd som "ökenginseng", har nyligen väckt stor uppmärksamhet för sin förmåga att modulera immunitet och agera skyddande under åldrande och oxidativ stress (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). Fenylpropanoid-substituerade glykosider, de viktigaste aktiva komponenterna i Cistanche, har visat sig hämma NO-aktivitet i makrofager (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017). Dessutom, enCistancheextrahera reducerad oxidativ stress i reperfunderat myokardium efter ischemi och spelade en betydande roll i hämningen av apoptotiska vägar som leder till hjärtskydd (Yu, Li, & Cao, 2016). Som en viktig komponent i Cistanche, CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)har en mängd olika farmakologiska funktioner. Vår nuvarande studie fann att CDP undertryckte RANKL-aktiverad osteoklastdifferentiering och aktivering genom att dämpa ROS-produktion samt NFAT- och MAPK-aktivering.

Som ett surt fosfatas finns TRAcP i en mängd olika celler och är rikligt förekommande i osteoklaster och alveolära makrofager (Snipes, Lam, Dodd, Gray, & Cohen, 1986). TRAcP är ett karakteristiskt enzym för osteoklaster och dess uttryck är nära relaterat till osteoklastfunktionen, betraktad som en indikator på osteoklastaktivitet och benresorption (Minkin, 1982). I vår studie, CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)hämmade antalet TRAcP-positiva celler, vilket indikerar att RANKL-inducerad osteoklastogenes blockerades av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid). Nedbrytning av benmatris av osteoklaster beror på cathepsin K (CTSK) och MMPs (Gruber, 2015). Här nedreglerade CDP signifikant uttrycket av osteoklastfunktionella gener som Mmp9, Ctsk och Acp5.

Osteoklastdifferentiering och funktion regleras av flera signalvägar (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). Efter bindning till RANK rekryterar RANKL adapterprotein TRAF6 för att aktivera uttrycket av NFATc1, som är en viktig transkriptionsfaktor för osteoklastbildning, som påverkar osteoklastspecifikt genuttryck, inklusive TRAcP och CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). I denna studie fann vi att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)hade ingen effekt på RANK och TRAF6 uttryck i osteoklaster. Men CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)hämmade RANKL-inducerad NFATc1-aktivering under osteoklastogenes av BMM. Dessutom visades det att ROS, producerat av mitokondrier i processen att leverera elektroner, främjade proliferation och differentiering av osteoklaster och reglerade benmatrisnedbrytning (Ha et al., 2004). En nyligen genomförd studie fann att RANKL inducerade Bach1-kärnimport och försvagade Nrf2-medierad antioxidantenzymproduktion, vilket förstärkte intracellulärt ROS-uttryck och osteoklastogenes hos möss (Kanzaki et al., 2017). Dessutom förbättrade ökad intracellulär ROS-generering av homocystein osteoklastbildning och aktivitet (Koh et al., 2006). Vår studie fann att CDP minskade ROS-ackumulering i osteoklaster genom att hämma NOS2-uttryck och främja uttrycket av antioxidantenzymer, såsom TRX1 och glutationreduktas. När vi behandlade BMM med peroxid för att förbättra intracellulär ROS-ackumulering visade resultaten att ökad ROS kunde förbättra NFATc1-uttrycket att ROS var uppströms om NFATc1. Vi fann också att peroxid räddade den hämmande effekten av CDP på ​​NFATc1-uttryck. Så våra data tyder på att CDP undertrycker ROS-ackumulering för att hämma NFATc1-uttryck och sedan för att undertrycka osteoklastbildning och funktion.

ERK, JNK och p38 tillhör MAPK-familjen, som också är involverad i regleringen av osteoklastdifferentiering (Seger & Krebs, 1995). RANKL aktiverar MAPK-vägen genom att öka fosforyleringen av ERK, JNK och p38 (Mizukami et al., 2002). Vi visade att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)undertryckte den RANKL-medierade fosforyleringen av nyckelproteiner i MAPK-vägen, och bidrog därigenom till den hämmande effekten av CDP på ​​uttrycket av osteoklastmarkörgener. Såvitt vi vet är detta den första studien som visar de hämmande effekterna av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)på ROS-produktion, NFAT och MAPK-aktivering, vilket representerar nya verkningsmekanismer för CDP in vitro.

Sammanfattningsvis visade vi att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)dämpar osteoklastogenes och hydroxiapatitresorption, och uttrycket av osteoklastmarkörgener inklusive Ctsk, Mmp9 och Acp5. CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)kunde undertrycka RANKL-medierad ROS-produktion, såväl som NFAT- och MAPK-aktivering (Figur 8). Sammantaget tyder våra resultat på att CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)kan representera ett läkemedelskandidat för behandling av osteoklastrelaterade tillstånd åtföljda av ROS-överproduktion.

FIGUR 8 Schematiskt diagram av CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)funktion vid osteoklastdifferentiering. CDP(Cistanchedeserticolapolysackarid)undertrycker RANKL-inducerad ROS-produktion, såväl som NFATc1- och MAPK-aktivering, vilket hämmar osteoklastogenes. CDP,Cistanchedeserticolapolysackarid; MAPK, mitogenaktiverat proteinkinas; NFATcl, nukleär faktor av aktiverad T-cell; RANKL, receptoraktivator för nukleär faktor KB-ligand; ROS, reaktiva syrearter [Färgbild kan ses på wileyonlinelibrary.com]

TACK

Den här studien stöddes av Kinas naturvetenskapliga stiftelse (81572164), Kinas nationella nyckelteknologiforsknings- och utvecklingsprogram (2017YFC1103300), naturvetenskapsstiftelsen i Guangxi-provinsen (2016GXNSFAA380295) och forskningsprojektet för universitetsvetenskap och teknik i Guangxi. Provins (KY2015YB054). Det stöds också delvis av Guangxi Scientific Research and Technology Development Plan Project (GKG13349003, 1598013‐15), Western Australia Medical & Health Research Infrastructure Fund, Arthritis Australia Foundation, University of Western Australia (UWA) Research Collaboration Awards, och Australian Health and Medical Research Council (NHMRC, nr 1107828 och 1027932).

INTRESSEKONFLIKT

Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter

Från: 'Cistanchedeserticolapolysackariddämpar osteoklastogenes och benresorption genom att hämma RANKL-signalering och produktion av reaktiva syreämnen av Dezhi Song et al.

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684