Cistanche Herba har antidepressiv effekt vid kronisk oförutsägbar stress

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li, et al

ABSTRAKT

Cistanche tubulosa, en art av Cistanches Herba, bekräftades nyligen ha antidepressiv effekt på råttor med inkronisk oförutsägbar stress (CUS) genom att återställa homeostas av tarmmikrobiota. I den här artikeln syftar vi till att undersöka den metaboliska profilen av C. tubulosa i normala och CUS-inducerade depressiva modellråttor in vitro och in vivo. Med UPLC-Q-TOF-MS, in vitro gastrointestinala metabolism avCistanche tubulosa extrakt(CTE) utvärderades i både normala och CUS-råttor. Samtidigt, in vivo metabolism av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)hos normala och deprimerade råttor undersöktes också i råtturin och avföring. Totalt 20 och 26 metaboliter karakteriserades från in vitro- och in vivometabolism hos normala respektive CUS-råttor. CTE(Cistanche tubulosa extrakt)metaboliserades till aglykoner och nedbrytningsprodukter av fenyletanoidglykosider (PhGs) och iridoidglykosider, antingen genom normal eller deprimerad tarmmikrobiota från råtta in vitro. Fas II-metaboliter av aglykoner och nedbrytningsprodukter av PhG och iridoidglykosider var huvudmetaboliterna i råtturin och avföring. Dessutom var den metaboliska förmågan att generera sekundära glykosider och aglykoner i depressiv tarmmikrobiota från råtta mycket svagare än den i normal tarmmikrobiota från råtta, vilket tillskrevs de oordnade glykosidhydrolaser som produceras av tarmmikrobiota i CUS-deprimerade råttor. Resultaten av denna studie lade grunden för att förstå den metaboliska processen och den terapeutiska mekanismen för CTE:s antidepressiva egenskaper.

Nyckelord: Cistanche tubulosa, DepressionMetabolism, In vitro, In vivo, Intestinal mikrobiota

1. Introduktion

Cistanches Herba är officiellt registrerat som de torkade saftiga stjälkarna av Cistanche deserticola (YC Ma) och C. tubulosa (Schrenk), som används för att behandla njurbrist, impotens, kvinnlig infertilitet, morbidleukorré, riklig metrorragi och senil förstoppning [1]. Moderna farmakologiska studier har visat att Cistanches Herba har olika biologiska aktiviteter såsom anti-neurodegeneration, immunreglering och anti-inflammation [2,3]. Våra tidigare undersökningar har bekräftat detCistanche tubulosa extrakt(CTE), som består av 48,6 procent fenyletanoidglykosider (PhGs), 6,9 procent iridoidglykosider och 20,0 procent totala sackarider, kunde markant lindra depressiva symtom på kronisk oförutsägbar stress (CUS)-inducerad depressiva råttor genom att återställande av homeostas av tarmmikrobiota [4]. Nyligen genomförda studier tyder på att förändringar i tarmmikrobiotans sammansättning var associerade med utvecklingen och progressionen av depression [5,6]. De relativa mängderna av de mikrobiella släktena stördes markant i CUS-depressiva modellråttor jämfört med normala kontroller [7]. Hos deprimerade patienter förändrades också mångfalden och rikedomen av tarmmikrobiota signifikant [8]. Dessutom ansågs olika föreningar inklusive fenyletanoidglykosider (PhGs) och iridoidglykosider som huvudbeståndsdelarna i Cistanches Herba [2,3], som lätt metaboliserades till sina sekundära glykosider och aglykoner inklusive hydroxityrosol (HT), 3,4-dihydroxifenetyl glykosid, deglykosylerad geniposidinsyra, etc. av mänsklig tarmmikrobiota. Dessa metaboliter absorberas lättare genom tarmen och utövar biologisk aktivitet som överensstämmer med prototypkomponenten[9–11]. Sålunda tror vi att under förekomsten och utvecklingen av depression kommer störningen av tarmens mikroflorastruktur oundvikligen att påverka metabolismen av orala traditionella kinesiska läkemedel (TCM) i mag-tarmkanalen, förutom att påverka värdens fysiologiska tillstånd. De flesta av de befintliga metaboliska data från Cistanches Herba kommer från metaboliska studier på friska djur[12–15]. Därför skulle det vara av mer klinisk betydelse att undersöka den metaboliska profilen av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)i det patologiska tillståndet för att belysa dess bioaktiva komponenter och förstå verkningsmekanismen för dess antidepressiva effekt.

I den aktuella studien strävar vi efter att karakterisera de metaboliska profilerna för CTE(Cistanche tubulosa extrakt)i både friska och CUS-inducerade depressiva modellråttor genom ultrapresterande vätskekromatografi kvadrupol masspektrometri (UPLC-Q-TOF-MS). Magsaft, tarmvätska och mikrobiota från normala och depressiva patologiska råttor har använts för att simulera den metaboliska processen av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)i mag-tarmkanalen in vitro, oberoende och sekventiellt. In vivo-metaboliter klarläggs också efter oral administrering av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)hos normala och CUS-råttor. Denna studie ger nya insikter om metabolismen och aktiva metaboliter av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)för depression.

2. Material och metoder

2.1. Material

Torkade stjälkar av C. tubulosa samlades in från Hetian County (Xinjiang, Kina). Proverna av kupongprover autentiserades av professor Xiaobo Li och deponerades på herbariet vid School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Kina). Extraktionsmetoden användes som specificerats i vår tidigare publikation [4]. DeCistanche tubulosa extrakt(CTE) prover förvarades vid 4 grader och återupplöstes med sterilt vatten före användning. De sterila vattenlösningarna i CTE(Cistanche tubulosa extrakt)provet filtrerades sedan genom ett 0.22 μm membran och filtraten samlades upp i sterila rör.

Echinacoside tillhandahölls av Dr. Pengfei Tus laboratorium, PekingUniversity (Peking, Kina). Akteosid, isoakteosid, 2'-acetylakteosid och cistanosid A köptes från Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). Hydroxytyrosol, koffeinsyra, 3,4-dihydroxibensenpropionsyra, 3-hydroxifenylpropionsyra och 3-fenylpropionsyra köptes från Aladdin IndustrialInc. (Shanghai, Kina). Renheten för varje komponent bestämdes vara > 95 procent med HPLC-UV. Acetonitril av HPLC-kvalitet köptes från Merck (Darmstadt, Tyskland). Avjoniserat vatten framställdes från destillerat vatten med användning av ett Milli-Q vattenreningssystem (Millipore, Bedford, MA, USA). Alla andra reagenser och kemikalier som användes var av analytisk kvalitet.

2.2. Djurförsök

Sprague-Dawley-hanråttor (200 ± 20 g) anskaffades från Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Beijing, Kina) och inhystes i Laboratory Animal Center vid Shanghai JiaoTong University (Shanghai, Kina). Djuren hölls i grupp under kontrollerad rumstemperatur (25 ± 2 grader, 55 ± 10 procent relativ fuktighet) med en 12:12 timmars ljus-mörkercykel. Råttorna fick fri tillgång till vanlig laboratorieråttmat och vatten under 1 vecka. Djuranläggningarna och protokollen godkändes av Animal Ethics Committee vid Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Kina).

Efter en veckas acklimatisering delades tolv naiva råttor slumpmässigt in i två grupper (n=6), kontrollgruppen och gruppen med kronisk oförutsägbar stress (CUS). CUS-råttor utvecklades som i vår tidigare rapport [4], som utsattes för en mängd olika stressfaktorer: vitbrus (100 dB) under 1 timme, lågintensiv stroboskopisk belysning över natten (120 blixtar/min), vattenbrist i 24 timmar, tom vattenflaskor i 1 timme (efter vattenbrist), matbrist i 24 timmar, fysisk fasthållning (1−2 timmar), tvångssim (5 min), smutsig bur i 24 timmar (200 ml vatten i 100 g sågspånsbädd), svansnypa ( 1 min), stöt i 30 minuter, 45 graders burlutning i 24 timmar och belysning över natten (12 timmar). Stressorer applicerades kontinuerligt och slumpmässigt i 4 veckor, detaljerad ordning beskrivs i tabell S1. Efter 4 veckors stress utfördes sackarospreferenstestet, öppet fälttestet och nyhetsundertryckt matningstest som beskrivits tidigare [4]. Konturen av CUS och beteendetestet visas i Fig. S1. Efter beteendetester erhölls minst 4 fekalpellets från varje råtta och placerades i sterila koniska rör för in vitro-analys av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)ämnesomsättning.

2.3. Gastrointestinal metabolism av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)av normal och CUS-råtta in vitro

2.3.1. Metabolism av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)i simulerade mag- och tarmsafter

Femtio milligram CTE(Cistanche tubulosa extrakt)sattes till 10 ml simulerad magsaft respektive tarmjuice. Sedan CTE(Cistanche tubulosa extrakt)inkuberades vid 37 grader i 4 timmar i magsaft och 6 timmar i tarmsaft. Den odlade blandningen (1 ml) släcktes med 3 ml vattenmättad n-butanol omedelbart vid 0 och 4 timmar i magsaft och vid 0 och 6 timmar i tarmljus. Bearbetningsmetoden för provet som användes var som tidigare beskrivits [9].

2.3.2. Metabolism av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)av normal och CUS tarmmikrobiota från råtta

Färska normala och CUS-råttfekala prover blandades först och homogeniserades med 25 gånger volymen GAM-buljong. Sediment avlägsnades genom filtrering genom tre bitar gasväv. Suspensionen inkuberades sedan vid 37 grader i en anaerob inkubator i vilken luften ersattes med en gasblandning (H2 5 procent, CO2 10 procent, N2 85 procent). Femtio milligram CTE sattes till 5 ml normal och CUS-råttfekal suspension separat, och suspensionen inkuberades vid 37 grader i 48 timmar. Den odlade blandningen avlägsnades och extraherades med vattenmättad n butanol vid 0, 12, 24 och 48 timmar. Provbearbetningsmetoden har beskrivits tidigare [9].

2.3.3. Sekventiell metabolism av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)av magsaften, tarmsaften, normal och CUS-råtts tarmmikrobiota

För det första 100 mg CTE(Cistanche tubulosa extrakt)sattes till 1{{10}} mL simulerad magsaft och inkuberades vid 37 grader i 4 timmar. Hela reaktionen släcktes med 3 gånger volymen vattenmättad n-butanol och centrifugerades vid 3000 rpm i 15 minuter, följt av avdunstning av supernatanten under en ström av kväve gas på 37 grader. För det andra återupplöstes återstoden i 0,4 ml sterilt vatten, sattes till 8 ml simulerad tarmsaft och inkuberades vid 37 grader i 6 timmar. Provet med magsaft förbereddes på samma sätt. Slutligen återupplöstes återstoden i 0,3 mL sterilt vatten, sattes till 6 mL normal- respektive CUS-råttfekal suspensioner och inkuberades vid 37 grader i 48 timmar i en anaerobicinkubator. En milliliter av reaktionen släcktes med 3 ml vattenmättad n-butanol omedelbart vid 0 och 4 timmar i magsaft, vid 0 och 6 timmar i tarmsaft och vid 0, 12, 24 och 48 timmar i tarmmikrobiota från råtta . Provet behandlades identiskt CTE(Cistanche tubulosa extrakt)i simulerad magsaft.

2.4. Metabolism av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)av normal och CUS-råtta in vivo

Varje råtta i de två grupperna inhystes sedan i en individuell metabolisk bur. Efter fasta över natten som endast tillät fri tillgång till vatten, administrerades alla råttor oralt med 2 ml vatten via magslang. Tomma urin- och fekala prover togs från alla råttor från 0 timmar till 12 timmar. Vidare, CTE(Cistanche tubulosa extrakt)(400 mg/kg) administrerades genom sondmatning. Urin- och fekala prover togs från 0 timmar till 24 timmar. Alla urin- och fekala prover lagrades vid -80 grader omedelbart.

Urin- och fekala prover från normal och CUS-råtta förbehandlades som tidigare beskrivits [12]. Alla resulterande prover analyserades med UPLC-Q-TOF-MS.

2.5. Analytisk metod

UPLC utfördes på ett Waters ACQUITY UPLC-system (WatersCorp., Milford, MA, USA) med en ACQUITY UPLC BEH C18-kolonn (100 mm × 2,1 mm id, 1,7 μm, Waters Corp. , USA) genom gradienteluering med {{10}},1 procent myrsyraacetonitril (A) och 0,1 procent myrsyra i vatten (B) vid en flödeshastighet av 0,4 ml/min. . Gradientprofilen var: 0–5 min (A:5–20 procent), 5–7,5 min (A: 20–30 procent), 7,5–10 min (A: 30–70 procent), 10–11 min(A). : 70–100 procent), och hölls i 1,5 min. Gradienten återfördes till 5 procent på 0,5 min och hölls i 2,5 min för nästa körning. Injektionsvolymen var 3 μL. Temperaturen i kolonnugnen var inställd på 35 grader.

Masspektrometri utfördes med användning av en Waters Vion IMS-masspektrometer (Waters Corp., Milford, MA, USA). Jonisering utfördes i negativ elektrospray (ESI−) läge. MS-parametrarna var följande: kapillärspänning, −2.0 kV; konspänning, 20 V; källtemperatur, 120 grader ; desolvationstemperatur, 500 grader ; gasflöden av kon och desolvation, 50 respektive 1000 L/h. För noggrann massmätning användes leucin-enkefalin som låsmassa för att generera en [M–H]-jon (m/z 554.2615). Ett MSE-experiment (Mass SpectrometryElevatedEnergy) i två skanningsfunktioner utfördes enligt följande: funktion 1 (lågenergi): m/z 50–1000, 0,25 s scantid, 0,02 s interscan-fördröjning, 6 eV kollisionsenergi; funktion 2 (hög energi): m/z50–1000, 0,25 s skanningstid, 0,02 s inter-scan fördröjning, kollisionsenergiramp på 20–45 eV.

2.6. Databehandling

Data bearbetades med hjälp av UNIFI 1.8.1-programvara (Waters Corp., Milford, MA, USA) för identifiering av metaboliter inom den exakta massan av full-scan rådata som samlats in genom MSE. Föreningar identifierades baserat på exakt massa, fragment i högenergimasspektrometri. Intensitetströskeln sattes till 100,0 räkningar. Målidentifieringen, fragmentmatchningstoleransen och andra parametrar ställdes in automatiskt.

3. Resultat

3.1. Beteendeförändringar i CUS-inducerad depressionsråtta

Råttorna med CUS-inducerade depressiva symtom bedömdes genom beteendetester inklusive sackarospreferenstest, öppet fälttest och nyhetsundertryckt matningstest. Elevens t-test avslöjade att sackarospreferens i sackarospreferenstest (p < 0,001),="" totalt="" avstånd="" tillryggalagt="" i="" öppet="" fälttestet="" (p="">< 0,001)="" och="" latens="" att="" äta="" i="" nyhetsundertryckt="" matningstest="" (p="">< 0,01)="" var="" signifikant="" annorlunda="" jämfört="" med="" kontrollgruppen="" efter="" 4-veckors="" cus-behandling="" (fig.="" 1).="" dessa="" fynd="" indikerade="" att="" den="" kroniska="" oförutsägbara="" stressmodellen="" framgångsrikt="">

3.2. Karakterisering av kemiska beståndsdelar i CTE(Cistanche tubulosa extrakt)

En omfattande analys av prototypbeståndsdelar av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)utfördes av UPLC-Q-TOF-MS. Totalt 27 beståndsdelar från CTE(Cistanche tubulosa extrakt)upptäcktes och preliminärt karakteriserades, inklusive 20 PhG, 5 iridoid- och iridoidglykosider och 2 oligosackarider. Detaljerad information, inklusive retentionstid, exakta MS- och MS/MS-fragmentjoner, listas i Stödinformation (tabell S2) för att ge insikt i strukturen hos dessa kemiska beståndsdelar. UPLC-Q-TOF-MS totalt jonkromatogram (TIC) av CTE visades i Fig. S2.

3.3. Gastrointestinal metabolism av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)av normal och CUS-råtta in vitro

I denna studie, de potentiella metaboliterna av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)av normala och CUSråttor in vitro detekterades från TIC och identifierades med en kombination av elementära kompositioner och MS/MS-fragmentmasspektra efter att ha jämfört dem med kontrollproverna. Alla metaboliter från CTE(Cistanche tubulosa extrakt)i simulerade mag- och tarmjuicer listas normal och CUS råttarmmikrobiota i tabell 1.

3.3.1. Metabolism av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)i simulerade mag- och tarmsafter

Sju metaboliter av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)i simulerad magsaft identifierades preliminärt genom noggrann information om massa och MSE-fragment: M1 (m/z315.1074, C14H20O8, 1,66 min), M4 (m/z 459.1501, C20H28O12, 2.36 min), M5 (m/z 130, C105, C105, C105, C105, C105. 2,60 min), M7 (m/z179,0338, C9H8O4, 2,85 min), M12 (m/z 785,2481, C35H46O20, 4,77 min), M16 (m/z 827,2580, C37H48O72 min, och Mz. .1968, C29H36O15, 5,81 min). Deglykosylering, dehydroxylering, dehydrering och isomerisering ansågs vara de viktigaste metaboliska vägarna för CTE i magsaft. M4 och M5 visade sig ha en molekylvikt på 2 Da och 16 Da lägre än deras prototypkomponent, koffeoylakteosid, och identifierades således som dess dehydrerade respektive dehydroxylerade produkter. M12 identifierades som en isomer av echinakosid, som producerar samma joner som echinakosid vid m/z 623.2178, 477.1601, 315.1055, 161.0237.

Samma metaboliter upptäcktes efter CTE(Cistanche tubulosa extrakt)inkubation i tarmljuice. Det är anmärkningsvärt att koffeoylgruppen i C-6′-positionen i PhGs lätt metaboliserades av matsmältningsenzymer i tarmsaften för att producera dess dekoffeylmetaboliter och koffeinsyra.

3.3.2. Metabolism av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)av normal och CUS tarmmikrobiota från råtta

Totalt 20 metaboliter biotransformerade från CTE(Cistanche tubulosa extrakt)i normal ratintestinal mikrobiota upptäcktes och identifierades (Fig. 2). Från resultaten observerades det att PhG bröts ned till aglykonhydroxityrosol (HT) M2 (m/z 153,0550, C8H10O3, 1,78 min) och koffeinsyra (CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O4 min), sedan 2,85 min. metaboliserades vidare till M3 (m/z 163,0390, C9H8O3, 2,02 min), M6 (m/z181,0501, C9H10O4, 2,76 min), M10 (m/z 195,0655, C10H12O4, 5,15 min), och M6 (m/z181,0501) , C9H10O3, 4,36 min) genom dehydroxylering, reduktion och metylering. Dessutom är de centrala metaboliska vägarna som producerade direkta metaboliter av PhG-prototypföreningar från CTE i normal tarmmikrobiota från rått reduktion, metoxylering, deglykosylering, koffeoyl, dehydrering och isomerisering.

Efter inkubation i CUS-inducerad depression råtta tarmmikrobiota, CTE(Cistanche tubulosa extrakt)omvandlades till 20 metaboliter genom samma metaboliska vägar som normala råttor.

3.3.3. Sekventiell metabolism av CTE av magsaft, tarmsaft, normal och CUS råtts tarmmikrobiota

Efter sekventiell inkubation i magsaft, tarmjuice, normal och CUS tarmmikrobiota från råtta, CTE(Cistanche tubulosa extrakt)metaboliserades till 14 metaboliter (inklusive 8 med magsaft, 7 med tarmjuice, 11 med normal och 10 med tarmmikrobiota från CUS från råtta). Bland dessa var M2(HT) och M11 (3-hydroxifenylpropionsyra, 3-HPP) slutmetaboliterna av PhG efter sekventiell inkubation av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)i magsaft, tarmjuice och tarmmikrobiota. Det fanns ingen signifikant skillnad i metaboliter mellan normal och CUS-råtta.

M8, M9, M14, M17, M19 och M20 detekterades endast i den oberoende metabolismen av CTE av normal och CUS tarmmikrobiota från rått. Dessa metaboliter var huvudsakligen metaboliska intermediärer som hade metaboliserats fullständigt till slutliga metaboliter i studien av den sekventiella metabolismen av CTE och är därför svåra att upptäcka.

3.3.4. Skillnader mellan metabolisk hastighet av CTE av normal och CUS ratintestinal mikrobiota

För att klargöra skillnaderna mellan metabolismen av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)av normal och CUS råtttarmmikrobiota bestämdes det relativa innehållet av 27 prototypföreningar och 20 metaboliter efter inkubation med magsaft, tarmsaft, normal och CUS råtttarmmikrobiota separat och sekventiellt (tabellerna S3 och S4). Resultaten indikerade att även om det inte fanns några signifikanta skillnader mellan CTE(Cistanche tubulosa extrakt)metaboliter från normala och depressiva råttor, observerades en signifikant skillnad i deras metaboliska hastigheter. Till exempel identifierades C2 och C5 som 8-epilogansyra eller dess isomer. De metaboliserades fullständigt i normala prover inom 12 timmars inkubation. I patologiskt deprimerad tarmmikrobiota från råtta, metaboliserades de dock grundligt efter 48 timmars inkubation. Det var uppenbart att ämnesomsättningen hos den normala råttan var snabbare än den hos CUS-råttan. Liknande resultat upptäcktes från C18 (isoacteosid). Dessutom är det anmärkningsvärt att topparean för M12 (isomerisering av echinakosid) och M16 (isomerisering av tubulosid A) i normala prover var mycket större än i CUS-prover, vilket indikerar att isomeriseringsreaktionen av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)var mer utbredd i normal tarmmikrobiota från råtta än vid depression tarmmikrobiota från råtta.

3.4. Metabolism av CTE av normal och CUS-råtta in vivo

Genom att jämföra biologiska prover från den CTE-behandlade gruppen med blankbiologiska prover, totalt 26 metaboliter (förening 1–26) av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)innormala och CUS-råttor detekterades (tabell 2). Typiska UPLC-kromatogram av normala och CUS-råtturinprover presenteras i Fig. 3.

3.4.1. Karakterisering av metaboliterna av CTE i normal och CUS-raturin

Totalt 18 in vivo-metaboliter av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)hos normala råttor identifierades preliminärt urinprover. Nedbrytningsmetaboliter av PhG inklusive HT och CA, och deras ytterligare sulfatering (förening 1, 2, 3, 5, 8 och 16), metylering (6, 21, 22 och 24) och metoxylering (13 och 14) metaboliter var huvudmetaboliter i normal råtturin. Iridoidglykosider metaboliserades lätt till aglykoner (23, 25 och 26) genom deglykosylering. Det är anmärkningsvärt att ingen prototypkomponent upptäcktes i det normala urinprovet från råtta.

I det depressiva urinprovet från råtta, 22 metaboliter av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)upptäcktes och karakteriserades. En prototypförening, 8-epilogansyra, upptäcktes i patologisk råtturin. Andra metaboliter överensstämde med de som hittades i normal råtturin, inklusive sulfaterade metaboliter (1, 2, 3, 8, 10 och 16), metylerade metaboliter (6, 11, 19 och 22), metoxylerade metaboliter (13 och 14) av HT och CA, och teaglykoner av iridoidglykosider (25 och 26).

3.4.2. Karakterisering av metaboliterna av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)i normal och CUS-råttavföring

I denna studie, endast en metabolit (förening 20, 3-HPP) av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)identifierades i normal avföring från råtta. De flesta PhG bröts först ned till CA och genomgick följaktligen ytterligare metabolism till dess viktigaste mikrobiella metabolit, 3-HPP. I det fekala provet från CUS-råttan karakteriserades tre metaboliter preliminärt, inklusive sulfaterad 3-HPP (förening 16) och sulfaterad HT (förening 2 och 3).

3.4.3. Skillnader mellan in vivo metaboliter av CTE hos normala och CUSråttor

Efter oral administrering av CTE(Cistanche tubulosa extrakt), visade in vivo-metaboliterna uppenbara skillnader hos friska och depressiva modellråttor. 21 metaboliter (förening 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17 och 19–26) upptäcktes i både friska och CUS-råttaprover. Förening 23 (deglykosylerad geniposidinsyra) identifierades endast i friska råttprover, medan föreningar 4 (HT), 7 (8-epilogansyra), 15 (3, 4-dihydroxibensenpropionsyra) och 18 ({{ 19}}HPP-glukuronidkonjugering) detekterades endast i CUS-modellråttprover. Sammanfattningsvis upptäcktes prototypbeståndsdelar endast i CUS-råttor, medan fler fas II-metaboliter upptäcktes i normala råttor.

4. Diskussion

I denna studie användes tre in vitro-inkubationsmodeller inklusive magsaft, tarmjuice, normal och CUS-tarmmikrobiota från råttor oberoende och sekventiellt för att undersöka den gastrointestinala metaboliska profilen för CTE(Cistanche tubulosa extrakt)in vitro. Det visade sig att PhGs och iridoidglykosider i CTE(Cistanche tubulosa extrakt)metaboliserades lätt till sina sekundära glykosider och aglykoner av CUS-inducerad depressiv tarmmikrobiota från råtta. Efter det, in vivo metabolism av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)i normala och CUS-råttor verifierades också. De föreslagna metabola vägarna för CTE(Cistanche tubulosa extrakt)hos friska och CUS-inducerade depressiva råttor visas i Fig. 4. PhGs, såsom echinakosid och acteosid, metaboliserades till HT och CA, och CA genomgick ytterligare metabolism till sin huvudsakliga mikrobiella metabolit, 3-HPP. HT, CA och 3-HPP metaboliserades sedan till deras sulfaterade, metylerade och metoxylerade metaboliter. Iridoidglykosider inklusive geniposidinsyra, kankanosid A och kankanosid N metaboliserades till sina aglykoner genom deglykosylering. Dessa visade vidare att PhG och iridoidglykosider i CTE(Cistanche tubulosa extrakt)metaboliserades lätt till sekundära glykosider och aglykoner i CUS-råttor. Dessa metaboliter uppvisar normalt bättre intestinal absorption och biotillgänglighet för att ytterligare absorberas i blodet för att utöva biologisk aktivitet [16-18]. Det är värt att notera att isomerisering var utbredd för PhGs i mag-tarmkanalen, relevanta metaboliter identifierades efter att ha jämförts med UPLC-retentionstiden för deras prototypföreningar baserat på en optimerad idealisk UPLC-gradientprofil.

Koffeinsyra var den primära nedbrytningsprodukten av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)av depressiv patologisk tarmmikrobiota från råtta. Tidigare publikationer rapporterade att koffeinsyra ger antidepressiva effekter i tvångssimtestet på möss. Både hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF) mRNA-nivå i frontal cortex och TrkB mRNA-nivå i theamygdala minskade signifikant efter tvångssimtestet, och den tidigare minskningen hämmades signifikant av koffeinsyra [19]. Hydroxytyrosol var aglykonen av PhG, som skyddar neurogenes och kognitiv funktion genom att förhindra stressinducerad nedreglering av neuralt protein BDNF [20]. Det är därför nödvändigt att ägna mer uppmärksamhet åt vissa bioaktiva metaboliter (dvs. HT och CA) som transformeras av tarmmikrobiota efter oral administrering.

Dessutom ger föreliggande fynd bevis för att i depressiverat tarmmikrobiota var den metaboliska förmågan att generera sekundära glykosider och aglykoner markant svagare än den onormala tarmmikrobiota från råtta. Anledningen är sannolikt att tillskrivas depressionsinducerade strukturella förändringar av tarmmikrobiotan, vilket leder till minskad aktivitet av metaboliska enzymer som produceras av tarmmikrobiota [21]. Intressant nog visade en tidigare studie att phylum Bacteroidetes kodade för de vanligaste generna för glykosidhydrolas och polysackaridlyas för glykosidhydrolys och klyvning av komplexa kolhydrater med en elimineringsmekanism [22]. Specifikt Bacteroides spp. inklusive B. caccae, B. dorei, B. finegoldii,B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis och B. xylanisolvener visade ett dominerande totalt antal gener som kodar för GH och PL. Parabacteroides distasonis har också samma egenskaper [22]. Våra tidigare studier bekräftade att 28-dag kronisk oförutsägbar stressstimulering minskade den relativa förekomsten av släktena Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas och Weissella, medan den ökade Ruminococcus och Deinococcus hos råttor [4]. Det är anmärkningsvärt att Bacteroides och Parabacteroides var de två vanligaste mikrobiella taxaerna som stod för cirka 20 procents relativa överflöd hos normala råttor. Efter CUS-behandling sjönk den relativa mängden Bacteroides och Parabacteroides kraftigt till cirka 5 procent hos depressiva modellråttor. Därför kommer detta oundvikligen att leda till reducering av det totala antalet GH- och PL-enzymer hos CUS-råttor, och stör ytterligare den deglykosylerade reaktionen av CUS-depressiv tarmmikrobiota efter oral administrering av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)hos modellråttor.

5. Sammanfattning

I den aktuella studien etablerades UPLC-Q-TOF-MS-tekniken och användes för att screena och identifiera metaboliter avCistanche tubulosaextrakti normala och CUS-depressiva råttor in vitro och in vivo. Resultaten visade att CTE(Cistanche tubulosa extrakt)metaboliserades till aglykoner och nedbrytningsprodukter av PhG och iridoidglykosider av både frisk och deprimerad tarmmikrobiota från rat. Efter oral administrering av CTE(Cistanche tubulosa extrakt), fas II-metaboliter av aglykoner och nedbrytningsprodukter av PhG och iridoidglykosider påträffades huvudsakligen i råtturin. Den metaboliska förmågan att generera sekundära glykosider och aglykoner i depressiv ratintestinal mikrobiota var mycket svagare än den i normala råttors tarmmikrobiota, vilket tillskrevs de störda glykosidhydrolaser som produceras av tarmmikrobiota i CUS-deprimerade råttor. Denna studie ger ett nytt perspektiv för de senare utveckling av CTE(Cistanche tubulosa extrakt)som ett potentiellt antidepressivt medel.

Erkännanden

Detta arbete stöddes av anslag från Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram (2017YFC1702400).

Bilaga A. Kompletterande uppgifter

Kompletterande data till den här artikeln finns online på HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

Från: ' In vitro och in vivo metabolism avCistanche tubulosa extrakti normala och kroniska oförutsägbara stressinducerade depressiva råttor' byYang Li, et al

---Journal of Chromatography B 1125 (2019) 121728

Referenser

[1] Chinese Pharmacopoeia Commission, The Pharmacopeia of the People's Republic of China, 2015 utg., China Medical Science Press, Beijing, Kina, 2015, sid. 135 Del I.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Analys av kemiska beståndsdelar i Cistanche-arter, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: en översikt över dess kemi, farmakologi och farmakokinetiska egenskaper, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Antidepressiva-liknande effekter avCistanche tubulosa extraktpå kroniska oförutsägbara stressråttor genom återställande av tarmmikrobiota homeostas, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Gut-brain axis: hur mikrobiomet påverkar ångest och depression, Trends Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Senaste utvecklingen för att förstå tarmmikrobiotans roll i hjärnans hälsa och sjukdomar, Ann. NY Acad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Variationer i tarmmikrobiota och fekal metabolisk fenotyp associerad med depression genom 16S rRNA-gensekvensering och LC/ MS-baserad metabolomik, J. Pharm. Biomed. Anal. 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Transferring the blues: depression-associated gut microbiota induces neurobeteendeförändringar hos råttan, J. Psychiatr. Res.. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Human gastrointestinal metabolism of the Cistanches Herba vattenextrakt in vitro: klargörande av den metaboliska profilen baserat på omfattande metabolitidentifiering i magsaft, tarm juice, mänskliga tarmbakterier och tarmmikrosomer, J. Agric. Food Chem. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Identifiering av echinakosidmetaboliter producerade av mänskliga tarmbakterier med hjälp av ultrapresterande vätskekromatografi/kvadrupol-tids-flight-masspektrometri, J. Agric. Food Chem. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Screening och identifiering av tre typiska fenyletanoidglykosidermetaboliter från Cistanches Herba av mänskliga tarmbakterier med hjälp av UPLC/Q-TOF-MS, J. Pharm. Biomed. Anal. 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Snabb screening och identifiering av skillnaderna mellan metaboliter av Cistanche deserticola och C. tubulosa vattenextrakt i råttor med UPLC- Q-TOF-MS kombinerad mönsterigenkänningsanalys, J. Pharm. Biomed. Anal. 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, Karakterisera systematiskt metaboliterna av echinacoside och acteosid från Cistanche tubulosa i råttplasma, galla, urin och avföring baserat på UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr. 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, An approach to identifiing sequential metabolites of en typisk fenyletanoidglykosid, echinakosid, baserad på vätskekromatografi-jonfälla-tid för
flygmasspektrometrianalys, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolism av echinacoside, en bra antioxidant, i råttor: isolering och identifiering av dess gallmetaboliter, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Förstå de molekylära mekanismerna för samspelet mellan växtbaserade läkemedel och tarmmikrobiota, Med. Res. Upps. 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Absorption och disposition av ginsenosider efter oral administrering av Panax notoginseng-extrakt till råttor, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Interaktioner mellan tarmmikrobiota med funktionella livsmedelskomponenter och nutraceuticals, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Koffeinsyra dämpar minskningen av kortikalt BDNF-mRNA-uttryck som induceras av exponering för forcerad simstress hos möss, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115–121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Maternal hydroxytyrosol administration förbättrar neurogenes och kognitiv funktion i prenatalt stressade avkomma, J. Nutr. Biochem. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Inverkan av tarmmikrobiota på läkemedelsmetabolism och toxicitet, Expertutlåtande. Drug Metab. Toxicol. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, Överflödet och variationen av kolhydrataktiva enzymer i människans tarmmikrobiota, Nat. Rev. Microbiol. 11 (2013) 497–504.