Abstrakt

Föreliggande uppfinning beskriver enCistanche-extrakt för att förbättra bentätheten (BMD). I utdragettotalt innehåll av echinakosid och akteosid (verbascosid)är>25 vikt%. Extraktet framställs genom att utföraextraktion av destillerat vattenavråpulver avCistanche tubulosa, följt avfiltrering, centrifugeringav filtratet,koncentration, vätska-vätskeextraktion, koncentration med borttagning av föroreningar, utspädning, efterbehandling, och sedanslutkoncentration och torkningför att erhålla Cistanche-extraktet.

 

 

Cistanche-extraktprocess

I Cistanche-extraktet för att förbättra benmineraldensiteten enligt uppfinningen,totalt innehåll av echinakosid och akteosidär25–30 viktprocent(exklusive 25 vikt%), och extraktet är också rikt påshikiminsyraliksomkomponenter av fenylpropionsyratypochkomponenter av alkaloidtyp, vilket gör det möjligtstabilt utöva en bentäthetsförbättrande effekt.

 

Anspråk

1. Beredningsmetod

En metod för framställning av ett Cistanche-extrakt för att förbättra benmineraltätheten, kännetecknad av att den innefattar följande steg:

förkrossandeCistanche tubulosaatt få råpulver avCistanche tubulosa;

tillsätter destillerat vatten till det råa pulvret avCistanche tubulosaför extraktion, filtrering, centrifugering av filtratet och koncentrering för att erhålla en koncentrerad lösning avCistanche tubulosa;

extrahera den koncentrerade lösningen avCistanche tubulosakoncentrering av den nedre extraktionsfasen för att avlägsna föroreningar och spädning för att erhålla en laddningslösning;

efterbehandling av laddningslösningen, följt av koncentrering och torkning för att erhålla Cistanche-extraktet.

2. Förhållande mellan material och vatten

2. Förfarande enligt krav 1, varvid förhållandet mellan massa och volym av råpulvret avCistanche tubulosatill destillerat vatten är1 : (15–25).

3. Extraktionstemperatur

2. Förfarande enligt krav 1, varvid extraktionstemperaturen för destillerat vatten är60–100 grader.

4. Förhållande under vätske-vätskeextraktion

2. Förfarande enligt krav 1, varvid under extraktion av den koncentrerade lösningen, volymförhållandet av den koncentrerade lösningen avCistanche tubulosatill extraktion lösningsmedel är1 : (1–5).

5. Extraktionslösningsmedel

5. Förfarande enligt krav 4, varvid extraktionslösningsmedlet innefattar åtminstone en avpetroleumeter, etylacetat, n-hexan eller cyklohexan.

6. Efterbehandlingsprocess

2. Förfarande enligt krav 1, varvid efterbehandlingen av laddningslösningen innefattar att: passera laddningslösningen genom enmakroporöst harts, och sedan elueras sekventiellt meddestillerat vattenoch enetanollösning.

7. Elueringsvolymer

7. Förfarande enligt krav 6, varvid volymförhållandet mellan destillerat vatten och det makroporösa hartset är(5–10) : 1och volymförhållandet mellan etanollösningen och det makroporösa hartset är(3–9) : 1.

8. Utdraget

8. Cistanche-extrakt för att förbättra benmineraldensiteten, kännetecknat av att det framställs enligt något av kraven 1-7.

9. Aktivt markörinnehåll

9. Cistancheextrakt enligt krav 8, varvid det totala innehållet av echinakosid och akteosid är25–30 viktprocent, exklusive 25 vikt%.

10. Ansökan

10. Användning av Cistanche-extraktet enligt något av kraven 8-9 vid framställning av en produkt för att förbättra benmineraltätheten, varvid koncentrationen av Cistanche-extraktet i produkten är12,5–25 ug/ml.

 

Tekniskt område

Föreliggande uppfinning hänför sig till området förmedicinska formuleringar, och relaterar specifikt till enCistanche-extrakt för att förbättra bentätheten, dessberedningsmetod, ochapplikationer.

Bakgrund

[0002] Cistanche avser den torkade köttiga stjälken med fjällblad från Orobanchaceae-växternaCistanche deserticola YC MaellerCistanche tubulosa (Schenk) Wight. Cistanche har flera aktiviteter som t.eximmunreglering, antiinflammatorisk, mot trötthet, antioxidant, neuroprotektiva, ochstöd för reproduktionssystem.

Fenyletanoidglykosider (PhGs)-medechinakosidochakteosid (verbaskosid)är de viktigaste doktoranderna i Cistanche - är viktiga beståndsdelar.Echinacosidehar visat sig ha effekt påförbättra benmineraltätheten. Vi fann dock att den bentäthetsförbättrande effekten av Cistanche-extrakt ärinte enbart korrelerad med echinakosidinnehåll. Helt enkelt kontrollera echinacoside-innehålletinte kan säkerställaatt utdraget kommerstabiltutöva en bentäthetsförbättrande effekt. Därför är det avgörande att utveckla ett Cistanche-extrakt och en beredningsmetod som kanstabiltge den önskade bentäthetsstödjande effekten.

[0003] Patentansökan för kinesisk uppfinningCN102441040Abeskriver en beredningsmetod för totala fenyletanoidglykosider från Cistanche via pulverisering, extraktion, makroporös hartsadsorption, eluering, koncentration, etc. Under svagt sura förhållanden (pH 2–4) förbättras stabiliteten hos Cistanche fenyletanoidglykosider avsevärt, och den resulterande andelen totala ekinaglykosider i en kombination av > och agerande glykosid. 90 %. Det verifierar dock inte om produkten kanstabiltförbättra bentätheten.

Kinesisk uppfinning patentansökanCN105111255Abeskriver en metod för extraktion och separation av echinakosid och acteosid från Cistanche, med användning av 75 % etanol som extraktionslösningsmedel, AB-8 makroporöst harts som packningsmaterial och 55 % etanoleluering, vilket ger ett Cistanche-extrakt med echinakosid > 25 %, akteosid > 8 %, och totalt PhGs > 8 %. Det kan dock fortfarande inte garantera enstabilbentäthetsförbättrande effekt.

 

Sammanfattning av uppfinningen

[0004] Att utveckla ett Cistanche-extrakt och beredningsmetod som kanstabiltstödjer förbättrad bentäthet, tillhandahåller uppfinningen:

Första aspekten: Beredningsmetod

En beredningsmetod för ett Cistanche-extrakt för att förbättra bentätheten, innefattande:

förkrossandeCistanche tubulosaför att erhålla råpulver;

extrahera det råa pulvret med destillerat vatten, filtrering, centrifugering och koncentrering för att erhålla en koncentrerad lösning;

utföra extraktion; koncentrera den nedre fasen för att avlägsna föroreningar; spädning för att erhålla en laddningslösning;

efterbehandla laddningslösningen, koncentrera och torka för att erhålla Cistanche-extraktet.

I en utföringsform leds råpulvret genom a40-meshsikt.

[0006] I en utföringsform är mass-till-volymförhållandet mellan råpulver och destillerat vatten1 : (15–25).

[0007] I en utföringsform är förhållandet mellan massa och volym1 : 20.

[0008] I en utföringsform är extraktionstemperaturen60–100 grader.

[0009] I en utföringsform är extraktionstemperaturen80 grader.

[0010] I en utföringsform utförs extraktion1–2 gånger, 1 timme varje gång.

[0011] I en utföringsform utförs filtrering genom en80-meshfiltrera.

[0012] I en utföringsform är centrifugeringshastigheten3000–4000 r/minoch tiden är3–9 min.

[0013] I en utföringsform är centrifugeringshastigheten3500 r/minoch tiden är5 min.

[0014] I en utföringsform koncentreras filtratet efter centrifugering vid70 gradertill18%–28%av den ursprungliga volymen.

[0015] I en utföringsform, under extraktion av den koncentrerade lösningen, är volymförhållandet mellan koncentrerad lösning och extraktionslösningsmedel1 : (1–5).

[0016] I en utföringsform är förhållandet1 : 3.

I en utföringsform innefattar extraktionslösningsmedlet minst en avpetroleumeter, etylacetat, n-hexan eller cyklohexan.

[0018] I en utföringsform utförs extraktion sekventiellt med användning avpetroleumeterföljt avetylacetat.

I en utföringsform betyder "koncentration med avlägsnande av föroreningar" att koncentrera den nedre extraktionsfasen till en pasta, lösa den i300 ml 50 viktprocent vattenhaltig etanolför att ta bort orenheter och anpassa sig till1,0–1,5 g oren ört per mlsom laddningslösning.

[0020] I en utföringsform är laddningslösningens koncentration1,0–1,5 g oren ört/ml vatten.

[0021] I en utföringsform innefattar efterbehandling att laddningslösningen passerar igenommakroporöst harts, och sedan elueras sekventiellt meddestillerat vattenoch enetanollösning.

[0022] I en utföringsform är laddningsflödeshastigheten genom det makroporösa hartset1–5 ml/min.

[0023] I en utföringsform är hartsetAB-8 makroporöst hartsmed en hartsvolym av0.93 L.

[0024] I en utföringsform är volymförhållandet mellan destillerat vatten och harts(5–10) : 1och volymförhållandet mellan etanollösning och harts är(3–9) : 1.

[0025] I en utföringsform är volymförhållandet mellan destillerat vatten och harts7 : 1och förhållandet mellan etanollösning och harts är6 : 1.

[0026] I en utföringsform är etanollösningen80 % (vikt/vikt) vattenhaltig etanol.

Andra aspekten: utdraget

[0027] Uppfinningen tillhandahåller vidare ett Cistanche-extrakt framställt enligt ovanstående metod.

[0028] I en utföringsform är det totala innehållet av echinakosid och akteosid25–30 viktprocent, exklusive 25 vikt-%.

Tredje aspekten: Användning

[0029] Uppfinningen tillhandahåller vidare användning av Cistanche-extraktet vid framställning av produkter för att förbättra benmineraldensiteten, där extraktkoncentrationen i produkten är12,5–25 ug/ml.

 

Fördelar/nyttiga effekter

Jämfört med känd teknik har uppfinningen följande fördelaktiga effekter:

Cistanche-extraktet innehåller25–30 viktprocenttotal echinakosid och acteosid, och är rik påshikiminsyra, komponenter av fenylpropionsyratyp, alkaloider, ochfettsyror, vilket gör det möjligtstabiltstödja förbättring av bentätheten.

Inom12,5–25 ug/mlkoncentrationsområde, extraktet främjar spridning avMC3T3-E1celler med utmärkta proliferativa effekter.

Extraktet visar samma dosrelaterade trend för att främja cellproliferation ochALP-aktivitetoch kan stabilt främja spridning och differentiering. För att främja osteoblastmineralisering visar den en bättre effekt än den positiva kontrollen17 -östradiol.

Extraktet stimulerar osteoblastspecifika transkriptionsfaktorerRunx2ochOsx, förbättrar osteoblastdifferentiering och främjar uttryck av osteogena markörerOPNochOCN, och därigenom främja benbildning. Det ökar ocksåBmp2 mRNAuttryck för att förbättra osteoblastdifferentiering och ny benbildning genom att aktiveraBMP/Smad väg; dessutom genom att regleraLrp5 mRNA, Lrp6 mRNA, ochWnt3 mRNA, aktiveras denWnt/ -catenin signalering, påverkar nedströms transkriptionsfaktoruttryck och främjar osteoblastdifferentiering och benbildning.

Beredningsmetoden ger ett extrakt som innehåller fenyletanoidglykosider (echinakosid och akteosid), shikiminsyra och fenylpropionsyror, alkaloider och fettsyror. Dessa komponenter tillsammans tillåter extraktet att uppvisa konsekvent dosberoende i proliferation, differentiering och mineralisering, vilket möjliggör stabila bentäthetsstödjande effekter.

 

Kort beskrivning av ritningarna

[0035] Fig . 1: Effekt av extrakt (exempel 1) på MC3T3-E1 cellproliferation
Fig. 2: Effekt av extrakt (exempel 2) på MC3T3-E1 cellproliferation
Fig. 3: Effekt av extrakt (exempel 3) på MC3T3-E1 cellproliferation
Fig. 4: Effekt av extrakt (exempel 1) på ALP-aktivitet
Fig. 5: Effekt av extrakt (exempel 2) på ALP-aktivitet
Fig. 6: Effekt av extrakt (exempel 3) på ALP-aktivitet
Fig. 7: Foton av Alizarin Red-färgning av osteoblastmineralisering (exempel 2)
Fig. 8: Kvantitativa resultat av osteoblastmineralisering (exempel 2)
Fig. 9–12: Effekter av exempel 2 på Runx2, Osx, Opn, Ocn mRNA-uttryck
Fig. 13: Effekt av exempel 2 på Bmp2-mRNA-uttryck (BMP/Smad)
Fig. 14–16: Effekter av exempel 2 på Lrp5, Wnt3, Lrp6 mRNA-uttryck (Wnt/-catenin)
Fig. 17–18: Effekter av exempel 2 på Osx- och RUNX2-proteinuttryck

 

Detaljerad beskrivning/utföranden

Exempel 1

[0036] En beredningsmetod innefattar:

förkrossandeCistanche tubulosapasserar genom en 40-mesh sikt för att erhålla200 gråpulver;

extrahera meddestillerat vatten vid 5× massa(som beskrivits), extrahering kl75 graderför2 gånger, 1 h vardera, koncentrerar sig kl70 gradertill ett koncentrationsförhållande på1 : 2.2för att erhålla en koncentrerad lösning;

tillsats av absolut etanol till den koncentrerade lösningen för graderad etanolfällning med slutliga etanolmasskoncentrationer av20%, 40%, 60%, 80%, utfällning kl5 grader i 24 timmaruppsamling av supernatanten efter80 vikt%etanolutfällning;

koncentrera och torka kl70 graderför att erhålla Cistanche-extraktet, med ett utbyte av20.75%.

Exempel 2

[0037] En beredningsmetod innefattar:

förkrossandeCistanche tubulosaatt få240 gråpulver;

extrahering med destillerat vatten, filtrering, centrifugering och koncentrering för att erhålla en koncentrerad lösning;

extrahera den koncentrerade lösningen; koncentrera den nedre fasen för att avlägsna föroreningar; spädning för att erhålla en laddningslösning;

efterbehandling av laddningslösningen; koncentrera och torka kl70 graderför att erhålla extraktet, med ett utbyte av19.69%.

Råpulvret passerar genom en 40-mesh sikt.
Mass-till-volymförhållandet mellan råpulver och destillerat vatten är1 : 20.
Extraktionstemperaturen är80 grader.
Extraktion utförs1–2 gånger, 1 h vardera.
[0042] Filtrering sker genom en80-meshfiltrera.
Centrifugering är3500 r/min i 5 min.
Koncentration efter centrifugering: koncentrera vid70 gradertill20%av initial volym.
[0045] Under extraktion är volymförhållandet mellan koncentrerad lösning och lösningsmedel1 : 3.
Extraktion utförs sekventiellt medpetroleumeterochetylacetat.
Den undre fasen koncentreras till en pasta och löses i300 ml 50 viktprocent vattenhaltig etanolför att ta bort orenheter.
[0048] Koncentration av laddningslösning:1,0 g oren ört/ml vatten.
[0049] Efterbehandling: passera genom makroporöst harts, eluera med destillerat vatten och sedan etanollösning.
[0050] Flödeshastighet genom harts:3 ml/min.
[0051] Harts:AB-8hartsvolym0.93 L.
[0052] Volymförhållande destillerat vatten till harts:7 : 1. Etanol-lösning-till-harts-förhållande:6 : 1.
[0053] Etanollösning:80% (w/w)vattenhaltig etanol.

 

Klicka för att veta mer information om cistanche factory

Exempel 3

[0053] En beredningsmetod innefattar:

förkrossandeCistanche tubulosapasserar genom en 40-mesh sikt för att erhålla120 gråpulver;

extrahera med12× massaav50 viktprocent vattenhaltig etanol, utvinning kl70 grader, 2 gånger, 1 h vardera, koncentrerar sig kl70 gradertill ett förhållande av1 : 2.5för att erhålla en koncentrerad lösning;

tillsätt vatten för att justera koncentrationen till0,2 g oren ört/ml vatten, centrifugering kl3500 r/min i 5 minta supernatanten som laddningslösning;

passerar genom makroporöst harts; sekventiell eluering med destillerat vatten och etanollösning; uppsamling av etanolelueringen och koncentrering/torkning vid70 graderför att erhålla extraktet med ett utbyte av24.30%.

[0054] Harts:HPD750hartsvolym0.93 L.
[0055] Förhållande mellan destillerat vatten och harts:3 : 1. Etanol-lösning-till-harts-förhållande:4 : 1.
[0056] Etanollösning:30% (w/w)vattenhaltig etanol.

 

Prestandatestning

1.1 Cellproliferationsanalys

[0057] Osteoblaster är de huvudsakliga funktionella cellerna som är ansvariga för benbildning, vilket inbegriper proliferation av pre-osteoblaster, produktion av benmatris och slutlig differentiering. DeMC3T3-E1cellinje används vanligtvis för att studera osteogen aktivitet. Osteoblastdifferentiering involverar proliferation, differentiering och mineralisering som manifesteras som ökat pre-osteoblastantal, mognad till osteoblaster och bildning av ny benmatris.

Alkaliskt fosfatas (ALP)är ett osteoblastfenotyprelaterat protein som kan detekteras under cellproliferation och matrismognad och är en vanligen använd tidig markör för osteoblastdifferentiering.

Genom att utvärdera MC3T3-E1-proliferation och ALP-aktivitet jämfördes därför den osteogenesfrämjande aktiviteten hos extrakten framställda i exempel 1–3.

MC3T3-E1-celler återupplivades och passerades. Efter stabilisering digererades cellerna, centrifugerades och samlades upp. Celldensiteten justerades så att varje 100 μL innehöll 5×1035 x 10^35×103 celler och såddes i en 96-brunnars platta. Efter odling över natten ersattes mediet med komplett medium innehållande exempel 1-3 extrakt i koncentrationer av6,25, 12,5, 25 och 50 ug/ml, eller innehåller0,1 M östradiol(positiv kontroll), eller enbart medium (blankkontroll), och odlas för48 h. Under ljusskyddade förhållanden tillsattes MTT-stamlösning (10%–20% av brunnsvolymen), inkuberades för4 hi en CO2-inkubator, medium avlägsnat, och200 μL DMSOtillsatt för att lösa formazan. OD-värden mättes vid490 nm.

Resultat: Fig. 1 (Exempel 1), Fig. 2 (Exempel 2), Fig. 3 (Exempel 3).

[0058] Cellproliferationshastighet (%)=OD(Exempel 1–3)−OD(Blank)OD(Blank)×100%\\frac{OD(\\text{Exempel 1–3}) - OD(\\text{Blank})}{OD(\\text{Blank})} \\gånger 100)\\%OD(Example 1–3)−OD(Blank)​×100 %

[0059] Som visas i fig . 1–3 främjade den positiva kontrollen MC3T3-E1-proliferation. Exempel 1 främjade proliferation vid 6,25, 12,5 och 25 ug/ml; proliferationshastigheten vid 12,5 ug/ml var 1,4 gånger den för den positiva kontrollen, men utan signifikant skillnad (P > 0,05). Exempel 2 främjade proliferation vid 6,25, 12,5, 25 och 50 ug/ml; vid 12,5, 25 och 50 ug/ml var dess effekter överlägsna den positiva kontrollen (P < 0,01 eller P < 0,001), med proliferationshastigheter 2,55×, 3,46× och 2,59× av den positiva kontrollen. Exempel 3 främjade proliferation vid 6,25, 12,5, 25 och 50 ug/ml; vid 12,5, 25 och 50 ug/ml var den överlägsen den positiva kontrollen (P < 0,01 eller P < 0,001), med proliferationshastigheter 1,40x, 1,76x och 0,93x av den positiva kontrollen. Detta indikerar att exempel 2 hade den bästa effekten på att främja MC3T3-E1-proliferation.

1.2 ALP-aktivitetsanalys

[0060] ALP-aktiviteten mättes med användning av ett ALP-analyskit. Stamkoncentrationen av p-nitrofenol var 10 mM, och standardkurvans koncentrationer var 0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12, 0,16, 0,2 och 0,25 mM, framställda genom gradientutspädning med detektionsbuffert.

För varje provbrunn i en 96-brunnars platta tillsattes 49 μL detektionsbuffert, 1 μL protein extraherat från de behandlade MC3T3-E1-cellerna (från avsnitt 1.1) och 50 μL kromogent substrat (läggs till sist). Reaktionen fortsatte i 30 minuter i inkubatorn skyddad från ljus, avslutades genom att tillsätta 100 μL stopplösning och absorbansen mättes kl.405 nm. ALP-aktivitet beräknades från standardkurvan.

Resultat: Fig. 4 (Exempel 1), Fig. 5 (Exempel 2), Fig. 6 (Exempel 3).

[0061] ALP-aktivitet (U/L)=(relativ molär koncentration av protein) × 1000 × 100 / 30
(1000 för molär enhetsomvandling; 100 för total reaktionsvolym; 30 för 30 min reaktionstid)

ALP är en tidig markör för MC3T3-E1-differentiering. Fig. 4–6 visar att den positiva kontrollen ökade ALP-aktiviteten. Exempel 1 främjade inte ALP-aktivitet. Exempel 2 ökade ALP-aktivitet vid 12,5, 25 och 50 ug/ml; vid 25 och 50 ug/ml var skillnaderna jämfört med blankt signifikanta (P < 0,01). Exempel 3 ökade ALP-aktiviteten vid 12,5 och 25 ug/ml (P < 0,001), men med ökande koncentration minskade förstärkningen. Detta indikerar att endast exempel 2 och 3 ökade ALP-aktivitet och stödde differentiering.

[0062] Sammantaget visade endast exempel 2 dospositiv korrelation i både MC3T3-E1-proliferation och ALP-aktivitet vid 12,5 och 25 ug/ml. Exempel 3 visade dospositiv korrelation för proliferation men dosnegativ korrelation för ALP. Jämförelsevis är exempel 2 mer lämpligt för att förbättra benmineraltätheten.

1.3 Mineralisering (Alizarinröd färgning) av exempel 2

[0063] Eftersom exempel 2 visade den bästa aktiviteten och doskorrelationen jämfört med exempel 1 och 3, utfördes mineraliseringsexperiment för att ytterligare utvärdera dess effekt.

[0064] MC3T3-E1-celler behandlades efter 72 timmars odling med exempel 2-extrakt kl.12,5, 25 och 50 ug/ml, inkuberad vid 37 grader för14 days(baserat på kalciumknölbildning), med medium förändringar varannan dag. Alizarin Red-färgning utfördes: medium avlägsnades, celler fixerade med 10 % neutralt formalin (300 μL/brunn) i 30 minuter, sköljdes, färgades med 0,1 % Alizarin Red (300 μL/brunn) i 30 minuter (rumstemperatur, skyddad från ljus) och tvättades tills ingen röd färg återstod. Bilder togs. Sedan tillsattes 10 % cetylpyridiniumkloridlösning (400 μL/brunn) och skakades i 1 timme för att lösa upp förkalkade knölar. Den lösta lösningen överfördes till en 96-brunnars platta (100 μL/brunn) och OD mättes vid562 nmför att beräkna mineraliseringshastigheten. Foton: Fig. 7; kvantitativa resultat: Fig. 8.

[0065] Mineraliseringshastighet (%)=OD(Exempel 2)−OD(Blank)OD(Blank)×100%\\frac{OD(\\text{Exempel 2}) - OD(\\text{Blank})}{OD(\\text{Blank})} \\times 100\\%OD(Blank)OD(ExampleBlank)OD(ExampleBlank)

[0066] Fig . 7 visar att antalet kalciumknölar ökade sekventiellt med koncentration kontra blank. Fig . 8 indikerar att exempel 2 främjade mineralisering på ett koncentrationsberoende sätt vid 12,5, 25 och 50 ug/mL, med den starkaste effekten vid 50 ug/mL, signifikant bättre än den positiva kontrollen (P < 0,001). Eftersom mineraliserade knölar representerar det sista steget av osteoblastdifferentiering, bekräftar dessa resultat ytterligare den bentäthetsstödjande effekten av exempel 2 och visar dess stabila aktivitet. Exempel 2 var överlägset östradiol, vilket indikerar potentiellt värde för benhälsoprodukter.

Genuttryck och vägmekanism (exempel 2)

[0067] Exempel 2-extrakt (12,5, 25, 50 ug/ml) applicerades på MC3T3-E1-celler under 3 dagar. RNA-extraktion, kvantifiering, omvänd transkription (20 μL system; 800 ng RNA-ingång) och qRT-PCR utfördes för att kvantifiera relativa uttrycksnivåer avRunx2 mRNA, Osx mRNA, Opn mRNA och Ocn mRNA. Resultat: Fig. 9–12.

[0068] Runx2 och Osx är viktiga nedströmsregulatorer i BMP-signalering, vilket inducerar osteoblastdifferentiering. Runx2 är viktigt i det tidiga engagemangsstadiet, medan Osx fungerar i terminaldifferentiering. OPN och OCN är viktiga indikatorer för osteoblastaktivitet och vävnadsmineralisering. Fig . 9–12 visar att exempel 2 ökade det relativa uttrycket av dessa markörer, vilket stöder förbättrad osteoblastdifferentiering och benbildning.

Exempel 2 uppregleratBmp2 mRNA(Fig. 13), som indikerar aktivering avBMP/Smad väg, som stöder osteoblastdifferentiering och ny benbildning.

Exempel 2 ökade relativt uttryck avLrp5 mRNA, Lrp6 mRNA och Wnt3 mRNA(Fig. 14–16), som stöder aktivering avWnt/ -catenin signalering, som är nära relaterat till osteoblastproliferation, differentiering och benbildning.

Proteinuttryck (exempel 2)

Western blot-analys visade att exempel 2 ökadeOsxochRUNX2proteinuttryck (Fig. 17–18), vilket indikerar reglering på både transkriptionell och translationell nivå för att främja osteoblastdifferentiering.

Dessa aktivitetstester visar att exempel 2 gav den bästa proliferationsfrämjande effekten och var det enda med konsekvent doskorrelation för både proliferation och ALP. Exempel 2 var också överlägset östradiol i att främja MC3T3-E1-proliferation och mineralisering, med jämförbara differentieringseffekter, vilket tyder på optimal bentäthetsstödjande potential.

 

Testning av kemisk sammansättning

6.1 Innehåll av fenyletanoidglykosider

[0076] Med hänvisning till "Cistanche"-analysmetoden i den kinesiska farmakopén, mättes echinakosid- och acteosidinnehåll i exempel 1-3 (resultaten visas i tabell 1). Baserat på echinakosid, akteosid och totalt PhG var trenden konsekvent: Exempel 3 > Exempel 1 > Exempel 2, och akteosid i Exempel 3 var 3,85× och 4,27× den i Exempel 1 respektive 2. Kombination av aktivitets- och innehållsresultat indikerar att echinakosid och akteosid inte direkt bestämmer de osteogena effekterna.

 

Tabell 1. Innehåll av Echinakosid och Acteosid i Cistanche-extrakt (%)

Exempel (exempel)	Echinacoside (%)	Akteosid / Verbascoside (%)	Totalt (%)
Exempel 1	28.68	1.63	30.31
Exempel 2	26.27	1.47	27.74
Exempel 3	30.39	6.27	36.66

 

6.2 Andra komponenter (UPLC/Q-TOF/MS)

[0078] UPLC/Q-TOF/MS användes för att jämföra kemiska komponenter bland exempel 1–3. Svarsvärdena visas i tabell 2.

[0079] Förutom echinakosid och akteosid innehöll exempel 2 ytterligareshikiminsyra och komponenter av fenylpropionsyratyp, och ävenalkaloider. Jämfört med exempel 1 och 3 hade exempel 2 11 fenylpropionsyra/shikiminsyra-relaterade komponenter med de högsta svaren, inklusive:

Tabell 2. UPLC/Q-TOF/MS svarsvärden för nyckelkomponenter i Cistanche-extrakt (exempel 1–3)

注:原表为"响应值(svarsvärde)";我保留为纯数值,不加单位(与图表一致).表内刄为2绾Shikiminsyra och fenylpropionsyraderivat(莽草酸及苯丙酸类)与 Alkaloider(生物碱).

A. Shikiminsyra & fenylpropionsyraderivat

Förening	Exempel 1	Exempel 2	Exempel 3
Isodanfenolsyra B (异丹酚酸B)	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
p-hydroxifenylpropionsyra (对羟基苯丙酸)	2,897,237.374	6,144,507.902	1,139,582.918
Shikiminsyra (莽草酸)	6,539,932.014	8,883,034.928	7,442,038.152
(2R)-2-[(E)-3-[3-[(lR)-1-karboxi-2-(3,4-dihydroxifenyl)etoxi]karbonyl-2-(3,4-dihydroxifenyl)-7-hydroxi-2,3-dihydrobensofuran-4-yl]prop-2-enoyl]oxi-3-(3,4-dihydroxifenyl)	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
Bensoylaceton (苯甲酰丙酮)	4,235,952.540	4,526,539.189	4,297,281.060
Epipinoresinol 4′-O- -D-glukosid (表丁香树脂酚 4′-O- -D-葡萄糖苷)	2,758,386.748	4,338,477.068	1,182,637.856
Yangmei Changshan glykosid* (杨梅常山苷)	713,259.014	9,202,359.822	841,791.016
Jionoside A1 (焦地黄苯乙醇苷A1)	2,184,856.679	3,736,929.302	3,098,713.743
3,4-dimetylbensoesyra (3,4-2甲基苯甲酸)	585,269.7562	1,386,349.28	1,400,433.204
Robustaside D	1,693,753.421	3,272,248.064	4,236,657.164
7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxi-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroxitetrahydropyran-2-yl]oximetyl]tetrahydropyran-2-yl]oxikromen-2-on	4,489,728.765	1,167,879.841	824,633.4

 

---

B. Alkaloider

Förening	Exempel 1	Exempel 2	Exempel 3
Verticine (野百合碱)	1,306,481.28	524,919.97	4,057,704.757
Dihydrokoptisin (氢化可他宁碱)	6,406,217.365	9,533,850.521	4,649,410.535
Thymin (胸腺嘧啶)	2,658,397.084	2,715,160.269	554,956.4602
Gelsemin (钩吻碱)	3,698,263.919	1,554,195.385	5,144,366.562
Yohimbine (育亨宾)	3,929,806.438	1,286,932.427	9,431,924.132

isodanfenolsyra B,

p-hydroxifenylpropionsyra,

(2R)-2-[(E)-3-[3-[(lR)-1-karboxi-2-(3,4-dihydroxifenyl)etoxi]karbonyl-2-(3,4-dihydroxifenyl)-7-hydroxi-2,3-dihydrobensofuran-4-yl]prop-2-enoyl]oxi-3-(3,4-hydroxifenyl)oxi-3-(3,4,4)

bensoylaceton,

epipinoresinol 4'-O- -D-glukosid,

myricetinrelaterad glykosid (enligt lista),

jonoside A1,

3,4-dimetylbensoesyra,

robustaside D,

7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxi-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroxitetrahydropyran-2-yl]oximetyl]tetrahydropyran-2-yl]oxikromen-2-on.

Den innehöll också 5 alkaloider, inklusive:

verticine,

dihydrokoptisin (enligt listat),

tymin,

geseminrelaterad alkaloid (enligt lista),

yohimbin.

Baserat på jämförande resultat av proliferation/ALP-aktivitet, fenyletanoidglykosidanalyser och kemisk profilering kan man dra slutsatsen att fenyletanoidglykosider (echinacosid och acteosid), shikimic/fenylpropionsyror, alkaloider och terpenoidextraktet tillsammans utgör den specifika sammansättningen av exemplets beroende- (12,5–25 ug/ml) över proliferation, differentiering och mineralisering, vilket möjliggör stabila bentäthetsstödjande effekter.

[0081] Tabell 2: svarsvärden för komponenter.
[0082] Uppfinningen tillhandahåller genom förfarandet i exempel 2 ett Cistanche-extrakt med total echinakosid + akteosid > 25 % och berikade shikimic/fenylpropionsyror och alkaloider, vilket möjliggör stabila bentäthetsstödjande effekter. Inom 12,5–25 ug/ml främjar det MC3T3-E1-proliferation, differentiering och mineralisering på ett doshöjande sätt med konsekvent doskorrelation, vilket stöder bättre och mer stabila benhälsoresultat och möjliggör användning i produkter relaterade till att förbättra benmineraltätheten.