Cistanche-polysackarider förbättrar echinakosidabsorptionen in vivo och påverkar tarmmikrobiotan

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Zhifei Fu, et al

Abstrakt

Polysackariderna ochfenyletanoidglykosiderfrånCistanche deserticolahar visats ha olika hälsofördelar, men den interaktiva effekten mellan dessa två typer av föreningar in vivo är inte känd i detalj. Syftet med denna studie var att undersöka de synergistiska effekterna av cistanche-polysackarider med fenyletanoidglykosid och effekterna av polysackarider på tarmmikrobiota. Sprague-Dawley-råttor matades med olika typer av cistanche-polysackarider under 20 dagar, den sista dagen fick alla råttorechinakosidvid 100 mg/kg. Resultaten jämfördes huvudsakligen på skillnaden i farmakokinetiska parametrar, sammansättning av tarmmikrobiota och innehåll av kortkedjiga fettsyror. Resultaten visade att alla cistanche-polysackarider, inklusive orena polysackarider, högmolekyläravikt polysackarider, och lågmolekylära polysackarider, skulle kunna reglera tarmmikrobiota, öka nyttiga bakterier och särskilt öka tillväxten av Prevotella spp. samt förbättra produktionen av kortkedjiga fettsyror och absorptionen av echinakosid. Genom att utforska de synergistiska effekterna av polysackarider med små molekyler, tyder dessa fynd på att cistanche-polysackarider, särskilt lågmolekylära polysackarider, skulle kunna användas som en tarmmikrobiotamanipulator för hälsofrämjande.

Nyckelord:CistanchedeserticolapolysackaridEchinacosideTarmmikrobiota

Klicka här för att få mer information om cistanche-produkter

1. Introduktion

På senare år har det blivit tydligt att polysackarider modulerar sammansättningen av tarmmikrobiotan och att förändringar kan förmedla flera näringsupptag [1], vilket ger fysiologisk funktion [2,3]. Polysackarider från traditionell kinesisk medicin (TCM) har visat sig vara idealiska kandidater för reglering av tarmmikrobiota och visade prebiotiska effekter. I matsmältningssystemet visar polysackariderna och någon kontakt med små molekyler oundvikligen vissa effekter på biologiska aktiviteter [4]. Som en av de viktigaste aktiva ingredienserna i Panax ginseng, som har använts flitigt i tusentals år, visade polysackariderna braförbättringitarm-ämnesomsättningochabsorptionavginsenosiderin vivo [5]. Codonopsis pilosula polysaccharides visade den främjande effekten av absorptionen av saponiner i dextransulfatnatrium-inducerade kolitmöss [6]. Ganoderma lucidum polysaccharides, särskilt fraktionen med hög molekylvikt, visade sig haprebiotiskfunktioneri kostinducerade tarmdysbiosmössmodeller med hög fetthalt [7]. Longan-polysackarider reglerade tarmens mikrobiota och tarmmetaboliterna (ökade innehållet av pyruvat och butanoat) för att producera immunmodulerande aktiviteter [8].

Cistanche deserticola, som en traditionell kinesisk medicin, har använts i stor utsträckning som kosttillskott i Kina. Farmakologiska studier visade att det visade signeuroprotektiva, immunmodulerande, hormonellbalansering, anti-Trötthet, anti-inflammatorisk, leverskydd,anti-oxidativ, anti-bakteriell, anti-viral, ochanti-tumöreffekter [9]. Kemisk analys visade att fenyletanoidglykosider och polysackarider var de huvudsakliga aktiva beståndsdelarna. Echinakosid, den huvudsakliga fenyletanoidglykosiden i C. deserticola, har visat breda farmakologiska effekter, men dess läkemedelsförmåga är begränsad på grund av den dåliga biotillgängligheten, snabba och omfattande metabolism in vivo. Studier har bekräftat att echinakosid kan metaboliseras av tarmmikrobiotan in vitro [10,11]. Bevisen in vivo har dock inte undersökts. Som vi vet spelade tarmmikrobiotan en viktig roll i att förmedla den metaboliserande bioaktiviteten hos växtbaserade läkemedel. Därför var huvudsyftet med detta arbete att undersöka påverkan avcistanche polysackariderpå tarmmikrobiotan och effekterna på metabolismen av echinakosid.

2. Material och metoder

2.1. Material och kemikalier

Cistanche deserticola YC Ma erhölls från Alashan, Inner Mongolia Mandela sand industry Development Co., LTD, Kina. De autentiserades av professor Lijuan Zhang (Tianjin University of Traditional Chinese Medicine). Ett kupongprov deponerades i vårt laboratorium. Standardsubstansen såsom echinakosid, akteosid och klorogensyra erhölls från National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products (Peking, Kina). Renheten för varje standard var större än eller lika med 98 procent. Acetonitril och metanol av kromatografikvalitet köptes från Fisher Scientific (Pitts burgh, PA). Myrsyra köptes från Anaqua Chemical Supply Inc. (Wilmington, USA). De andra kemiska reagensen var av analytisk kvalitet och köptes från Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, Kina).

Sprague-Dawley-hanråttor (200–220 g) levererades av Beijing HFK Bioscience CO., LTD (Beijing, Kina, licensnr SCXK (Jing) 2014- 0004). Alla djur föddes upp och inhystes under SPF-förhållanden i djuranläggningen. Experimentet utfördes enligt de riktlinjer som fastställts av djuromsorgen och använder en kommitté av TJUTCM och överensstämmer med guiden för vård och användning av laboratoriedjur publicerad av US National Institutes of Health (NIH publikationsnummer 85–23, reviderad 1996) ). Efter 1 veckas acklimatiseringsperiod delades råttor slumpmässigt in i fyra grupper: kontrollgrupp, total polysackaridgrupp, högmolekylär polysackaridgrupp och lågmolekylär polysackaridgrupp. Varje grupp bestod av 6 råttor, som föddes upp i samma bur.

2.2. Beredning av Cistanche-polysackarider

3.0 kg Cistanche deserticola YC Ma rengjordes och torkades vid 40 grader i den lufttorkande ugnen och krossades sedan till ett grovt pulver. Det torra grova pulvret extraherades med 85% vattenhaltig etanol (v/v) vid 60 grader två gånger och 2 timmar för varje gång. Fast-vätskeförhållandena var 1:12 respektive 1:10. Örtresterna extraherades med vatten vid 100 grader ytterligare två gånger, extraktionstiden och förhållandena mellan fast och vätska var desamma med 85 procent etanol. Vattenlösningen kombinerades och koncentrerades under reducerat tryck och fälldes sedan ut i 80 % etanol, stående under 4 grader i 24 timmar. Fällningen isolerades genom centrifugering vid 8000 rpm under 10 minuter vid 4 grader och lyofiliserades sedan för att få de totala polysackariderna (ZT). ZT löstes sedan i avjoniserat vatten och filtrerades på ett 100 kDa hålfiber ultrafiltreringsmembran, de retentiva infiltrerade högmolekylära polysackariderna (HM) samlades. Det genomträngda filtratet filtrerades med ett 6 kDa ultrafiltreringsmembran. De retentiva filtratmedelmolekylära polysackariderna (MM) och de genomträngda lågmolekylära polysackariderna (LM) erhölls.

2.3. Primär karakterisering av cistanche-polysackarider

Polysackaridens innehåll bestämdes med svavelsyrafenolmetoden med glukos som standard [12]. Totalt proteininnehåll bestämdes med BCA-metoden [13]. Analysen av monosackaridsammansättningen utfördes med HPLC (UltiMate 3000-system) utrustad med en SinoPak C18-kolonn (5 μm, 150 mm × 4,6 mm) och diodarraydetektor (VWD-3000). Den kromatografiska separationen av PMP (1-fenyl-3- metyl-5-pyrazolon) pre-kolonnderivat utfördes med användning av 100 mM fosfatbuffert och acetonitril i ett förhållande av 82:18 (v/v) , procent) som en mobil fas vid en flödeshastighet av 1,0 ml/min. 10 μL av varje prov injicerades och en analystid på 30 minuter med detektion vid 245 nm användes. Datainsamling och bearbetning utfördes med Chromeleon Software 7.1 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA).

Molekylvikten (Mw) bestämdes genom högpresterande storleksexklusionskromatografi (HPSEC, UltiMate 30{{10}}0-system), utrustad med en TSK gel G3000 PWXL (7,8 × 300,0 mm, Tosoh, Japan) och TSK gel GMPWXL (7,8 × 300,0 mm, Tosoh, Japan) kolonn och en RefractoMax521 brytningsindexdetektor (RID). Proverna eluerades med 0,1 mL/L Na2S04 vid en flödeshastighet av 0,5 mL/min. Kolonnens temperatur hölls vid 35 grader. Dextran som standarder och standardkurvan plottades enligt elueringstiden avsatt mot logaritmen för molekylvikt.

2.4. Farmakokinetisk studie

Blodprover togs från den inre canthus vid {{0}} h, 0.083 h, 0.167 h, 0.25 h, 0,5 h, 0,75 h, 1.0 h, 2.0 h, 3.{{20}} h, 4.0 h, 6.0 h, 8.0 h, 10 h, 12 h och 24 h efter administrering av echinakosid (100 mg/kg). Plasmaprov erhölls genom centrifugering under 10 minuter vid 7500 pm. Till 100 μL av plasmaprovet tillsattes 10 μL IS-lösning (klorogensyra) och 500 μL metanol. Blandningen virvlades sedan i 3 min och centrifugerades vid 14, 000 rpm under 10 min. Supernatanten uppsamlades och torkades i kväve vid rumstemperatur. Därefter löstes återstoden i 100 μL 50 procent vattenhaltig metanol, centrifugering vid 14, 000 rpm under 10 minuter igen. Slutligen injicerades 3 μL av supernatanten i LC-MS/MS-systemet för analys. Proverna analyserades med metoden enligt en tidigare rapporterad. Den mobila fasen bestod av CH3CN (lösningsmedel A) och H2O (innehållande 0,1 procent HCOOH; lösningsmedel B) med användning av följande gradient: 0–1 min, 10 procent A; 1–8 min, 10–90 procent A; 8–9 min, 90–10 procent A; 9–11 min: 10 procent A. Provet separerades på ACQUITY HSS T3-kolonnen (1,8 μm, 100 mm × 2,1 mm id). Flödeshastigheten var 0,3 ml/min och kolonntemperaturen var inställd på 35 grader. I MS-analysen användes negativ joniseringsläge, med följande optimerade parametrar: kapillärspänning, 2,5 kV; upplösningstemperatur, 450 grader. Kväve användes som desolvatiserings- och kongas med en flödeshastighet av 900 L/h respektive 150 L/h. Kvantifiering utfördes således med användning av MRM av övergångarna m/z 785,29 → 623,26 för echinakosid, m/z 353,06 → 191,07 för klorogensyra (IS), m/z 623,24 → 161,09 för akteosid. Konspänningen för echinacoside, IS och acteosid var 100 V, 32 V och 74 V; kollisionsenergi, 32 V, 14 V och 30 V.

2.5. Studie av kortkedjiga fettsyror (SCFA).

Sprague-Dawley-hanråttor administrerades oralt ZT, HM och LM under 3 veckor. Bestämning av SCFA (ättiksyra, propionsyra, isosmörsyra, smörsyra, isovalerinsyra, valeriansyra och hexansyra) med gaskromatografi (GC) gjordes som beskrivits tidigare med några modifieringar [14]. Kortfattat dispergerades 0,5 g fekalt prov i 2,5 ml Milli-Q-vatten, vortexbehandlades i 10 min och 7,5 ml 1 procent HCl/etanollösning innehållande inre standarder (smörsyra 24,0 ug) /ml och 2- etylhexansyra 1,32 ug/ml som interna standarder) tillsattes. Blandningarna homogeniserades i 5 minuter och centrifugerades vid 14, 000 rpm i 10 minuter vid 4 grader. Fem mikroliter supernatant injicerades i delat läge i ett förhållande av 30:1. Bärargasen var N2 (99,999 procent) vid 1 ml/min. Tillsatsgasen (N2) låg på 25 ml/min. Flödeshastigheten för H2 och luft var 30 ml/min respektive 300 ml/min. Fekala prover samlades in den 20:e dagen av denna studie och lagrades omedelbart vid -80 grader.

2.6. Avföringsuppsamling, DNA-extraktion och 16S rRNA-gensekvensering

Ungefär 200 mg av ett färskt fekalt prov samlades i ett 1,5 ml sterilt Eppendorf-rör från en råtta och lagrades vid -80 grader för senare DNA-beredning. DNA extraherades från avföringen med hjälp av QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN). Mängden DNA bestämdes med användning av en NanoDrop-spektrofotometer (Thermo Electron Corporation); integriteten och storleken kontrollerades med 1,0 procent agarosgelelektrofores. Enligt koncentrationen späddes DNA till 1 ng/μL med sterilt vatten.

16S rRNA amplifierades med användning av en specifik primer (V4: 515F-806R) med streckkoden. Alla PCR-reaktioner utfördes med Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs). Blanda lika volym 1 x laddningsbuffert (innehåller SYB-grönt) med PCR-produkter och utför elektrofores på 2 procent agarosgel för detektion. De ljusa huvudremsorna mellan 400 och 450 bp valdes för ytterligare experiment. PCR-produkter blandades i EU-densitetsförhållanden. Därefter renades en blandning av PCR-produkter med Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Tyskland).

Sekvenseringsbibliotek konstruerades med användning av TruSeq® DNA PCR Free Sample Preparation Kit (Illumina, USA) enligt tillverkarens rekommendationer och indexkoder lades till. Bibliotekets kvalitet bedömdes på Qubit® 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific) och Agilent Bioanalyzer 2100-systemet. Biblioteket sekvenserades på en Illumina HiSeq 2500-plattform och 250 bp parade läser genererades.

2.7. Bioinformatik analys

Avskärning av streckkoden och primersekvensen, sekvensmontering och datafiltrering enligt QIIME (V 1.7.0). Sekvenser med större än eller lika med 97 procents likhet tilldelades samma OTU:er. OTU:erna är kommenterade som SILVA-etiketter. Alfa-diversitetsindexen som utvärderar rikedomen av tarmmikrobiella samhällen (ACE- och Chao1-måtten) och gemenskapsmångfalden (Shannon- och Simpson-måtten) beräknades med Qiime (version 1.9.1). Beta-diversitetsanalys användes för att undersöka de strukturella variationerna av de mikrobiella samhällena med hjälp av UniFrac-avstånd. Skillnader mellan alla grupper testades med Tukey-testet och Wilcox-testet. Den huvudsakliga koordinatanalysen (PCoA) användes för att förklara sammansättningsskillnaderna mellan de fyra grupperna med användning av R-paket. Metoden för linjär diskriminantanalyseffektstorlek (LEfSe) är speciellt utformad för biomarkörupptäckt och förklaringssekvenseringsdata. Och linjär diskriminantanalys (LDA) användes för att beräkna effektstorleken för varje differentiellt tarmmikrober och egenskaperna associerade med varje grupp av råttor. Korrelationsanalysen implementerades med hjälp av R-paket gcorrplot (version 1.1.463).

SCFAs data analyserades med ANOVA av SPSS 22.0.

3. Resultat och diskussion

3.1. Beredning och kemisk analys av cistanche-polysackarider

Cistanches Herba används som både mat och medicin i Kina. Polysackarider isolerade från det har väckt stor uppmärksamhet på grund av sina betydande aktiviteter. I denna studie erhölls de fyra delarna av cistanche-polysackarider (ZT, HM, MM och LM) genom metoden för vattenextraktion, alkoholutfällning och ultrafiltrering. Den kemiska sammansättningen av fyra delar polysackarider visas i tabell 1.

Totalt sockerinnehåll i proverna med hjälp av en standardkurva för glukos. Resultatet visade att utbytena av HM och LM var högre än MM. Polysackarider visade olika farmakologiska egenskaper, särskilt immunaktivitet. Studier har visat att monosackaridinnehåll och typ, molekylvikt, typ av substituentgrupp spelar en viktig roll i polysackaridernas aktiviteter [15]. De olika delarna av monosackaridsammansättningen av cistanche-polysackarider var likartade, och mannos (Man), galakturonsyra (GalUA), glukos (Glc), galaktos (Gal) och arabinos (Ara) var de huvudsakliga monosackariderna.

Innehållet var dock olika mellan de fyra delarna. Glukos och arabinos var huvudkomponenterna i ZT och HM, medan glukos var huvudsockerenheten i LM, dessutom detekterades lite ramnos och glukuronsyra (GlcUA) i dessa fraktioner.

De relativa molekylvikterna för proverna undersöktes med högpresterande storleksexklusionskromatografi (HPSEC). Enligt standardkurvan för dextraner och retentionstid i kolonnerna observerades huvudtoppmolekylvikterna i ZT vid 1,68 × 106 Da och 1,70 × 104 Da, i HM bestämdes till 1,54 × 106, 2,06 × 105, och 4,81 × 104, i MM och LM bestämdes till 1,09 × 104 respektive 2,05 × 104. Utbytet av dem listades i tabell 1 och utbytet av MM var lågt och inte tillräckligt för djurförsöket. Tidigare studier har indikerat de strukturberoende effekterna av cistanche-polysackarider på olika bioaktiviteter [16]. Ytterligare experiment behövs fortfarande, särskilt rening. Fifin strukturanalys bör tillämpas för struktur-aktivitetsstudien

3.2. Farmakokinetikstudie

Echinakosidens farmakokinetik undersöktes med ultrahögpresterande vätskekromatografi trippelkvadrupolmasspektrometri (UPLC och Xevo TQ-S) efter oral administrering av echinakosid. De genomsnittliga plasmakoncentrations-tidsprofilerna för echinakosid visades i fig. 1. Enligt läkemedels- och statistikprogramvaran (DAS, version 2.0), passar echinakosids farmakokinetik till en modell med ett fack och den andra parametrar i ZT-, HM- och LM-grupperna sammanfattades i tabell 2, inklusive tiden för att nå maximal koncentration (Tmax), maximal koncentration (Cmax), area under koncentration-tidskurvan (AUC) och genomsnittlig uppehållstid (MTR) ). En farmakokinetisk studie visade att den genomsnittliga Cmax för echinakosid i ZT-, HM- och LM-grupper visade sig vara 646,4 ng/ml, 732, 0 ng/ml och 898,4 ng/ml, vilka var 1,6, 1,8 och 2,2 gånger jämfört med kontrollgruppen (406,8 ng/ml), respektive. Genom förbehandling med polysackarider ökades AUC(0-24 h) för echinakosid med 6,6 procent, 36,7 procent respektive 63,6 procent i ZT-, HM- och LM-grupper, jämfört med kontrollgruppen, vilket visade att polysackariderna visade aktiviteten att främja absorptionen av en liten molekyl. Dessa resultat var ganska lika att kitooligosackariderna förbättrade biotillgängligheten av fenyletanoidglykosider i Fructus Forsythia-extrakt [17] och polysackariderna av Polygonum multiflorum förbättrade de biofarmaceutiska egenskaperna hos 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxi38}} O- -D-glukosid hos normala Sprague-Dawley-råttor [18]. Tarmmikrobiota innehåller en mängd olika läkemedelsmetaboliserande relaterade enzymer och mekanismerna för mikrobiomformerna läkemedels farmakokinetik och farmakodynamik är fortfarande okända [19]. Polysackarider kan ge näring till tarmmikrobiotan genom att öka immunförsvaret, absorbera näringsämnen och minska tillväxten av patogener [20,21]. Även om litteraturen rapporterade att cistanche-polysackarider kunde öka echinakosidmetaboliter (som akteosid) in vitro, fann vi inte att de samexisterande polysackariderna har gynnats för echinakosid omvandlas till akteosid in vivo [10,11].

3.3. SCFA-innehåll i råttavföring

Tarmmikrobiota fermenterade polysackarider, som producerar olika bioaktiva polymerer och metaboliter, såsom SCFAs [3]. Som huvudmetaboliter av polysackarider analyserades SCFA i avföringen. SCFA, inklusive ättiksyra, propionsyra och butyrat, har rapporterats ha gynnsamma effekter på glukos, kolesterol och lipidmetabolism. Acetat är den huvudsakliga SCFA i tjocktarmen och är ett viktigt substrat för kolesterolsyntes, propionat är ett substrat för glukoneogenes i levern och butyrat är det föredragna energisubstratet för kolonocyter och har antiinflammatorisk effekt i tarmen [22,23].

Våra resultat visade att acetat var den huvudsakliga SCFA som bildades i avföringen för alla grupper, följt av butyrat och propionat, medan koncentrationen av valerat och grenad SCFA (isobutyric acid och isovaleric acid) var lägre. Acetatet har visat sig öka enzymaktiviteten i levervävnaden, vilket resulterar i bättre blodsockerkontroll [24]. På den 20 dagen (fig. 2) hade LM-gruppen en signifikant högre nivå av acetat (pb 0,05), andelen propionat tenderade att minska och andelen butyrat tenderade att öka även om förändringen var obetydlig i avföring jämfört med kontrollgruppen.

HM-gruppen hade dock en signifikant lägre andel butyrat än kontrollgruppen (pb 0.05). Innehållet av totalt SCFA mellan LM och HM var motsatt trend jämfört med kontrollgruppen och endast LM-gruppen hade en signifikant skillnad.

Många faktorer påverkar nivån av SCFA i avföringen, inklusive sammansättningen och mängden tarmmikrobiota, kostkällan och den tid det tar för mat att passera genom matsmältningskanalen [22]. Ackumulerande studier visar att polysackariders struktur, inklusive sammansättning av monosackaridrester, polymerisationsgrad, båda kan påverka fermenteringsegenskaperna och produktionen av SCFAs [25]. Från våra resultat kan vi dra slutsatsen att cistanche-polysackarider modulerar SCFA-produktion och polysackarider med olika struktur har olika effekter.

3.4. Cistanche-polysackarider inducerade kärnförändringar i sammansättning och mångfald av tarmmikrobiota

Bakteriesammansättningen av de fekala proverna (n=4) undersöktes med hjälp av en Illumina high-throughput sekvenseringsteknik. Biblioteket sekvenserades på en Illumina HiSeq2500-plattform och 250 bp parad-end-läsningar producerades. De bearbetades för taxonomisk identifiering och diversitetsanalys. Sällsynthetskurvor (Fig. 3a) visade att bakterieartsrikedomen planade ut för varje prov när provtagningsdjupet ökade, vilket indikerar att sekvenseringsansträngningen var tillräcklig och att den totala mångfalden inom provet fångades. Shannon-kurvan (fig. 3b) visade att antalet unika bakteriearter ökade när antalet identifierade sekvenser ökade. Mättnad av Shannon-kurvorna betyder att sekvenseringsdata var tillräckligt för att täcka alla bakteriearter.

Alfadiversitetsanalys används för att mäta mångfalden inom ett urval. Chao1, ACE, Shannon och Simpson diversitetsindex beräknades genom Tukeys test för att beskriva alfadiversiteten. Mångfaldsanalysen baserad på ACE- och Chao 1-index avslöjade samhällsrikedomen hos tarmmikrobiotan på OTU-nivå. ACE- och Chao 1-indexen var signifikant lägre i de fekala proverna från LM-gruppen jämfört med kontrollgruppen (pb 0.05) (fig. 4a, b), vilket antyder att artrikedomen i tarmmikrobiotan minskade genom LM-matning. Mångfaldsanalysen baserad på Shannon och Simpsons index avslöjade samhällsdiversiteten i tarmmikrobiotan. Det fanns ingen uppenbar förändring i Shannon och Simpsons diversitetsindex när de behandlades med cistanche-polysackarider jämfört med kontrollgruppen.

Cistanche-polysackarider inducerade stora förändringar i taxa. Dessutom var N98 procent av OTU i fyra grupper relaterade till phyla Bacteroidetes, Firmicutes och Proteobacteria. Den mest dominerande delen var Bacteroidetes som bidrog med 55.09 procent, 57.89 procent, 52.72 procent och 69.{{20}}4 procent av den fekala mikrobiotan i kontroll, ZT, HM och LM-grupper, följt av Firmicutes, bidrar med 41,39 procent, 38.03 procent, 42,15 procent respektive 28,15 procent (Fig. 5a, b). Jämfört med kontrollgruppen visade sig ZT-gruppen resultera i svaga effekter på den relativa förekomsten av huvudfilan, förutom att den låga förekomsten av Actinobacteria ökade signifikant (MetaStat, pb 0,05). I HM-gruppen ökade Proteobacteria signifikant (pb 0,01). Detta indikerade att HM Cistanche-polysackarid kunde främja anrikningen av proteobakterier för att påverka ämnesomsättningen hos råttor. I LM-gruppen ökade förekomsten av Bacteroidetes, vars huvudsakliga bidragsgivare var Prevotellaceae och Prevotellaceae_UCG-001 signifikant (pb 0,05) och förekomsten av Firmicutes, inklusive Peptococcaceae, minskade signifikant (0p) signifikant (0p). . Medlemmar av Prevotella och Bacteroides har tidigare beskrivits som kostfibernedbrytare [26], som producerar metaboliska slutprodukter som succinat och acetat [27]. Sådana fynd bekräftade tidigare studier som visar att vissa Prevotella spp. kan bryta ner komplexa växtpolysackarider. En tidigare rapport visade också att de två dominerande bakterieuppdelningarna, det ökade förhållandet mellan phyla Firmicutes/Bacteroidetes är associerade med fetma [28]. Den lägre förekomsten av den förra och den högre förekomsten av den senare i LM-gruppen föreslog att LM kunde hjälpa till att tappa kilon.

Av 72 upptäckta familjer isolerades taxa top10 och analyserades (Fig. 5c, d). Lachnospiraceae och Ruminococcaceae är två av de vanligaste familjerna som finns i däggdjurens tarmmiljö och har associerats med upprätthållandet av tarmhälsa [29]. I den aktuella studien, familjer Bacteroidales_S24-7_grupp (39,11 ± 6,04 procent, 36,88 ± 4,44 procent, 28,37 ± 4,01 procent, 35,81 ± 7,91 procent), Prevotellaceae (±1,5 procent, 0,84 procent, ±1,5 procent) percent , 19.65 ± 8.97 percent , 21.05 ± 8.39 percent ), Lachnospiraceae (18.21 ± 5.20 percent , 15.09 ± 3.29 percent , 12.13 ± 7.14 percent , 13.12 ± 6.82 percent ), and Ruminococcaceae (9.64 ± 0.88 percent , 10.44 ± 2.45 percent , 11.27 ± 4,70 procent, 8,19 ± 1,72 procent) dominerade i varje grupp. S24-7-familjen har rapporterats som innehöll mängder av kolhydratnedbrytande enzymer [30]. Prevotellaceae visade en stigande och Lachnospiraceae visade en sjunkande tendens i polysackaridgruppen jämfört med kontrollgruppen [31]. Det antogs att det inte fanns några motsvarande aktiva enzymer av cistanche-polysackarider i Bacteroidales_S24-7_gruppen och Lachnospiraceae eller kolhydratbindande bakteriemoduler vid polysackarider. Prevotella-släkten har rapporterats i samband med polysackaridutnyttjande loci och kolhydrataktiva enzymer [32]. För att hitta sambandet mellan bakterier och SCFA, användes Spearman korrelationsanalys. Vissa släkten som Bacteroides, Prevotella och Lactobacillus i tarmmikrobiota spelar en viktig roll i hydrolyseringen av polysackarider till SCFAs [33]. Våra resultat visade också att Bacteroidaceae korrelerade positivt och dominerad mikrobiota producerade mer butyrat [34], medan Prevotellaceae korrelerade positivt och dominerade mikrobiota producerade mer acetat. Lactobacillaceae och Ruminococcaceae dominerade mikrobiota producerade mer propionat (Fig. 6).

Beta-diversitetsanalys användes för att undersöka de strukturella variationerna av tarmmikrobiotan över proverna med hjälp av UniFrac-avståndsmått. Skillnader i Unifrac-avstånden analyserades med Tukey och Wilcox-testet (fig. 7). Med hjälp av uniFrac oviktad analys fann vi att LM matar möss kluster bort från andra grupper. Ett uppenbart klustringsmönster identifierades för kontroll-, ZT-, HM- och LM-grupper.

Mängden av dessa mikrobiella modulerades differentiellt med polysackaridbehandlingar. För att identifiera de specifika bakteriella taxa i varje grupp jämfördes sammansättningen av mikrobiotan från kontroll-, ZT-, HM- och LM-grupperna med den linjära diskriminantanalyseffektstorleksmetoden (LEfSe). Linear Discriminant Analysis (LDA) används för att beräkna effektstorleken för varje differentiellt riklig egenskap. LDA-poängtröskeln är högre än 4-listan, vilket indikerar en högre relativ gemenskapsöverflöd i motsvarande grupp än i andra grupper. Med denna metod fann vi att 19 OTU var signifikant olika i alla grupper, nämligen 6 OTU i kontrollgruppen var högre, endast 1 OTU i ZT-gruppen var högre, 10 OTU i HM-gruppen var högre och 2 OTUS i LM-gruppen var högre än andra grupper (Fig. 8). Förekomsten av g_Prevotellaceae_ UCG_001 i LM ökade signifikant (8,47 ± 1,9 procent i LM, 0.40 ± {{21 }}.09 procent i kontrollgruppen, pb 0.01). Resultatet överensstämde med rapporten att Porphyra haitanensis och Ulva prolifera polysaccharides uppenbarligen kunde främja spridningen av Prevotellaceae UGC-001 (pb 0,05) och Rikenellaceae RC9 (pb 0,01) [35].

4. Sammanfattningar

Det är tydligt att det finns ett samband mellan TCM-kemiska beståndsdelar, tarmmikrobiota och vissa metaboliter som härrör från tarmmikrobiella. Våra nuvarande fynd gav en metod för att studera echinakosidmetabolismsynergier med olika typer av polysackarider baserade på tarmmikrobiota. Tarmmikrobiota kan metabolisera TCM och TCM kan påverka tillväxten av tarmmikrobiota. Å ena sidan, efter oral administrering av polysackarider i tarmen, kodar en mängd olika tarmmikrobiota metabola enzymer, som spelar en viktig roll i polysackariders nedbrytning och för att producera bioaktiva metaboliter. Å andra sidan har bidragen från polysackarider en viss inverkan på balansen mellan tarmmikromiljön i processen. Genom jämförelse av med eller utan polysackarider fann vi att polysackarider, även om de smälts ned av värden direkt, potentiellt fungerade som prebiotika, vilket ledde till gynnsamma förändringar i tarmmikrobiotan genom att främja tillväxten av probiotika. Cistanche-polysackarider reglerade tarmens mikrobiota, ökade nyttiga bakterier och särskilt lågmolekylära polysackarider ökade tillväxten av Prevotella spp. Dessutom förbättrade den förbättrade tarmmikrobiotan absorptionen av echinakosid i Cistanche deserticola. Men orsaken är inte helt klar, kan vara ett resultat av de kombinerade defekterna i tarmmikrobiotan, SCFAs och immunitet, och ytterligare forskning är nödvändig för en sjukdomsmodell. Det är svårt att bevisa effekterna av prebiotika i friska djurmodeller vars mikrobiotagemenskap är stabil och motståndskraftig. Cistanche deserticola polysackarider kan utvecklas som probiotiska produkter för att reglera tarmmikrobiotan och kan användas på den synergistiska metabolismen av små molekyler i framtiden. Dessa data kommer att hjälpa oss att utforma insatser för att förhindra att utsatta grupper av människor förbättrar sin hälsa.

Anmälan om konkurrerande intresse

Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt när det gäller publiceringen av denna artikel.

Erkännanden

Författarna erkänner tacksamt Kinas National Natural Science Foundation (anslag nr. 81830112 och 81904058)

Referenser
[1] I. Khangwal, P. Shukla, Potentiella prebiotika och deras överföringsmekanismer: senaste tillvägagångssätt, J. Food Drug Anal. 27 (3) (2019) 649–656.
[2] XF Xu, PP Xu, CW Ma, J. Tang, XW Zhang, Tarmmikrobiota, värdhälsa och polysackarider, Biotechnol. Adv. 31 (2) (2013) 318–337.
[3] NT Porter, EC Martens, De kritiska rollerna för polysackarider i tarmens mikrobiell ekologi och fysiologi, Annu. Rev. Microbiol. 71 (2017) 349–369.
[4] QW Guo, QQ Ma, ZH Xue, XD Gao, HX Chen, Studier av bindningsegenskaperna hos tre polysackarider med olika molekylvikt och flavonoider från majssilke (Maydis stigma), Carbohyd. Polym. 198 (2018) 581–588.
[5] SS Zhou, J. Xu, H. Zhu, J. Wu, JD Xu, R. Yan, XY Li, HH Liu, SM Duan, Z. Wang, HB Chen, H. Shen, SL Li, Tarmmikrobiota -involverade mekanismer för att förbättra systemisk exponering av ginsenosider genom samexisterande polysackarider i ginsengavkok, Sci. Rep. 6 (2016), 22474.
[6] YP Jing, AP Li, ZR Liu, PR Yang, JS Wei, XJ Chen, T. Zhao, YR Bai, LJ Zha, CJ Zhang, Absorption av Codonopsis pilosula saponiner genom samexisterande polysackarider lindrar tarmmikrobiell dysbios med natriumsulfat -inducerad kolit hos modellmöss, Biomed. Res. Int. 2018 (2018), 1781036 (18 sidor).
[7] CJ Chang, CS Lin, CC Lu, J. Martel, YF Ko, DM Ojcius, SF Tseng, TR Wu, YYM
Chen, JD Young, HC Lai, Ganoderma Lucidum minskar fetma hos möss genom att modulera sammansättningen av tarmmikrobiotan, Nat. Commun. 6 (2015) 7489.
[8] JC Zhang, GM Yang, YZ Wen, SX Liu, CF Li, RL Yang, W. Li, Intestinal mikrobiota är involverade i de immunmodulerande aktiviteterna av longan polysackarid, Mol. Nutr. Food Res. 61 (11) (2017), 1700466.
[9] T. Wang, XY Zhang, WY Xie, Cistanche deserticola YC Ma, "Desert Ginseng": en recension, Am. J. Chin. Med. 40 (6) (2012) 1123–1141.
[10] Y. Li, GS Zhou, SH Xing, PF Tu, XB Li, Identifiering av echinakosidmetaboliter producerade av mänskliga tarmbakterier med hjälp av ultrapresterande vätska
chromatography–quadrupol time-of-flight masspektrometri, J. Agr. Food Chem. 63 (30) (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, Y. Peng, MY Wang, PF Tu, XB Li, Human gastrointestinal metabolism of Cistanches Herba vattenextrakt in vitro: klargörande av den metaboliska profilen baserad på omfattande metaboliter identifiering i magsaft, tarmjuice, human tarm bakterier och tarmmikrosom, J. Agric. Food Chem. 65 (34)
(2017) 7447–7456.
[12] M. Dubois, K. Gilles, JK Hamilton, PA Rebers, F. Smith, Kolorimetrisk metod för bestämning av sockerarter och relaterade ämnen, Anal. Chem. 168 (4265) (1956) 167.
[13] NH Cho, SY Seong, KH Chun, YH Kim, IC Kwon, BY Ahn, SY Jeong, Ny mukosal immunisering med polysackarid-proteinkonjugat infångade i alginatmikrosfärer, J. Control. Release 53 (1–3) (1998) 215–224.
[14] XY Zhao, ZZ Jiang, F. Yang, Y. Wang, XM Gao, YF Wang, X. Chai, GX Pan, Y. Zhu, Känslig och förenklad upptäckt av antibiotikapåverkan på de dynamiska och mångsidiga förändringarna av fekal kortslutning -kedja av fettsyror, PLoS One 11 (12) (2016), e167032.
[15] SJ Li, QP Xiong, XP Lai, X. Li, MJ Wan, JN Zhang, YJ Yan, M. Cao, L. Lu, JM Guan, DY Zhang, Y. Lin, Molekylär modifiering av polysackarider och resulterande bioaktiviteter , Compr. Rev Mat. Sci. F. 15 (2) (2016) 237–250.
[16] ZF Fu, X. Fan, XY Wang, XM Gao, Cistanches Herba: en översikt över dess kemi, farmakologi och farmakokinetiska egenskaper, J. Ethnopharmacol. 219 (2018) 233–247.
[17] W. Zhou, XB Tan, JJ Shan, T. Liu, BC Cai, LQ Di, Effekt av kitooligosackarider på
tarmabsorptionen av fenyletanoidglykosider i Fructus Forsythia-extrakt, Phytomedicine 21 (12) (2014) 1549–1558.
[18] LL Sun, M. Wang, HJ Zhang, GJ You, YN Liu, XL Ren, YR Deng, The influence of polysaccharides from Ophiopogon japonicus on 2,3,5,4′-tetrahydroxy-stilbene-2- Z. Fu et al. / International Journal of Biological Macromolecules 149 (2020) 732–740 739 O- -d-glukosid om biofarmaceutiska egenskaper in vitro och farmakokinetik in vivo, Int. J. Biol. Macromol. 119 (2018) 677–682.
[19] KN Lam, M. Alexander, PJ Turnbaugh, Precision medicine goes microscopic: engineering the microbiome to improve drug outcomes, Cell Host Microbe 26 (1) (2019) 22–34.
[20] I. Khangwal, P. Shukla, Prospektering av prebiotika, innovativa utvärderingsmetoder och deras hälsotillämpningar: en översikt, 3 Biotech. 9 (5) (2019) 187.
[21] GR Gibson, R. Hutkins, ME Sanders, SL Prescott, RA Reimer, SJ Salminen, K. Scott, C. Stanton, KS Swanson, PD Cani, K. Verbeke, G. Reid, The international scientific association for probiotics och prebiotika (ISAPP) konsensusuttalande om definitionen och omfattningen av prebiotika, Nat. Rev. Gastro. Hepat. 14 (8) (2017) 491–502.
[22] JMW Wong, R. de Souza, CWC Kendall, A. Emam, DJA Jenkins, Kolonhälsa: fermentering och kortkedjiga fettsyror, J. Clin. Gastroenterol. 40 (3) (2006) 235–243.
[23] SI Cook, JH Sellin, Översynsartikel: kortkedjiga fettsyror i hälsa och sjukdom, Aliment. Pharm. Ther. 12 (6) (1998) 499-507.
[24] H. Yamashita, K. Fujisawa, E. Ito, S. Idei, N. Kawaguchi, M. Kimoto, M. Hinamori, H. Tsuji, Improvement of obesity and glucose tolerance by acetate in type 2 diabetic Otsuka Long- Evans Tokushima Fatty (OLETF) råttor, Biosci. Biotechnol. Biochem. 71 (5) (2007) 1236–1243.
[25] AL Ho, O. Kosik, A. Lovegrove, D. Charalampopoulos, RA Rastall, In vitro-fermenterbarhet av xylooligosackarider och Xylo-polysackaridfraktioner med olika molekylvikter av mänskliga fekala bakterier, Carbohyd. Polym. 179 (2018) 50–58.
[26] TT Chen, WM Long, CH Zhang, S. Liu, LP Zhao, BR Hamaker, Fiberutnyttjande kapacitet varierar i Prevotella- kontra Bacteroides-dominerad tarmmikrobiota, Sci. Rep. 7 (1) (2017) 2594.
[27] M. Sakamoto, M. Ohkuma, Bacteroides sartorii är en tidigare heterotypisk synonym till Bacteroides chinchilla och har prioritet, Int. J. Syst. Evol. Micr. 62 (6) (2012) 1241–1244.
[28] PJ Turnbaugh, RE Ley, MA Mahowald, V. Magrini, ER Mardis, JI Gordon, En fetma-associerad tarmmikrobiom med ökad kapacitet för energiskörd, Nature 444 (7122) (2006) 1027–1131.
[29] LF Gomez-Arango, HL Barrett, HD McIntyre, LK Callaway, M. Morrison, NM Dekker, Connections between the gut microbiome and metabolic hormones in early pregnancy in overweight and obese women, Diabetes 65 (8) (2016) 2214 –2223.
[30] KL Ormerod, DL Wood, N. Lachner, SL Gellatly, JN Daly, JD Parsons, CG Dal Molin, RW Palfreyman, LK Nielsen, MA Cooper, M. Morrison, PM Hansbro, P. Hugenholtz, Genomic characterization of the oodlade Bacteroidales-familjen S24-7 som lever i tarmarna hos homeotermiska djur, Microbiome. 4 (1) (2016) 36.
[31] JD Zhang, LJ Song, YJ Wang, C. Liu, L. Zhang, SW Zhu, SJ Liu, LP Duan, Fördelaktig effekt av butyratproducerande Lachnospiraceae på stressinducerad visceral överkänslighet hos råttor, J. Gastro. Hepatol. 34 (8) (2019) 1368–1376.
[32] T. Accetto, G. Avguštin, De mångsidiga och omfattande nedbrytande apparaterna för växtpolysackarider hos Prevotella-arterna i vommen och baktarmen: en faktor i deras överallt? Syst. Appl. Microbiol. 42 (2) (2019) 107–116.
[33] KE Bach Knudsen, MS Hedemann, HN Lærke, Kolhydraternas roll i tarmhälsa hos grisar, Anim. Utfodra. Sci. Tech. 173 (1–2) (2012) 41–53.
[34] SA Parker, A. Geirnaert, L. Berchtold, A. Greppi, L. Krych, RE Steinert, T. de Wouters, C. Lacroix, Förstå den prebiotiska potentialen hos olika kostfibrer med hjälp av en in vitro kontinuerlig vuxenfermentationsmodell (PolyFermS), Sci. Rep. 8 (1) (2018) 4318.
[35] ZS Zhang, XM Wang, SW Han, CD Liu, F. Liu, Effekt av två tångpolysackarider på tarmmikrobiota hos möss utvärderade med Illumina PE250-sekvensering, Int. J. Biol. Macromol. 112 (2018) 796–802.