Kloning, funktionell identifiering och expressionsanalys av Chalcone Syntas från Cistanche Tubulosa Ⅱ

3 Resultat och analys

3.1 Kloning av CtCHS-genen

Fyra sekvenser annoterade som "chalkonsyntas" sållades bort med användning av transkriptomdata från Cistanches tubulosa-blommor. Genom NCBI:s Blast-jämförelse fann man att endast en sekvens hade CHS-genens fulla längd och hade en FPKM större än 10. Specifika primrar designades baserat på denna sekvens, och ett fragment på cirka 1200 bp erhölls genom PCR-amplifiering med användning av Cistanches tubulosa flower cDNA som en mall (Figur 1). PCR-produkten gelutvanns och kopplades till vektorn pCE2TA/Blunt-Zero. Sekvenseringsresultaten överensstämde med transkriptomanalysen. Genen fick namnet CtCHS. Sekvenslängden är 1173 bp och kodar för 390 aminosyror.

Supportive Service Of Wecistanche - Den största cistanche-exportören i Kina:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Handla för fler specifikationer:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-butik

3.2 Bioinformatisk analys av CtCHS

3.2.1 CtCHS fysikaliska och kemiska egenskaper och transmembrandomänanalys

Onlineprogramvaran ProtParam användes för att analysera de fysikaliska och kemiska egenskaperna hos proteinet som kodas av CtCHS-genen. CtCHS kodar för 39 0 aminosyror, molekylformeln är C1908H3041N511O562S22, den relativa molekylmassan är 42 836.54, den teoretiska isoelektriska punkten är 5.85 och den är instabil. Koefficienten II är 43,24, vilket är ett instabilt protein, och den totala genomsnittliga hydrofiliciteten (GRAVY) är -0,052, vilket är ett hydrofilt protein. Onlineverktyget Prot Scale användes vidare för att analysera proteinets hydrofilicitet/hydrofobicitet. Analysresultaten visade att det maximala värdet för CtCHS-proteinets hydrofilicitet/hydrofobicitet var 2,422 (342) och minimivärdet var -2,489 (119). Aminosyrapeptidkedjan som kodas av CtCHS-genen har fler hydrofila aminosyrarester än hydrofoba aminosyrarester, så det är ett hydrofilt protein. Onlineprogramvaran TMHMM användes för att förutsäga proteinets transmembranstruktur. CtCHS-proteinet har ingen transmembrandomän.

Fig. 1 PCR-amplifiering av CtCHS-genen

3.2.2 Förutsägelse av sekundär struktur och tertiär struktur av CtCHS-protein

Onlineverktyget SOPMA användes för att förutsäga proteinets sekundära struktur. Resultaten visas i figur 2-A. 44,87 % -helixar, 31,03 % slumpmässiga spolar, 15,64 % förlängda kedjor och 8,46 % -sheets utgör den sekundära strukturen av CtCHS-proteinet. nivåstruktur. Onlineanalysmjukvaran SWISS-MODEL användes för att förutsäga den tertiära strukturen av proteinet, och kristallstrukturen för ris CHS1 användes som en mall för att förutsäga den tredimensionella strukturen av CtCHS-proteinet. Resultaten visas i figur 2-B. Konsistensen mellan Cistanche tubulosa CtCHS och ris CHS1 är 83,55 %.

3.2.3 Sekvensjämförelse och fylogenetisk trädanalys och tillämpning

DNAMAN-mjukvaran utför homologijämförelse mellan CtCHS och CHS-aminosyrasekvenserna för andra arter. Resultaten visas i figur 3-C. CtCHS-aminosyrasekvensen överensstämmer med Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) och Antirrhinum majus L. (P06515. 1), Mazus pumilus (NL Burman) Steenis (AAN05791.1), Erythranthe lewisiiG. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1 ) och Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_196897.1). Aminosyrasekvenserna för CHS är mycket lika, med likheten på 90,93 %, 90,68 %, 90,18 %, 89,42 %, 89,42 % och 81,61 %.

NATURLIGT ORGANISKT CISTANCHEEXTRAKT MED 30% ECHINACOSID OCH 12% ACTEOSID

Dessutom visade multipelsekvensanpassning också att CtCHS har konserverat katalytiska rester Cys164, His303 och Asn336. För att ytterligare förstå den evolutionära positionen för Cistanche tubulosa CtCHS i växt-CHS-familjen, användes MEGA-X-mjukvara för att konstruera ett fylogenetiskt träd mellan CtCHS- och CHS-proteiner från andra växter. Resultaten visas i figur 3-DE lewisii AHJ80976.1) ElCHS är nära besläktat.

3.3 CtCHS prokaryot uttryck och rening

pET-28a-CtCHS-plasmiden transformerades till E. coli-expressionsstam BL21 (DE3), och proteinexpression inducerades av IPTG vid låg temperatur. Proteinet renades med användning av en nickeljonaffinitetskromatografikolonn, och det renade proteinet detekterades med 10 % SDSPAGE. Resultaten visas i figur 3. CtCHS-proteinbandet visade sig nära 40,000, vilket överensstämmer med den relativa molekylmassan för CtCHS-proteinet på 42 800.

3.4 CtCHS-enzymaktivitetsanalys

För att identifiera funktionen av CtCHS inkuberades det renade CtCHS-proteinet med malonyl-CoA, 4-cumaroyl-CoA och produkterna detekterades med hjälp av HPLC och MS. Under naturliga förhållanden är naringenin-chalcone instabil i lösning och cykliseras lätt till naringenin. Därför valdes naringenin-chalcone och naringenin som standardkontroller.

HPLC-testresultaten visas i figur 4-A och B. Retentionstiden för enzymreaktionsprodukten liknar den för naringeninstandarden. Båda har maximal absorption vid 289 nm i UV-absorptionsspektrumet, vilket skiljer sig från retentionstiden för naringenin-chalcone. Tiden och UV-absorptionsspektra var olika, men som en negativ kontroll innehöll produkten efter inkubering av det högtemperaturinaktiverade CtCHS-proteinet med substratet inte naringenin, chalcone och naringenin. Ytterligare detektion genom masspektrometri, masspektrum på första nivån (Figur 4-C, D) visade att enzymreaktionsprodukten har [MH]-topp m/z271.060 97, medan naringenin har [MH] ]-topp m/z 271.060 91.

Vid jämförelse av MS2-spektra (Figur 5-E, F), har CtCHS-enzymreaktionsprodukten och naringenin båda karakteristiska fragmenttoppar vid m/z 107, 151 och 177, vilket överensstämmer med litteraturrapporten [19], vilket indikerar att CtCHS har chalkonkomplex. Enzymatisk aktivitet, den kan katalysera reaktionen mellan malonyl-CoA och 4-kumaroyl-CoA till naringenin-chalcone.

3.5 Subcellulär lokaliseringsanalys

För att studera CtCHS-proteinets roll i celler konstruerades pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS-plasmiden och transformerades till Arabidopsis thaliana-protoplaster för att observera dess subcellulära lokalisering. Resultaten visas i figur 5. Som kontroll distribuerades pCAMBIA1300-35S-GFP-proteinet i kärnan och cytoplasman, medan pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS-fusionsproteinet huvudsakligen distribuerades i cytoplasman, vilket indikerar att CtCHS-proteinet kan fungera i cytoplasman hos växtceller. Fungera.

3.6 CtCHS expressionsmönsteranalys

qRT-PCR användes för att detektera det relativa uttrycket av CtCHS i Cistanche deserticola-blommor med tre färger: vit, lila och röd. Resultaten visas i figur 6. Uttrycket av CtCHS i lila och röda blommor var signifikant högre än det i vita blommor. kvantitet. Jämfört med vita blommor är uttrycksnivån för CtCHS i lila blommor 8,44 gånger högre och uttrycksnivån för CtCHS i röda blommor är 3,21 gånger högre. Dessa resultat indikerar att förändringar i CtCHS-uttrycksnivåer kan vara relaterade till skillnaden i blomfärg hos Cistanche deserticola. Ju högre uttrycksnivå, desto mörkare är blomfärgen. , ju lägre uttrycksnivå, desto ljusare är blomfärgen.

****P＜0.000 1Fig. 6 Relativ uttrycksnivå för CtCHS i blommor med olika färger

4. Diskussion

CHS är ennyckelenzym i flavonoidernas biosyntesvägoch är relaterad till the reglering av blommans färgi många växter. Till exempel blomfärgen påDianthus chinensisL.[20] och Petunia × hybrida Hort. exVilm.[22] är alla påverkade av CHS. kontrollera.Cistanches tubulosahar huvudsakligen tre blomfärger: vit, röd och lila, men dess regleringsmekanism för blommor har ännu inte rapporterats. I denna studie klonades en CtCHS-gen genom att använda RT-PCRtranskriptomdataanalys av Cistanches tubulosa-blommor, och dess

Bioinformatik analysgenomfördes, och resultaten visade att CtCHS har hög likhet och nära genetiskt samband med aminosyrasekvensen för ElCHS av Physalis nigra (AHJ80976.1). CHS är ett typ III polyketidsyntas (PKSIII), och studier har funnit att CHS har en konserverad Cys-His-Asn-katalytisk triad [23]. I denna studie visade aminosyrasekvensanpassningsanalys att CtCHS har bevarat katalytiska rester Cys164, His303 och Asn336, vilket indikerar att CtCHS kan ha en typisk chalkonsyntasfunktion.

kunna. Enzymaktivitetsanalys utfördes med användning av prokaryot uttryck av CtCHS-protein i Escherichia coli och detekterades med HPLC och MS. Det visade sig att CtCHS-protein kan katalysera 4-kumaroyl-CoA och malonyl-CoA för att producera naringenin-chalcone.

CHS är involverat i syntesen av flavonoider i många växter, men dess subcellulära placering är olika i olika arter. Till exempel Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. Varje CHS[26] finns alla i cytoplasman, medan Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS

[27], aubergine Solanum melongena L. SmCHS [28] finns i cytoplasman och kärnan, och i druvan Vitis vinifera L. VvCHS är lokaliserad i cytoplasman, kärnan och cellväggen [29]. I denna studie användes pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS-plasmiden för att transformera Arabidopsis thaliana-protoplaster och det observerades att CtCHS-proteinet huvudsakligen var lokaliserat i cytoplasman och kan katalysera produktionen av naringenin-chalcone i cytoplasman till främja ackumulering av flavonoider.

Fenylpropanoidvägen förgrenar sig från 4-kumaroyl-CoA till flavonoidsyntesvägen och lignanbiosyntesvägen. CHS katalyserar 4-kumaroyl-CoA och malonyl-CoA för att generera naringenin och chalcone för att initiera flavonoider. Den biosyntetiska vägen för föreningsliknande föreningar är det första nyckelenzymet i denna väg [30]. Därför är starkt uttryckt CHS fördelaktigt för växter att ackumulera högre nivåer av flavonoider och producera mörkare blommor. Exempelvis är uttrycksnivån för CHS i lilablommiga varianter av Hosta plantaginea (Lam.) Aschers högre än för vitblommiga sorter. Hosta HpCHS omvandlas till tobak för att erhållas Jämfört med tobak av vildtyp har överexpressionsväxter mörkare kronblad och högre total antocyaninhalt [31].

I denna studie är uttrycksnivån för CtCHS-genen relaterad till färgen på Cistanches tubulosa-blommor. Det är mycket uttryckt i mörkare lila blommor och röda blommor, och är låg i ljusa vita blommor. Uttrycksskillnaden för CtCHS kan bero på skillnaden i Cistanches tubulosa-blommor. En av anledningarna till att ha olika kostymer och färger. Sammanfattningsvis klonade denna studie en CtCHS-gen från Cistanche deserticola-blommor och genomförde bioinformatikanalys på den. Det rekombinanta CtCHS-proteinet erhölls genom exogent uttryck i Escherichia coli. Enzymaktivitetsanalysen visade att CtCHS-proteinet kan katalysera 4-kumaroylkoenzym. A och malonyl-koenzym A genererar naringenin-chalcon. Det visade sig att CtCHS-genen är starkt uttryckt i lila och röda blommor och låg i vita blommor. Dessa resultat indikerar att CtCHS-genen kan reglera produktionen av olika blomfärger i Cistanche deserticola, vilket är fördelaktigt för vidare forskning om regleringsmekanismen för Cistanche tubulosa blomfärg och ger en referens för efterföljande forskning om rollen av CtCHS i regleringen av blomfärg i Cistanche deserticola.