Kloning, funktionell identifiering och expressionsanalys av Chalcone Syntas från Cistanche Tubulosa

Sammanfattning: Mål

Att studera funktionen avchalcone syntas från Cistanche tubulosaoch uttrycksmönstret för CtCHS-genen i vita, röda och lila blommor.

MetoderCtCHS-genen klonades med RT-PCR och bioinformatikanalys utfördes. pET-28a-CtCHS-plasmiden överfördes till Escherichia coli för att inducera proteinuttryck av IPTG. Det rekombinanta CtCHS-proteinet inkuberades med substraten p-cumaroyl CoA och malonyl CoA, och produkterna detekterades med HPLC och MS. pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS-plasmiden överfördes till protoplasten av Arabidopsis thaliana för att observera den subcellulära lokaliseringen av CtCHS-proteinet. Expressionsmönstret för CtCHS-genen i blommorna av C. tubulosa med tre färger detekterades med qRT-PCR.

ResultatEn CtCHS-gen klonades. Längden på den öppna läsramen (ORF) var 1173 bp, kodande för 390 aminosyror, och proteinets molekylvikt var 42 8000.

ORGANISKT CISTANCHEEXTRAKT MED 30 % ECHINACOSID OCH 12 % ACTEOSID

CtCHS innehöll de katalytiska resterna Cys164, His303, Asn336, vilka konserverades i kalkonsyntas. CtCHS-proteinet uttrycktes i E. coli och renades för att erhålla det rekombinanta proteinet. CtCHS-protein skulle kunna katalysera p-cumaroyl CoA och malonyl CoA för att producera naringeninkalkon. CtCHS-protein var huvudsakligen lokaliserat i cytoplasman. CtCHS-genen uttrycktes starkt i lila och röda blommor, och de relativa uttrycksnivåerna var 8,44 respektive 3,21 gånger högre än i vita blommor.

Slutsats En CtCHS-gen klonades från blomman av C. tubulosa och protein uttrycktes. CtCHS-protein har chalkonsyntasfunktion, och uttrycket av CtCHS-genen är högre i mörkare blommor, vilket indikerar att CtCHS-genen kan reglera blomfärgen hos C. tubulosa, vilket lägger en grund för vidare forskning om regleringsmekanismen för blomfärgen hos C. tubulosa.

Nyckelord: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; kalkonsyntas; enzymaktivitetsanalys; subcellulär lokalisering; uttrycksanalys

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT är släktet Pyrealväxt, som är naturligt fördelad i södra Xinjiang [1] i Hetian-området i Xinjiang [2]. Pipblommorna har högt medicinskt värde. Dess köttstjälkar är en av källorna till 2020 års version av "Kinesisk farmakopé". [3] Forskningen om pipblommorna cordonus köttstjälkar har ökat, men det finns relativt lite biologisk forskning på dess blommor. Blomningsperioden för pipblommorna är från april till maj [4], huvudsakligen Det finns tre färger vitt. , röda och lila Pipblommorna är rika på färg, men deras blomfärgsregleringsmekanism har inte rapporterats och genetiska faktorer [5] Pigmentet i växtblommor inkluderar huvudsakligen tre kategorier: flavonoider, karoten och beetin, det mest utbredda Stora färgområdet [7] som de tre sorterna av Paeonia Lactiflora Pall.

Det ser ut som vitt, och huvudfärgen på färgen innehåller färgen på det röda och vacker kompetens gör att blommorna presenteras som lila-röda [8]. Blomfärg är en viktig egenskap hos många prydnadsväxter, och det är också nyckelfaktorn som attraherar de rosa insekterna [9]. Studier har visat att den förs vidare. Den högsta frekvensen av insektsbesök är den djuplila cistancheväxten [10]. För biologisk forskning om den syntetiska genetiska forskningen av cistanoider i tubblomman cistanosaurusblommor, är det gynnsamt att förtydliga tubblommans kordonfärgningskontrollmekanism, vilket ger teoretisk grund för att förbättra färgen på genteknikteknik, främja dess rikare färger, öka visningen, utöka tillämpningsområdet.

Den biosyntetiska vägen förflavonoiderbörjar medfenylpropanoidväg. Fenylalanin omvandlas först till kanelsyra under inverkan av fenylalanin ammonialyas (PAL), och kanelsyra 4-hydroxyleras av kanelsyra. Enzymet (kanelsyra-4-hydroxylas, C4H) och 4-kumaratkoenzym A-ligas (4-kumaratkoenzym A-ligas, 4CL) katalyserar reaktionen för att generera 4-kumaroyl-CoA [11]. En molekyl av 4-kumaroyl-CoA och tre molekyler av malonyl-CoA katalyseras av chalcone syntas (CHS) för att generera naringenin chalcone, som harflavonoidföreningar.Det grundläggande skelettet av chalkonisomeras, flavanon-3-hydroxylas, dihydroflavonol 4-reduktas, etc. genererar en mängd olika flavonoider som isoflavoner, flavonoler, antocyaniner, etc. [12]. Som ett nyckelenzym i flavonoidernas biosyntesväg reglerar CHS innehållet av flavonoider i växter och spelar också en viktig roll för att reglera växternas blomfärg [13]. Till exempel kan post-transkriptionell gentystnad av Gentiana scabra Bunge CHS hämma biosyntesen av antocyaniner och orsaka specifik blekning av kronlober [14]. CHS-genavstängning av Actinidia eriantha Benth. CHS minskar antocyaninhalten i kronbladen och orsakar Färgen på de röda kronbladen blir ljusare [15]. Därför, i denna studie, klonades en CtCHS-gen från Cistanche deserticola-blommor, och bioinformatikanalys, prokaryot uttryck och rening, enzymaktivitetsanalys, subcellulär lokaliseringsanalys och uttrycksanalys i tre färger av blommor utfördes på den för att utforska funktionen av CtCHS protein och uttrycksmönstret för CtCHS-genen användes för att preliminärt utforska förhållandet mellan CtCHS och Cistanche deserticola blomfärg, vilket lade grunden för studiet av den reglerande mekanismen för Cistanche deserticola blomfärg.

1 Material och instrument

1.1 Material

Cistanche tuberosa-blommor samlades in från Yutian County, Hotan Prefecture, Xinjiang i maj 2018. Den slumpmässiga principen följdes under provtagningen, och Cistanche tuberosa-blommor med god fysiologisk status och konsekvent planthöjd valdes ut. Tre stammar av Cistanche deserticola med tre blomfärger av vitt, rött och lila togs och identifierades som Cistanche tubulosa (Schenk) Wight av professor Tu Pengfei vid Peking University School of Pharmacy. De frystes snabbt i flytande kväve, lagrades på torris och transporterades till Peking. E. coli DH5 kemiskt kompetenta celler köptes från Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., och E. coli BL21 (DE3) kemiskt kompetenta celler köptes från Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektorn köptes från Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA köptes från Sigma Company, 4-coumaroyl-CoA, naringenin -chalcone köptes från Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., och naringenin köptes från Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Instrument

Nanodrop 2000C spektrofotometer (Thermo Fisher Company, USA); gradient PCR-instrument (Eppendorf Company, Tyskland); CFX 96 fluorescens kvantitativt PCR-instrument, UVP-gelimager, gelelektroforesinstrument, proteinelektroforesinstrument (BioRad Company, USA) ;EnSpire

Mikroplattläsare (PerkinElmer Company, USA); konstant temperatur inkubator (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D stor kapacitet fulltemperaturoscillator (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82En oscillator med konstant temperatur i vattenbad (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH ultraren arbetsbänk (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); högtrycksångsterilisator (TOMY Company, Japan); Milli Q rentvatteninstrument (Millipore, USA); LC-20En högeffektiv vätskefaskromatograf (Shimadzu Company, Japan); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap högupplöst masspektrometri (Thermo Fisher Company, USA); FV1200 laserkonfokalmikroskop (Olympus Company, Japan).

2 Experimentella metoder

2.1 RNA-extraktion och cDNA-syntes. Cistanche deserticola-blommor maldes i flytande kväve och utsattes sedan för RNA-extraktionsanalys.

Totalt RNA extraherades med hjälp av ett kit (Norgen, Cat 17200), RNA-koncentrationen och kvaliteten detekterades med NanoDrop 2000C, och RNA-prover med ett A260/A280-förhållande mellan 1,8 och 2,1 valdes för omvänd transkriptionssyntes av cDNA. M-MLV omvänt transkriptas (Promega, M170B) användes för att omvänt transkribera det kvalificerade totala RNA:t till cDNA. De experimentella operationerna utfördes enligt instruktionerna.

2.2 Kloning av CtCHS-genen

Baserat på Cistanche deserticola blomma transkriptomdata från vår forskargrupp [16], en CtCHS med en fullständig öppen läsram sållades bort, och SnapGene programvara användes för att designa specifika primrar baserat på gensekvensen (tabell 1). PCR-amplifiering utfördes med användning av Cistanche deserticola flower cDNA som mall. Amplifieringssystemet var 2×Phanta Max Buffer 25 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, uppströms och nedströms primers (10 μmol/L) 2 μL vardera, cDNA 2 μL, Phanta Max SuperFidelity

DNA-polymeras 1 μL, ddH2O 17 μL. Reaktionsbetingelserna var: fördenaturering vid 95 grader under 3 min; 25 cykler av denaturering vid 95 grader i 15 s, hybridisering vid 55 grader i 15 s, och förlängning vid 72 grader i 1 min; och reaktionsförlängning vid 72 grader i 5 min. PCR-produkten detekterades med 1 % agarosgelelektrofores, och DNA-reningssatsen (Novizan, Cat DC301-01) användes för gelåtervinning, och sedan renades det återvunna DNA:t med ett kit för snabb kloning (Novizan, Cat) C601-01). DNA-fragmentet ligerades med pCE2 TA/Blunt-Zero-vektorn, transformerades in i Escherichia coli DH5-kompetenta celler, och efter odling över natten vid 37 grader selekterades enkla klonstammar och skickades till företaget för sekvensering.

Tabell 1 Primersekvenser

2.3 Bioinformatikanalys

Använd ProtParam onlineprogramvara för att analysera proteinfysiska och kemiska egenskaper; använd Prot Scale onlineverktyg för att analysera proteinhydrofilicitet/hydrofobicitet; använd onlineverktyget SOPMA för att förutsäga proteinets sekundära struktur; använd online analysmjukvara SWISS-MODEL för att förutsäga protein tertiär struktur; använd onlineprogramvara TMHMM Förutsäg proteinets transmembranstruktur; använd DNAMAN-mjukvara för att jämföra homologin för CtCHS med CHS-aminosyrasekvenserna för andra arter; använd MEGA-X-mjukvaran för att konstruera ett fylogenetiskt träd, med hjälp av grannkoppling (NJ) och Poisson-korrigering. Det evolutionära avståndet beräknas med Bootstrap-metoden och antalet Bootstrap-repetitioner är 1000 gånger.

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS användes för ytterligare detektion. Vätskefasförhållandena var Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 kolumn (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), kolonntemperatur 40 grader, naringenin , chalcone och naringenin. Laddningsvolymen för kontrollämnet är 4 μL och laddningsvolymen för enzymreaktionsprodukten är 7 μL. Vatten (A)-acetonitril (B) används som den mobila fasen. Elueringsgradienten är: O till 5 min, 30 % B; 5 till 15 min. 30%-60% B; 15~20 min, 60%~100% B; 20~25 min, 100% B; 25~31 min, 100%~30% B. Den volymetriska flödeshastigheten är 0,3 ml/min. Masspektrometriförhållandena är elektrosprayjonkälla, kväve som bärargas, mantelgastryck 3,5 MPa, hjälpgastryck 1,0 MPa, spraytryck 3500 V, kapillärtemperatur 350 grader, hjälpgasuppvärmningstemperatur 200 grader, positiva och negativa jonlägen, skanning jonintervall m/z är 100-1500, Full MS-upplösning är 35 000, dd-MS2-upplösning är 17 500, (N)

CE/stegad nce inställd på 35, 60.

2.6 Subcellulär lokalisering av CtCHS-protein

Baserat på CtCHS-sekvensen och principen för sömlös kloning designades primrar med enzymskärningsställen Kpn Ⅰ och BamH Ⅰ, och motsvarande målfragment amplifierades med PCR. pCAMBIA1300-35S-GFP-plasmiden digererades med restriktionsendonukleaserna Kpn Ⅰ och BamH Ⅰ, och målfragmentet och vektorn kopplades samman genom det sömlösa kloningssatsen (Novizan, Cat C115-01) och överfördes sedan in i E. coli DH5-kompetenta celler. , välj enkla klonstammar för sekvensering och extrahera plasmider från de korrekta stammarna. Plasmiderna pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS och pCAMBIA 1300-35S-GFP transformerades till Arabidopsis thaliana-protoplaster med PEG4000 och odlades under svagt ljus i 8 till 10 timmar. Den subcellulära lokaliseringen av CtCHS-protein observerades under ett konfokalt lasermikroskop.

2.7 CtCHS expressionsmönsteranalys

Baserat på CtCHS-sekvensen användes DNAMAN för att designa kvantitativa fluorescensprimrar i realtid, med F-box som den interna referensgenen. Primersekvenserna visas i tabell 1. Det relativa uttrycket av CtCHS i Cistanche deserticola-blommor av olika färger detekterades genom realtidsfluorescenskvantitativ PCR. Använd TransStart Green qPCR SuperMix (full guld, AQ101-02) för att mäta med SYBR Green fluorescerande färgmetod, reaktionssystem: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, uppströms och nedströms primers (10

μmol/L) {{0}},2 μL vardera, cDNA-mall 0,5 μL, nukleotidasfritt vatten 4,1 μL, en tvåstegsmetod användes för reaktionen, och reaktionsproceduren baserades på metoden av Dong Xianjuan et al. [18]. Varje prov innehöll 3 biologiska replikat, och experimentet upprepades tre gånger. Experimentella data analyserades med Excel till 2

Det relativa uttrycket av CtCHS beräknades med −ΔΔCt-metoden, och GraphPad Prism 8 användes för att utföra signifikansanalys och rita histogram.