Kloning, funktionell identifiering och expressionsanalys av Chalcone Syntas från Cistanche Tubulosa
Mar 25, 2024
Sammanfattning: Mål Att studera funktionen av chalkonsyntas från Guanhuaroucongrong (Cistanche tubulosa) och uttrycksmönstret för CtCHS-genen i vita, röda och lila blommor.
Metoder CtCHS-genen klonades genom RT-PCR och bioinformatikanalys utfördes. pET-28a-CtCHS-plasmiden överfördes till Escherichia coli för att inducera proteinuttryck av IPTG. Det rekombinanta CtCHS-proteinet inkuberades med substraten p-cumaroyl CoA och malonyl CoA, och produkterna detekterades med HPLC och MS. pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS-plasmiden överfördes till protoplasten av Arabidopsis thaliana för att observera den subcellulära lokaliseringen av CtCHS-proteinet. Uttrycksmönstret av CtCHSgene i blommorna avC. tubulosamed tre färger detekterades med qRT-PCR.
Resultat En CtCHS-gen klonades. Längden på den öppna läsramen (ORF) var 1173 bp, kodande för 390 aminosyror, och proteinets molekylvikt var 42 8000. CtCHS innehöll de katalytiska resterna Cys164, His303, Asn336, som konserverades i kalkonsyntas. CtCHSproteinet uttrycktes i E. coli och renades för att erhålla det rekombinanta proteinet. CtCHS-protein kan katalysera p-cumaroyl CoA och malonyl CoA för att producera naringeninkalkon. CtCHS-protein var huvudsakligen lokaliserat i cytoplasman. CtCHS-genen uttrycks kraftigt i lila och röda blommor, och de relativa uttrycksnivåerna var 8,44 respektive 3,21 gånger högre än i vita blommor.
Slutsats En CtCHS-gen klonades från blomman avC. tubulosaoch protein uttrycktes. CtCHSprotein har chalkonsyntasfunktion, och uttrycket av CtCHS-genen är högre i mörkare blommor, vilket indikerar att CtCHSgene kan reglera blomfärgen hos C. tubulosa, vilket lägger en grund för vidare forskning omregleringsmekanism för blomfärgen hos C. tubulosa.
Nyckelord:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; chalkonsyntas; enzymaktivitetsanalys; subcellulär lokalisering; uttrycksanalys
KLICKA HÄR FÖR ATT FÅ NATURLIGT EKOLOGISKT CISTANCHEEXTRAKT MED 30% ECHINACOSID OCH 12% ACTEOSIDE
Supportive Service Of Wecistanche - Den största cistanche-exportören i Kina:
E-post:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Handla för fler specifikationer:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-butik
Den biosyntetiskaflavonoidernas vägbörjar med fenylpropanoidvägen.Fenylalaninomvandlas först till kanelsyra underverkan av fenylalanin ammonialyas(PAL), och kanelsyra 4-hydroxyleras av kanelsyra. Enzymet (kanelsyra-4-hydroxylas, C4H) och 4-kumaratekoenzym A-ligas (4-kumaratekoenzym A-ligas, 4CL) katalyserar reaktionen för att generera 4-kumaroyl-CoA [11 ]. En molekyl av 4-kumaroyl-CoA och tre molekyler av malonyl-CoA katalyseras av chalcone syntas (CHS) för att generera naringenin chalcone, som har flavonoidföreningar. Grundskelettet av chalcone isomerase, flavanon{12}}hydroxylas, dihydroflavonol 4-reduktas, etc. genererar en mängd olika flavonoider såsom isoflavoner, flavonoler, antocyaniner, etc. [12]. Som ett nyckelenzym i flavonoidernas biosyntesväg reglerar CHS innehållet av flavonoider i växter och spelar också en viktig roll för att reglera växternas blomfärg [13]. Till exempel kan post-transkriptionell gentystnad av Gentiana scabra Bunge CHS hämma biosyntesen av antocyaniner och orsaka specifik blekning av kronlober [14]. CHS-genavstängning av Actinidia erianthaBenth. CHS minskar antocyaninhalten i kronbladen och gör kronbladen röda. Kronbladen blir ljusare i färgen[15]. I denna studie klonades därför en CtCHS-gen från Cistanche tubulosa-blommor, och bioinformatikanalys, prokaryotisk uttryck och rening, enzymaktivitetsanalys, subcellulär lokaliseringsanalys och uttrycksanalys i tre färger av blommor utfördes på den för att utforska funktionen av CtCHS protein och uttrycksmönstret för CtCHS-genen användes för att preliminärt utforska förhållandet mellan CtCHS och Cistanche tubulosa blomfärg, vilket lade grunden för studiet av regleringsmekanismen förCistanche tubulosa blomfärg.
1 Material och instrument
1.1 Material
Cistanche tubulosa-blommor samlades in från Yutian County, Hotan Prefecture, Xinjiang i maj 2018. Den slumpmässiga principen följdes under provtagningen och Cistanche tubulosa-blommor med god fysiologisk status och konsekvent planthöjd valdes ut. Tre stammar av Cistanche tubulosa med tre blomfärger av vitt, rött och lila togs och identifierades som Cistanche tubulosa (Schenk) Wight av professor Tu Pengfei vid Peking University School of Pharmacy. De frystes snabbt i flytande kväve och transporterades sedan till Peking i torrisförråd. E. coli DH5 kemiskt kompetenta celler köptes från Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., och E. coli BL21 (DE3) kemiskt kompetenta celler köptes från Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektorn köptes från Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA köptes från Sigma Company, 4-coumaroyl-CoA, naringenin -chalcone köptes från Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., och naringenin köptes från Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.
1.2 Instrument
Nanodrop 2000C spektrofotometer (Thermo Fisher Company, USA); gradient PCR-instrument (Eppendorf Company, Tyskland); CFX 96 fluorescens kvantitativt PCR-instrument, UVP-gelimager, gelelektroforesinstrument, proteinelektroforesinstrument (BioRad Company, USA) ;EnSpire
Mikroplattläsare (PerkinElmer Company, USA); konstant temperatur inkubator (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D stor kapacitet fulltemperaturoscillator (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82En oscillator med konstant temperatur i vattenbad (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH ultraren arbetsbänk (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); högtrycksångsterilisator (TOMY Company, Japan); Milli Q rentvatteninstrument (Millipore, USA); LC-20En högeffektiv vätskefaskromatograf (Shimadzu Company, Japan); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap högupplöst masspektrometri (Thermo Fisher Company, USA); FV1200 laserkonfokalmikroskop (Olympus Company, Japan).
2 Experimentella metoder
2.1 RNA-extraktion och cDNA-syntes.
Cistanche tubulosa-blommor maldes i flytande kväve och utsattes sedan för RNA-extraktionsanalys.
Totalt RNA extraherades med ett kit (Norgen, Cat 17200), RNA-koncentrationen och kvaliteten detekterades med NanoDrop 2000C, och RNA-prover med ett A260/A280-förhållande mellan 1,8 och 2,1 valdes ut för omvänd transkription för att syntetisera cDNA. M-MLV omvänt transkriptas (Promega, M170B) användes för att omvänt transkribera det kvalificerade totala RNA:t till cDNA. De experimentella operationerna utfördes enligt instruktionerna.
2.2 Kloning av CtCHS-genen
Baserat på Cistanche tubulosa blomma transkriptom data från vår forskargrupp [16], en CtCHS med en fullständig öppen läsram sållades bort, och SnapGene programvara användes för att designa specifika primrar baserat på gensekvensen (tabell 1). PCR-amplifiering utfördes med användning av Cistanche tubulosa flower cDNA som mall. Amplifieringssystemet var 2×Phanta Max Buffer 25 μL, dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL, uppströms och nedströms primers (10 μmol/L) 2 μL vardera, cDNA 2 μL, Phanta Max SuperFidelity DNA Polymerase 1 μL, ddH2O 17 μL. Reaktionsbetingelserna var: fördenaturering vid 95 grader under 3 min; 25 cykler av denaturering vid 95 grader i 15 s, hybridisering vid 55 grader i 15 s, och förlängning vid 72 grader i 1 min; reaktionsförlängning vid 72 grader i 5 min. PCR-produkten detekterades med 1 % agarosgelelektrofores, och DNA-reningssatsen (Novizan, Cat DC301-01) användes för gelåtervinning, och sedan renades det återvunna DNA:t med ett kit för snabb kloning (Novizan, Cat) C601-01). DNA-fragmentet ligerades med pCE2TA/Blunt-Zero-vektorn, transformerades in i Escherichia coli DH5-kompetenta celler, och efter odling över natten vid 37 grader selekterades enkla klonstammar och skickades till företaget för sekvensering.
Tabell 1 Primersekvenser
2.3 Bioinformatikanalys
Använd ProtParam onlineprogramvara för att analysera proteinfysiska och kemiska egenskaper; använd Prot Scale onlineverktyg för att analysera proteinhydrofilicitet/hydrofobicitet; använd onlineverktyget SOPMA för att förutsäga proteinets sekundära struktur; använd online analysmjukvara SWISS-MODEL för att förutsäga protein tertiär struktur; använd onlineprogramvara TMHMM Förutsäg proteinets transmembranstruktur; använd DNAMAN-mjukvara för att jämföra homologin för CtCHS med CHS-aminosyrasekvenserna för andra arter; använd MEGA-X-mjukvaran för att konstruera ett fylogenetiskt träd, med hjälp av grannkoppling (NJ) och Poisson-korrigering. Det evolutionära avståndet beräknas med Bootstrap-metoden och antalet Bootstrap-repetitioner är 1000 gånger.
2.4 CtCHS prokaryot uttryck och rening
Designa primrar med restriktionsställen BamHⅠ och XhoⅠ baserat på CtCHS-sekvensen, och PCR amplifierar motsvarande målfragment. pET-28a-vektorn och målfragmentet digererades med användning av endonukleaser BamHI och Den klonade stammen sekvenseras och plasmiden extraheras efter korrekt sekvensering. pET-28a-CtCHS-plasmiden verifierad genom sekvensering överfördes till Escherichia coli BL21 (DE3) kompetenta celler. Se metoden enligt Ding Ning et al. [17] med isopropyl
-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) användes för att inducera proteinuttryck vid låg temperatur och renades genom Ni2+ affinitetskromatografikolonn (Cytiva, Cat 17531901). Proteinet koncentrerades genom centrifugering i ett ultrafiltreringsrör (Millipore, 30 000) och avsaltades. Förvara i 20 mmol/L KPB-buffert (pH 8,0, innehållande 1 mmol/LEDTA) och förvara i ett -80 graders kylskåp för långtidsförvaring.
2.5 CtCHS enzymaktivitetsanalys
CtCHS enzymreaktionssystem: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroyl-CoA 2 μL, CtCHS rekombinant protein 20 μL, i Efter att ha reagerat i ett vattenbad vid 37 grader i 12 timmar extraherades blandningen tre gånger med 800 μL etylacetat, torkades genom kväveflöde och löstes sedan i 100 μL metanol. Använd högpresterande vätskekromatografi för att detektera produkten. Förutsättningarna är Ultimate LP-C18-kolonn (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), kolonntemperatur 30 grader, provvolym 10 μL och vatten (A) och acetonitril (B) som flöde. Fas, elueringsgradient: 0~10
min, 30 % B; 10~20 min, 30%~60% B; 20~25 min, 60%~70% B; 25~30 min, 70%~80% B; 30~35 min, 80%~100% B; 35-40 min, 100 % B; 40-46 min, 100%-30% B. Den volymetriska flödeshastigheten är 1 ml/min och detektionen är vid en våglängd på 290 nm.
UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS användes för ytterligare detektion. Vätskefasförhållandena var Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 kolumn (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), kolonntemperatur 40 grader, naringenin- chalcone och naringenin kontroller. Produktens laddningsvolym är 4 μL och laddningsvolymen för enzymreaktionsprodukten är 7 μL. Vatten (A)-acetonitril (B) används som den mobila fasen. Elueringsgradienten är: O till 5 min, 30 % B; 5 till 15 min, 30 %-60% B; 15-20 min, 60 %-100 % B; 20-25 min, 100 % B; 25-31 min, 100%-30% B. Den volymetriska flödeshastigheten är 0,3 ml/min. Masspektrometriförhållandena är elektrosprayjonkälla, kväve som bärargas, mantelgastryck 3,5 MPa, hjälpgastryck 1,0 MPa, spraytryck 3500 V, kapillärtemperatur 350 grader, hjälpgasuppvärmningstemperatur 200 grader, positiva och negativa jonlägen, skanning jonintervall m/z är 100-1500, Full MS-upplösning är 35 000, dd-MS2-upplösning är 17 500, (N)
CE/stegad nce inställd på 35, 60.
2.3 Bioinformatikanalys
Använd ProtParam onlineprogramvara för att analysera proteinfysiska och kemiska egenskaper; använd Prot Scale onlineverktyg för att analysera proteinhydrofilicitet/hydrofobicitet; använd onlineverktyget SOPMA för att förutsäga proteinets sekundära struktur; använd online analysmjukvara SWISS-MODEL för att förutsäga protein tertiär struktur; använd onlineprogramvara TMHMM Förutsäg proteinets transmembranstruktur; använd DNAMAN-mjukvara för att jämföra homologin för CtCHS med CHS-aminosyrasekvenserna för andra arter; använd MEGA-X-mjukvaran för att konstruera ett fylogenetiskt träd, med hjälp av grannkoppling (NJ) och Poisson-korrigering. Det evolutionära avståndet beräknas med Bootstrap-metoden och antalet Bootstrap-repetitioner är 1000 gånger.
2.4 CtCHS prokaryot uttryck och rening
Designa primrar med restriktionsställen BamHⅠ och XhoⅠ baserat på CtCHS-sekvensen, och PCR amplifierar motsvarande målfragment. pET-28a-vektorn och målfragmentet digererades med användning av endonukleaser BamHI och Den klonade stammen sekvenseras och plasmiden extraheras efter korrekt sekvensering. pET-28a-CtCHS-plasmiden verifierad genom sekvensering överfördes till Escherichia coli BL21 (DE3) kompetenta celler. Se metoden enligt Ding Ning et al. [17] med isopropyl
-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) användes för att inducera proteinuttryck vid låg temperatur och renades genom Ni2+ affinitetskromatografikolonn (Cytiva, Cat 17531901). Proteinet koncentrerades genom centrifugering i ett ultrafiltreringsrör (Millipore, 30 000) och avsaltades. Förvara i 20 mmol/L KPB-buffert (pH 8,0, innehållande 1 mmol/LEDTA) och förvara i ett -80 graders kylskåp för långtidsförvaring.
2.5 CtCHS enzymaktivitetsanalys
CtCHS enzymreaktionssystem: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroyl-CoA 2 μL, CtCHS rekombinant protein 20 μL, i Efter att ha reagerat i ett vattenbad vid 37 grader i 12 timmar extraherades blandningen tre gånger med 800 μL etylacetat, torkades genom kväveflöde och löstes sedan i 100 μL metanol. Använd högpresterande vätskekromatografi för att detektera produkten. Förutsättningarna är Ultimate LP-C18-kolonn (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), kolonntemperatur 30 grader, provvolym 10 μL och vatten (A) och acetonitril (B) som flöde. Fas, elueringsgradient: 0~10
min, 30 % B; 10~20 min, 30%~60% B; 20~25 min, 60%~70% B; 25~30 min, 70%~80% B; 30~35 min, 80%~100% B; 35-40 min, 100 % B; 40-46 min, 100%-30% B. Den volymetriska flödeshastigheten är 1 ml/min och detektionen är vid en våglängd på 290 nm.
UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS användes för ytterligare detektion. Vätskefasförhållandena var Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 kolumn (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), kolonntemperatur 40 grader, naringenin- chalcone och naringenin kontroller. Produktens laddningsvolym är 4 μL och laddningsvolymen för enzymreaktionsprodukten är 7 μL. Vatten (A)-acetonitril (B) används som den mobila fasen. Elueringsgradienten är: O till 5 min, 30 % B; 5 till 15 min, 30 %-60% B; 15-20 min, 60 %-100 % B; 20-25 min, 100 % B; 25-31 min, 100%-30% B. Den volymetriska flödeshastigheten är 0,3 ml/min. Masspektrometriförhållandena är elektrosprayjonkälla, kväve som bärargas, mantelgastryck 3,5 MPa, hjälpgastryck 1,0 MPa, spraytryck 3500 V, kapillärtemperatur 350 grader, hjälpgasuppvärmningstemperatur 200 grader, positiva och negativa jonlägen, skanning jonintervall m/z är 100-1500, Full MS-upplösning är 35 000, dd-MS2-upplösning är 17 500, (N)
CE/stegad nce inställd på 35, 60.
2.6 Subcellulär lokalisering av CtCHS-protein
Baserat på CtCHS-sekvensen och principen för sömlös kloning designades primrar med enzymskärningsställen Kpn Ⅰ och BamH Ⅰ, och motsvarande målfragment amplifierades med PCR. pCAMBIA1300-35S-GFP-plasmiden digererades med restriktionsendonukleaserna Kpn Ⅰ och BamH Ⅰ, och målfragmentet och vektorn kopplades samman genom det sömlösa kloningssatsen (Novizan, Cat C115-01) och överfördes sedan in i E. coli DH5-kompetenta celler. , välj enkla klonstammar för sekvensering och extrahera plasmider från de korrekta stammarna. Plasmiderna pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS och pCAMBIA 1300-35S-GFP transformerades till Arabidopsis thaliana-protoplaster med PEG4000 och odlades under svagt ljus i 8 till 10 timmar. Den subcellulära lokaliseringen av CtCHS-protein observerades under ett konfokalt lasermikroskop.
2.7 CtCHS expressionsmönsteranalys
Fluorescerande kvantitativa primrar i realtid designades med DNAMAN baserad på CtCHS-sekvensen, med F-box som den interna referensgenen. Primersekvenserna visas i tabell 1. Det relativa uttrycket av CtCHS i Cistanche tubulosa-blommor av olika färger detekterades genom realtidsfluorescerande kvantitativ PCR. Använd TransStart Green qPCR SuperMix (helguld, AQ101-02) för att mäta med SYBRGreen fluorescerande färgmetoden. Reaktionssystem: 2×TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μL, uppströms och nedströms primers (10 μmol/L) 0,2 μL vardera, cDNA-mall 0,5 μL, 4,1 μL nukleotidasfritt vatten användes för reaktionen med en tvåstegsmetod. Reaktionsförfarandet baserades på metoden enligt Dong Xianjuan et al. [18]. Varje prov innehöll 3 biologiska replikat, och experimentet upprepades tre gånger. Experimentdata analyserades med Excel, det relativa uttrycket av CtCHS beräknades med 2−ΔΔCt-metoden och GraphPadPrism 8 användes för att utföra signifikansanalys och rita histogram.
