Kombinerad pangenomik och transkriptomik avslöjar kärna och redundanta virulensprocesser i en snabbt utvecklande svampväxtpatogen
Dec 05, 2023
Abstrakt
Bakgrund
Att studera genomisk variation i snabbt utvecklande patogener möjliggör potentiellt identifiering av gener som stöder deras "kärnbiologi", är närvarande, funktionella och uttrycks av alla stammar eller "flexibel biologi", varierande mellan stammar. Gener som stöder flexibel biologi kan anses vara "tillbehör", medan "kärngen"-genuppsättningen sannolikt är viktig för gemensamma egenskaper hos en patogen artbiologi, inklusive virulens på alla värdgenotyper. Den vetepatogena svampen Zymoseptoria tritici representerar ett av de snabbast utvecklande hoten mot den globala livsmedelsförsörjningen och var i fokus för denna studie.
cistanche fördelar för män stärker immunförsvaret
Klicka här för att se produkter från Cistanche Enhance Immunity
【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Resultat
Vi konstruerade ett pangenom av 18 europeiska fältisolat, där 12 också utsattes för RNAseq-transkriptionsprofilering under infektion. Genom att kombinera dessa data förutspådde vi en "kärn"-genuppsättning innefattande 9807 sekvenser som var (1) närvarande i alla isolat, (2) saknade inaktiverande polymorfismer och (3) uttrycks av alla isolat. Ett stort accessoriskt genom, bestående av 45 % av de totala generna, definierades också. Vi klassificerade genetisk och genomisk polymorfism på både kromosomala och individuella genskalor. Proteiner som krävs för väsentliga funktioner inklusive virulens hade lägre sekvensvariabilitet än genomsnittet bland kärngener. Både kärn- och accessoargenom kodade för många små, utsöndrade kandidateffektorproteiner som sannolikt interagerar med växtimmunitet. Viral vektormedierad transient i planta överuttryck av 88 kandidater misslyckades med att identifiera någon som inducerade bladnekros som är karakteristisk för sjukdomen. Funktionell komplementering av en icke-patogen deletionsmutant som saknar fem kärngener visade emellertid att full virulens återställdes genom återinförande av den enda genen som uppvisade minst sekvenspolymorfism och högsta uttryck.
Slutsatser
Dessa data stödjer den kombinerade användningen av pangenomics och transcriptomics för att definiera gener som representerar kärnan, och potentiellt exploaterbara, svagheter i snabbt utvecklande patogener.
Nyckelord
Foxtail mosaikvirus, Septoria tritici, Necrotrophic effector, Essential gener, Accessory chromosomes, Dothideomycetes,Kromosominstabilitet, Mycosphaerella spp
Bakgrund
Den hållbara kontrollen av infektionssjukdomar som drabbar djur och växter utmanas av utvecklingen av kausala mikroorganismer [1, 2]. De sjukdomar som är svårast att kontrollera är de som orsakas av de arter som utvecklas snabbast, som snabbt kan reagera på selektiva påfrestningar, inklusive naturlig värdimmunitet, ogynnsamma miljöförhållanden och/eller anti-infektionsläkemedel [1, 3]. Potentialen för mikrobiella patogener att snabbt utvecklas bestäms av flera egenskaper, inklusive bland annat; (1) snabb livscykel och (2) mekanismer som främjar sexuell reproduktion [4]. Det senare kan leda till stora nivåer av stående genetisk variation som finns inom patogenpopulationer som kan upprätthållas och förstärkas inför externa selektiva påtryckningar. Även om särskilda gener sannolikt kommer att uppvisa naturlig genetisk sekvensvariation, som driver deras utveckling, kan andra inte gå förlorade (eller inaktiveras av mutation) utan att påverka en patogens kondition. För eukaryota och prokaryota växtpatogener har denna skillnad i nivåer av polymorfismer mellan gener lett till förverkligandet av "tvåhastighetsgenom" [5], som omfattar några komponenter som snabbt utvecklas och tros svara på externa drivkrafter (värdområde och immunitet, etc.), medan den långsammare utvecklande uppsättningen innehåller gener med kärnhushållning och andra väsentliga funktioner. De tillbehör och kärndelarna av patogengenom kan sättas ihop till ett "pangenom" som bör representera nära den kompletta uppsättningen gener som finns i en art [6]. Storleken på kärnan och accessoriska delar av pangenomer varierar inom arter av bakterier, svampar och oomyceter [7-13] och kan ge en indikation på potentialen för mikrobiella populationer att snabbt utvecklas till selektiva tryck. Det är tänkbart att ju större accessorisk pangenom är i förhållande till kärnan, desto mer kapabla är dessa populationer att snabbt utvecklas. Ascomycete-svamppatogenen från vete, Zymoseptoria tritici, är orsaken till Septoria tritici fläck (STB), en globalt viktig sjukdom som hotar livsmedelssäkerheten [14]. Patogenen har också länge betraktats som ett modellsystem för studier av populationsbiologi och evolution [15–18]. Detta beror på att Z. tritici har en hög grad av sexuell rekombination som upprätthåller stora mängder stående genetisk mångfald inom sina populationer och möjliggör snabb anpassning på både global och lokal skala [17, 19-24]. Som en konsekvens övervinns snabbt stora vetegener som ger resistens mot Z. tritici [25]. Dessutom förlorar de flesta av de allmänt använda kommersiella fungiciderna sin effektivitet med tiden [3]. Kombinationen av dessa två faktorer utgör ett hot mot den globala veteproduktionen som måste åtgärdas omedelbart. Z. tritici har också nyligen dykt upp som en ny modell för patogengenomik med många högkvalitativa genomreferenser nu tillgängliga [26] förutom pangenomer konstruerade från ett stort antal individuella isolatgenom [27, 28]. Kanske en av de mest intressanta egenskaperna hos Z. tritici-genomet är närvaron av 13 kärnkromosomer (1-13) som finns i alla isolat men sedan upp till ytterligare 8 mindre accessoriska kromosomer (14-21) som visar närvaron/frånvaron och strukturell polymorfism mellan isolat [26, 29]. Lyckligtvis bär ett av gemenskapsreferensisolaten, och det första som är fullständigt sekvenserat, det holländska fältisolatet IPO323 som samlades in på 1980-talet, 21 kromosomer, det största antalet som observerats hittills. Därför fungerar IPO323 som ett utmärkt riktmärke för att studera variation i andra isolat och som en ställning för att bygga pangenomer.
cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret
Den asexuella infektionscykeln hos Z. tritici är typisk för många relaterade växtpatogener som påverkar många livsmedelsgrödor [30]. Dessa svampar, som tillhör familjen Mycosphaerellaceae av ordningen Dothideomycetes, invaderar vanligtvis växtvävnader genom stomata [30, 31]. Därefter följer en period av lång asymptomatisk tillväxt mellan växtceller, som varar i minst 8 dagar, som slutar abrupt med bildandet av nekrotiska bladskador, en situation som för Z. tritici tycks inträffa som ett resultat av "hyperaktivering" av växten immunitet [32–34]. Växtens celldöd är därefter associerad med bildandet av nya sporuleringsstrukturer, pyknidier, i substomatala håligheter och den efterföljande extruderingen och spridningen av nybildade pyknidiosporer under perioder med stänkande regn. Andra Dothideomycetes-svampar har visat sig framkalla en hyperaktivering av växtimmunitet genom utsöndring av protein-"effektorer" som känns igen i känsliga växter, vilket resulterar i cell- och vävnadsdöd (nekros eller programmerad celldöd). Dessa nekrotrofa svampar drar nytta av detta svar och de inblandade effektorproteinerna kallas nu nekrotrofa effektorer [35, 36]. Även om det finns några preliminära bevis för att Z. tritici också kan använda nekrotrofiska effektorer vid övergången till symptomatisk tillväxt [37], som åberopar bladskador, har denna hypotes hittills inte testats ordentligt. De två ömsesidigt icke-exklusiva vägarna för att skydda framtida veteproduktion från effekterna av STB är att (1) öka naturlig resistens mot växtsjukdomar och (2) identifiera nya molekylära mål som kan utnyttjas för sjukdomsbekämpning. Helst skulle dessa möjliggöra selektiv kontroll av patogenen samtidigt som andra miljömässiga och ekologiska effekter begränsas till ett minimum. Patogengenomik och i synnerhet pangenomik erbjuder potentialen att förstärka båda strategierna. Medan proteiner som kodas av tillbehöret, snabbt utvecklande del av pangenomet kan innehålla många gener som interagerar med växtimmunitet (t.ex. effektorer), kan kärngenomet presentera mål som muterar mindre lätt på grund av att de ger negativ kondition (och virulens) straff. Av denna anledning är jordbruksfungicider normalt inriktade på kärnprocesser, som förmodligen anses vara mindre föränderliga. Men, som tidigare nämnts, kan även dessa mål utvecklas till viss del för att undvika kemisk hämning, som beskrivs för många nuvarande fungicidmålproteiner [3, 14]. De flesta fungicider som hittills använts har inriktat sig på en ganska smal uppsättning molekylära processer (t.ex. sterolbiosyntes, andning, etc.) [3]. Det finns potentiellt många andra mål som skulle kunna användas för att selektivt kontrollera svamppatogener som bör uppstå från att kombinera och analysera flera omics-datauppsättningar. Den höga potentialen för upptäckt betonas av det faktum att vanligtvis upp till 40 % av alla gener som identifieras i genomsekvenserna för patogena svampar (och svampar i allmänhet) fortfarande har okänd funktion. De som finns närvarande och kanske konserverade i kärngenomet hos patogena svampar kan vara av särskild relevans.
Pangenomics of rapidly evolving pathogens could be used to identify core, potentially specific gene sets, which could be exploited in future disease control [11]. The premise is that genes which are not evolving, in an otherwise rapidly evolving species, are most likely to be essential for either life or important for key virulence processes of the pathogen. Pangenomes themselves have, to date, largely been defined by sequencing genomic DNA from multiple members of a species. Whilst this is a critical and indispensable step in ascertaining the full potential of a species' genomics, gene expression support is perhaps overlooked for refinement of core and accessory gene calls, particularly in relation to biological processes such as pathogenicity/virulence. For example, if a core gene, predicted through genomic DNA sequence analysis, is not expressed by a successful pathogenic strain/ isolate during infection, it might be more appropriately considered accessory. Pangenome analyses on fungi and yeasts have recently emerged and have highlighted some major differences in the size of core and accessory gene components. For example, one recent study which analyzed the animal pathogenic yeasts, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, the free-living yeast, Saccharomyces cerevisiae, and the animal filamentous fungal pathogen Aspergillus fumigatus, predicted each to have >80% gener kommenterade som kärna [10]. Andra analyser på växtrelaterade flamentösa svampar har dock förutspått större accessoriska genkomponenter inklusive ~38% för patogenerna Claviceps purpurea [38] och ~44% i Pyrenophora tritici-repentis [39]. Tidigare omfattande pan-genomiska studier på Z. tritici har använt globala och historiska populationer som involverar stora isolatantal, som har sekvenserats på både fragmenterad och komplett genomskala [27, 28]. Dessa studier identifierade en stor accessorisk genuppsättning (~40% av alla gener) för denna art. Dessutom var detta korrelerat med omfattande närvaro/frånvaro och kromosomala strukturella polymorfismer, vilket också implicerade dynamiska repetitiva element (inklusive transposerbara element). Ytterligare analys antydde också att många accessoriska gener också uttrycks lägre (i genomsnitt) än kärngener. Dessa studier representerar "guldstandarden" för strukturen av Z. tritici-arternas pangenom och den mest omfattande hittills för någon filamentös svamp. Frågan kvarstår dock för denna och andra arter om i vilken utsträckning pangenomics kan användas för att identifiera kärnvirulensgener och -processer. Och inom kärngenuppsättningarna, om nivåer av populationsomfattande polymorfismer som påverkar aminosyraförändringar, såväl som genuttrycksnivåer, förråder identiteten för nyckelpatogenvirulensgener?
I denna studie har vi kombinerat genomsekvensering och RNAseq-baserade transkriptomiska metoder för att producera ett pangenom från en nyligen genomförd europeisk samling av Z. tritici-isolat. Vårt huvudsakliga mål var att testa om gener som finns i kärngenomet som kodar för proteiner med låga frekvenser av aminosyrapolymorfism (dvs i kodande sekvenser) mellan isolat har viktiga funktioner, inklusive viktiga roller i kärninfektionsprocesser på vete. I överensstämmelse med de tidigare studierna [27, 28] visar vi att Z. tritici har ett extremt stort accessoriskt genom (~45% av alla gener) som stöder dess snabbt utvecklande status. Dessutom tillhandahåller vi biologiska data som tydligt stöder användbarheten av den kombinerade användningen av båda omics-metoderna för att identifiera nya kärnvirulensgener. Omvänt misslyckades skärmar för överuttryck av funktionellt protein med hög genomströmning att identifiera några nekrotrofiska kandidater som är ansvariga för att framkalla sjukdomsskador i veteblad, från antingen kärnan eller accessorisk pangenom.
cistanche växthöjande immunförsvar
Resultat
Virulensskärmar på en europeisk Z. tritici-samling identifierar liknande aggressiva stammar från geografiskt olänkade platser
Vi testade 43 Z. tritici-isolat för virulens på 21 brett mottagliga europeiska brödvetesorter för att ge totalt 2709 datapunkter (inklusive tre replikationer). Isoleringsinformation (kod och ursprungsland) presenteras i ytterligare fil 1: Tabell S1. Varje interaktion utvärderades kvantitativt för följande parametrar: (1) längden på inkubationsperioden, (2) den tid det tog att nå fullständig nekros (när den inträffade) och (3) nivåer av asexuell sporulering (Fig. 1A). Baserat på både beräkningsmässiga och visuella sjukdomspoäng (se Metoder och ytterligare fil 2: Fig. S1), grupperades alla isolat sedan baserat på deras virulensprofiler på den testade kultivarpanelen (Fig. 1B). Det positiva kontrollisolatet IPO323, som fungerar som en global referens [26] med fullt sekvenserat genom, var mindre aggressivt än majoriteten av testade isolat mot nästan alla sorter. Detta isolat samlades in ~1984 och har förvarats sedan dess, med enstaka återpassage genom veteblad; därför är det för närvarande oklart om denna observation (åtminstone delvis) kunde ha uppstått från provlagring över tid. Vi identifierade sju isolat som inte kunde ge sjukdomssymptom på någon av vetesorterna (Fig. 1B). Eftersom dessa isolat alla härstammar från antingen Spanien eller Italien, där tetraploid (durum/pasta) vete (Triticum durum L.) odlas mer frekvent, är det troligt att dessa isolat var durumvetespecifika [40, 41]. Signifikant är att isolat med liknande virulensprofiler inte klustrade sig på sin samlingsplats, med isolat som härrörde från så långt österut som Slovakien till så långt västerut som Irland alla grupperade sig (Fig. 1B). Denna observation stämmer väl överens med höga nivåer av genetisk variation som finns mellan isolat och tidigare studier som har visat att detta är lika högt på skalan av en enda vetebladsskada som över kontinenter [42]. Många av de mer aggressiva isolaten med distinkta virulensprofiler valdes därefter ut för genomisk sekvensering (markerad med "#" i fig. IB) och RNAseq-analys (markerad med "+" i fig. IB).
Fig. 1 Virulensbedömningar av den europeiska isolatsamlingen mot en rad hexaploida (bröd) vetesorter. Ett typiskt tidsförlopp för sjukdomsprogression som illustrerar parametrarna som bedöms i skärmen, inklusive tiden det tar innan de första synliga symtomen uppträder och för att full bladnekros uppträder i det inokulerade området. Figuren visar infektionen av vetesorten Riband av Z. tritici isolat IPO323. B Virulensprofil för isolaten kontra sortpanelen baserat på nivåer av bladnekros och kloros. Mätningar gjordes genom både visuella bedömningar och genom att använda LemnaTec och LemnaGrid bildanalysprogram med jämförbara slutresultat. Isolat rangordnades och grupperades baserat på virulensdata. Z. tritici-isolat markerade med # genomsekvenserades för att konstruera ett pangenom. Isolat markerade med + analyserades också med RNAseq-transkriptomik. Vetesorten Panorama (markerad med X) fastställdes vara lika och fullt mottaglig för de flesta isolat och valdes ut som värdgenotyp för bladinfektionen RNAseq. Notera att de låga virulensdata för utgruppen av sju isolat mot alla sorter sannolikt kommer från att dessa isolat är anpassade för att orsaka sjukdomar på tetraploid vete (Durum eller Pasta). Alla data är representativa för tre infekterade löv som analyserats/interagerats med från två biologiska replikatexperiment (totalt 6 löv). C SplitsTree-analys av den molekylära fylogenin hos isolat utvalda för genomisk sekvensering. Ursprungslandet för isolaten visas i förkortningen (Pl=Polen; GB=Storbritannien; Be=Belgien; Cz=Tjeckien; Ge {{8 }} Tyskland; Sv=Sverige; Fr=Frankrike; Sl=Slovakien; Ir=Irland). Referensisolatet, IPO323 samlat ~1984 från Nederländerna (Ne) är också representerat
Genomsekvens och fylogenetisk analys på sjutton europeiska isolat avslöjar höga nivåer av genetisk mångfald
We used Illumina HiSeq 250 bp paired-end read technology to assemble the gene space of seventeen new isolates (indicated by # in Fig. 1B). BUSCO analysis (core dataset Pezizomycotina) was then performed to assess the completeness of each genome assembly (Table 1). Scores >97% i alla fall indikerade god sammansättning av genutrymmet (kodande regioner) för alla isolat. Ett fåtal utvalda BUSCO-gener saknades från alla sammansättningar, vilket tyder på att Z. tritici kanske inte har ortologer av dessa gener. För att bestämma mängden genetisk variation som påverkar förutsagda kodande regioner, körde vi sedan en SNPEf-analys för varje stam mot ett pangenom byggt på det fullständiga genomet av referensisolatet IPO323 (tabell 2). Denna analys visade att varje ny stam hade över 160,000 SNP mot det härledda pangenomet. Bland dessa fanns fler än 65,000 som antingen orsakade en potentiell förlust av proteinfunktion (hög effekt, ramförskjutning, förlorad start, för tidigt stoppkodon) eller anropade en aminosyraförändring i förutsagda proteiner (måttlig). Dessa data visade den genetiska mångfalden mellan Z. tritici-isolaten.
En splits tree-analys utfördes på de 17 nyligen sekvenserade stammarna och IPO323 för att fastställa om isolat med liknande sortinfektionsmönster hade något fylogenetiskt samband och om detta var associerat med ursprungslandet. Fylogeni bestämdes med hjälp av en sammanlänkning av sex kodande och icke-kodande sekvenser (se Metoder och ytterligare fil 3: Data S1). Trädet (fig. 1C) illustrerar än en gång att det inte fanns någon tydlig koppling mellan virulensprofiler och provtagningsplats för de sekvenserade isolaten, med nära besläktade virulensprofiler (jämfört med fig. 1B) sett för isolat insamlade från olika europeiska länder som ändå var fylogenetiskt närbesläktade.
Pangenomkonstruktion och analys förutsäger 9807 "kärna" och 8083 "accessoarer" gener
Förutom genomsekvenserna valde vi 12 isolat för RNAseq-baserad transkriptionsprofilering (indikerat med + i Fig. 1B). Varje isolat profilerades i tre exemplar under axenisk tillväxt i YPD-buljong och även vid två oberoende stadier av bladinfektion; 6 dagar efter inokulering (dpi) som representerar mitten av symptomfri fas och 9 dpi, vid övergångsfasen av tidig symtomutveckling. Den universellt mottagliga vetesorten Panorama användes för infektionsanalyser, som alla isolat kunde infektera helt med oskiljbar kinetik. Med hjälp av dessa transkriptomdata kombinerat med de nya genomsammansättningarna och den ursprungliga referenssekvensen för IPO323 som ställningen, bestämde vi ett pangenom för de europeiska isolaten som också inkorporerade sekvenser som finns i andra isolat som inte detekterades i IPO323. Stegen i pangenomkonstruktionen och våra kriterier för att kategorisera generna som "kärna" eller "tillbehör" visas i fig. 2. Viktigt, inaktiverande (hög effekt, förlust av funktion-LoF) sekvenspolymorfism och närvaro och frånvaro, överväganden backades också upp av bevis på genuttryck. Därigenom bör en gen vara närvarande i en funktionell form och uttryckas av alla isolat, för att tilldelas kategorin "kärna". Vårt övergripande tillvägagångssätt (Fig. 2) definierade ett totalt pangenom av 17 890 gener inklusive 2017 som inte var närvarande i IPO323. De efterföljande filtreringsstegen kategoriserade 9807 att ligga i kärngenomet, med endast ett något mindre antal, 8083, i tillbehörsuppsättningen. Den senare representerar ~45% av det totala pangenomet, en liten ökning jämfört med det som tidigare beskrivits [28]. Även om dessa siffror i allmänhet stämmer väl överens, är uppskattningar av accessoriska gener mer subjektiva för partiskhet på grund av de metoder som används (Panseq, etc), och vi kan inte anta att ytterligare framtida analys kanske inte minskar accessoregennumret med hjälp av till exempel ortologibaserade närmar sig. Alla pangener analyserades för flera funktioner (förutsägelser om utsöndring, membranassociation, lokalisering och cysteininnehåll) och förutspådda funktioner (BLAST-, GO- och Interpro-annoteringar). En tabell som ger all tillgänglig information om alla gener tillhandahålls (ytterligare fil 4: Tabell S2). Tabellen visar också de relativa genomsnittliga RNAseq-härledda genuttrycksnivåerna bestämda för alla gener för alla 12 isolaten under de tre testade förhållandena. Sammantaget, jämfört med tidigare pan-genomiska studier på denna organism [27, 28], är det tydligt att Z. tritici har en av de största antalet accessoriska genetiska komponenter av svampar som studerats hittills, vilket sannolikt återspeglar dess snabba utveckling. natur.
Tabell 1 BUSCO-analys av nya genom
Tabell 2 Sammanfattning av SNP-effekter för varje nytt genom jämfört med IPO323-referensgenmodellerna
Fig. 2 Sammanfattning av stegen som används för att generera "kärn" och "accessoar" genanrop och nummer för det nykonstruerade europeiska Z. tritici pangenomet. Siffrorna representerar antalet gener som identifierats i varje steg i pipelinen
Strukturella egenskaper hos variationen i det europeiska Z. tritici-pangenomet
Målet med denna studie var att testa hypotesen att pangenomik kunde utnyttjas för att identifiera viktiga nya gener, antingen nödvändiga för liv eller för virulens i patogena organismer. Vi antog att dessa gener skulle vara närvarande och funktionella i, och uttryckta av, varje stam av patogenen. Vi spekulerade vidare att dessa gener skulle ha lägre nivåer av SNP-mutationer med hög och måttlig effekt som påverkar kodande sekvenser (mindre polymorfa) och att de kan klustras i regioner på särskilda kromosomer.
Vi använde SNP-variationsdata (hög, måttlig och modifierare - se ytterligare fil 4: Tabell S2), såväl som genomsnittliga uttrycksdata för alla gener, för att undersöka genomsnittliga nivåer av kodande polymorfism och uttryck på kromosombasis, med hjälp av de 21 kromosomerna av IPO323 som ställning. Modifierande SNP representerar nukleotidförändringar som inte framkallar en aminosyraförändring. Figur 3A visar att det inte fanns någon speciell fördom för mutationsfrekvens när kumulativa höga, måttliga och modifierande SNP:er uttrycktes som en egenskap av genomsnittlig proteinlängd per hel kromosom. Men när modifieringsmutationer, dvs de som inte orsakar en aminosyraförändring, uteslöts, var det tydligt att de minsta 8 kromosomerna hade gener med högre antal höga och måttliga SNP-mutationer (Fig. 3B). Denna effekt betonades ytterligare när endast SNP:er med hög effekt analyserades (Fig. 3C). I motsats till nivåerna på kärnkromosomerna 1–13 (~20 %), var upp till 90 % av generna på de åtta minsta kromosomerna 14–21 föremål för hög effekt, troliga funktionsförlustmutationer i minst en isolat (Fig. 3C). De kumulativa transkriptionsdata från alla 12 nya isolat visade också relativt lågt genomsnittligt uttryck av gener närvarande på kromosomerna 14-21 (Fig. 3D), vilket tidigare hade observerats för IPO323 [32, 43, 44]. Sammantaget indikerar dessa data en tydlig genomisk kompartmentalisering, med de minsta åtta accessoriska kromosomerna som har sekvenser som är mycket polymorfa, accessoriska och i allmänhet dåligt uttryckta.
En jämförelse av alla gener i antingen kärngenomet eller accessoriskt genom avslöjade att ~60 % av alla gener i det senare hittades i minst en stam med hög effekt (förlust av funktion (LoF)) mutation och att 47 % också var frånvarande kl. minst en stam (Ytterligare fil 4: Tabell S2). I likhet med analysen av accessoriska kromosomer uttrycktes individuella accessoriska gener också mycket dåligt överlag över de testade isolaten (Ytterligare fil 4: Tabell S2) och hade ett mycket högre antal sekvenser med okända funktioner (ca 80%). Dessa observationer jämför väl med tidigare pangenomiska studier utförda på globala samlingar av Z. tritici samlade decennier från varandra [27, 28].
Vi utförde också en gen-för-gen närvaro och frånvarovariation (PAV) analys för alla gener som förutspåddes i referensisolatet IPO323, för de andra 17 sekvenserade isolaten. Dessa närvaro/frånvarodata plottades positionellt för varje gen över var och en av de 21 kromosomerna som finns i IPO323. Figur 3E och F visar data från representativa kärnkromosomer (1 och 7), medan figur 3G och H visar data för representativa accessoriska kromosomer (13 och 14). Data för de återstående kromosomerna visas i ytterligare fil 2: Fig. S2. Denna analys identifierade många gener närvarande i IPO323 som saknas i ett antal av de omsekvenserade isolaten och visar tydligt skillnaden i övergripande gennärvaro/frånvaro mellan "kärn"-kromosomerna i IPO323 (som finns i varje Z. tritici-stam) jämfört med de 8 minsta "accessoariska" kromosomerna. Data belyser också en region på kromosom 7 i synnerhet, mellan 1,7 Mb och 2,5 Mb, som visar en hög frekvens av genfrånvaro i de nya isolaten (Fig. 3F). Intressant nog matchar denna region exakt ett genomläge som tidigare setts ha minimalt eller inget genuttryck i IPO323 antingen under tillväxt i kultur eller under någon fas av växtinfektion [32, 43]. Denna region matchar också en kromosomal deletion, som observerades i ett jemenitiskt isolat i en tidigare pangenomstudie [28]. Tillsammans förstärker dessa data uppfattningen att Z. tritici representerar en snabbt utvecklande organism med höga nivåer och olika typer av genetisk och genomisk mångfald inom sin population.
Proteinlokaliseringsförutsägelser avslöjar gener i det accessoriska pangenomet som kan fungera i anpassning till föränderliga miljöer
WolfPsort-proteinlokaliseringsförutsägelser kördes på alla proteiner som kodas av pangenomet. Vi beräknade sedan den relativa procentandelen av proteiner som förutspåddes lokaliseras till varje subcellulär region som en egenskap av det totala antalet proteiner för kärnan eller accessorisk pangenom (Fig. 4). Flera lokaliseringskategorier berikades i kärngenomet inklusive "cytoplasma", "extracellulärt" och "plasmamembran", av vilka den senare innehåller många nyckeltransportfunktioner (Fig. 4). Tvärtom var platserna "kärna" och "mitokondrier" associerade med en högre procentandel gener i det accessoriska genomet (Fig. 4). Det accessoriska genomet anrikades för särskilda zinkbindande domäner som kan ge transkriptionsflexibilitet. Anrikningen av denna kategori rapporterades också i en tidigare pangenomstudie som lyfte fram att vår övergripande pipeline genererade jämförbara resultat [27, 28]. Den "mitokondriella" anrikningen är intressant eftersom det finns pseudogener och paraloger av bonafide mitokondriella proteiner som riktas mot svampdödande kemi. Ett tydligt exempel i det accessoriska pangenomet är en paralog av en succinatdehydrogenassubenhet C (SDHC3) som har visats förmedla stående resistens mot en underklass av SDHI (succinatdehydrogenashämmare) fungicider i Z. tritici [45]. Vi identifierade fullständiga sekvenser av denna gen i endast tre av de sjutton sekvenserade isolaten, och vi upptäckte en hög nivå av genuttryck i endast en av de 12 som sedan studerades av RNAseq (Fig. 5B). Ändå betonar den tidigare studien, och vår nuvarande analys, att det verkligen finns viktiga funktioner i det accessoriska genomet men att dessa förmodligen är viktigare för anpassning till förändrade miljöer än för kärnlivsstilen.
Fig. 3 Pangenoms strukturella egenskaper och närvaro/frånvaropolymorfismer över de 21 kromosomerna i referensisolatet IPO323. Ett totalt antal kumulativa SNP-mutationer som ger modifierande, måttlig (M) och hög (H-förlust av funktion-LoF) påverkan förändringar uttryckt som en egenskap av den genomsnittliga proteinlängden (aa) per kromosom. B Totalt antal kumulativa SNP-mutationer som ger måttliga och hög påverkan förändringar uttryckt som en egenskap av den genomsnittliga proteinlängden per kromosom. C Totalt antal kumulativa SNP-mutationer som ger förändringar med hög effekt uttryckt som en egenskap av den genomsnittliga proteinlängden per kromosom. D Genomsnittligt uttryck av alla gener som finns på var och en av de 21 kromosomerna över alla isolat. E Närvaro och frånvaro (PaV) polymorfism av generna som förutspåtts på kärnkromosom 1 i isolatet IPO323 i de 17 nyligen sekvenserade isolaten. F PaV för gener på kärnkromosom 7. G PaV för gener på accessorisk kromosom 15. G–F PaV för gener på accessorisk kromosom 15. Data belyser omfattande regional variation och markerar en tydlig skillnad mellan nivåerna av övergripande sekvenspolymorfismer och närvaro/ frånvaro tydlig på kärnan och accessoriska kromosomer
Fig. 4 Förutspådd lokalisering av proteiner som kodas av kärn- och accessoriska gener. Sammanfattning av procentuella förutspådda proteinlokaliseringar bestämt av WolfPsort för kategorier indikerade i förhållande till det totala antalet proteiner som finns i kärnan och accessorisk pangenom
Effektorproteiner i det accessoriska genomet uppvisar mer variabilitet mellan stammar i uttryck än de i kärnan
Över åtta procent av generna i kärngenomet kodade för förmodade utsöndrade proteiner, ett antal högre än det för det accessoriska genomet (~5%). Emellertid hade gener i det accessoriska genomet som kodar för utsöndrat protein oftare okänd funktion och saknade igenkännbara domäner eller katalytiska regioner. Dessa proteiner med okänd funktion uppgick till ~75% av det totala accessoriska sekretomet i förhållande till 42% för kärnsekretomet. Många av kandidat- (och i vissa fall validerade) efektorer som finns i kärngenomet uttrycktes i liknande mönster, och till jämförbara nivåer, i alla tolv isolat analyserade av RNASeq. Till exempel uttrycktes de tre LysM (Lysin) domäninnehållande efektorerna, 3LysM, 1LysM och xLysM, till mycket liknande nivåer, och i identiska mönster, av varje stam (Fig. 5C-E). Te 3LysM-effektorn förblir den enda större utsöndrade virulensdeterminanten av Z. tritici, där detta protein tjänar till att undertrycka kitinutlöst växtimmunitet under tidig infektion [46, 47]. Alla tre LysM-effekter är dock kända för att arbeta tillsammans för detta ändamål [48]. Det är därför anmärkningsvärt att det fanns mycket liten expressionsvariation för dessa gener mellan isolat, vilket förstärker förslagen att detta försvarsundertryckande är en kärnkomponent i infektion. Däremot visade kandidateffektorer som finns i det accessoriska genomet både närvaro och frånvarovariation och mycket varierande uttryck mellan isolat (Fig. 5F-H). Till exempel, AvrStb6, den första avirulenseffektorn som identifierats i Z. tritici, [49, 50] visar avsevärd expressionsvariation (Fig. 5F), trots att den är närvarande i alla isolat. Denna sekvensvariabel, ett litet, utsöndrat protein, känns igen av vetesorter som innehåller funktionella alleler av det receptorliknande kinaset Stb6 [25, 51]. Denna erkännande ger sjukdomsresistens mot alla isolat som har en speciell allel av denna effekt. Det fanns en signifikant expressionsvariation av AvrStb6 mellan isolat och vi identifierade ett isolat (Zt118) där vi inte kunde detektera något uttryck alls, i något av de tre testade förhållandena. Av denna anledning, i vår förutsägelsepipeline, klassificerades AvrStb6 i det accessoriska genomet. Många andra kandidateffektorer med för närvarande okända funktioner uppvisade signifikant närvaro/frånvaro och/eller uttrycksvariation i det accessoriska genomet (Fig. 5G och H).
Fig. 5 Expressionsvariation av gener i kärnan och accessorisk pangenom och etablering av ett transient viralt överexpressionssystem som används för nekrotrofiska effektorscreeningar. En nyckel till tolkning av data visas i figurerna. B Närvaro/frånvaro och genuttrycksvariation för succinatdehydrogenassubenhet C-paralogen som finns i det accessoriska genomet. C–E Expressionsprofiler för ZtLysM-effekter, 3LysM, 1LysM och xLysM, alla närvarande i kärnpangenomet. F Uttrycksprofil för avirulenseffekten AvrStb6. Avsaknaden av något uttryck i isolat 118 klassificerar efektorn i det accessoriska pangenomet. G och H representerar exempel på ytterligare kandidateffekter i det accessoriska pangenomet.
Funktionella skärmar ger inga bevis för nekrotrofisk effektoraktivitet i vare sig kärnan eller accessorisk pangenom
Vi antog ett nyligen utvecklat virusvektormedierat proteintransientexpressionssystem för vete (och andra spannmåls- och icke-spannmålsgrödor), med användning av Foxtail Mosaic-virus (FoMV), för att utföra en screening med medelhög till hög genomströmning av kandidat Z. tritici-effekter från pangenomet. Vi syftade specifikt till att testa om någon hade förmågan att inducera nekros på en liten panel av vetesorter, vilket kan antyda deras funktion vid övergången till sjukdomssymptom som "nekrotrofiska effektorer" [36, 52]. För denna studie gjorde vi några ändringar av det tidigare publicerade systemet [53]. För att driva extracellulär proteinsekretion i vete använde vi den vetepatogenesrelaterade protein 1 (TaPR1) signalpeptidsekvensen, kodonoptimerad till Arabidopsis thaliana, som sedan fusionerades i ram med varje kandidatsvampeffektorsekvens genom gensyntes (Fig. 5I). Effektiviteten av TaPR1-signalpeptiden för att utsöndra funktionella Z. tritici extracellulära proteiner fastställdes genom dess förmåga att inducera bladnekros i tobak när den placeras framför Z. tritici-nekros och eteninducerande-liknande protein (ZtNLP), som endast är funktionellt. när målinriktad för extracellulär sekretion (Fig. 5 Jl) [54]. Vi bekräftade sedan att vektorn kunde överuttrycka proteiner lika bra över en rad vetesorter genom att visualisera lokalt och systemiskt uttryck av det gröna fluorescerande proteinet (GFP) genom bladen på olika vetesorter (Ytterligare fil 2: Fig. S3). Slutligen testade vi sedan förmågan hos den välkarakteriserade nekrotrofiska effektorn SnToxA, från den relaterade vetepatogenen Parastagonospora nodorum, att inducera nekros i veteblad av genotyper som har Tsn1-känslighetsgenen [55]. Som förväntat inducerade FoMV-medierat överuttryck av SnToxA, med TaPR1-signalpeptiden, nekros endast på vetesorten som innehar Tsn1 (cv Halberd i fig. 5K) utan några symtom observerade på sorter som saknar denna mottaglighetsgen (cv 5K Riband i fig. 5K). ). Dessa data bekräftade att det virala vektormedierade överuttryckssystemet var lämpligt för en större screening av kandidat Z. tritici-effektorer för att identifiera alla med nekrotrofisk effektoraktivitet. Totalt 88 kandidater valdes ut och screenades mot fem vetesorter (ytterligare fil 5: Tabell S3). Dessa omfattade 66 proteiner som finns i kärnpangenomet och 22 från tillbehöret. De utvalda generna (ytterligare fil 5: Tabell S3) sträckte sig från kärngener utan stamspecifika polymorfismer (monomorfa) och hög i planta-uttryck, till de i det accessoriska genomet som uppvisar närvaro/frånvaro och/eller betydande uttryckspolymorfism. I alla experiment kördes parallella ToxA vs cv Halberd och cv Riband tekniska kontroller, och dessa gav alltid de förväntade resultaten. Däremot inducerade inget av de 88 testade Z. tritici-överuttryckta proteinerna någon bladnekros på någon vetesort. Sammanfattningsvis gav dessa resultat inga bevis för nekrotrofiska effekter och därför inget stöd för någon av de testade kandidaterna för att inducera övergången till nekrotrofisk tillväxt under infektion.
cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret
Kärngener som kodar för proteiner med påvisade eller förutspådda livsviktiga eller viktiga virulensfunktioner har lägre totala nivåer av aminosyrapolymorfism
Vi utförde en litteratursökning för att identifiera alla Z. tritici-gener som hade varit föremål för funktionell karakterisering, antingen i virulens eller som essentiella gener som daterades fram till 2018. Detta genererade en lista med 28 proteinsekvenser (Ytterligare fil 6: Tabell S4). På samma sätt identifierade vi en lista med 26 proteiner som också hade karaktäriserats funktionellt men som inte hade visat sig spela någon större roll i virulens eller vara väsentliga (ytterligare fil 6: Tabell S4). Vi undersökte sedan nivåerna av kumulativa överflödiga höga och måttliga mutationer i dessa gener och uttryckte deras värden som en egenskap för varje proteinlängd och bestämde sedan medelvärdena för uppsättningen. Figur 6 visar att de publicerade generna som påverkar virulensen hade en statistiskt signifikant lägre frekvens (p=0.007) av mutationer (polymorfism) än de som har visat sig vara funktionellt redundanta.
Studier som syftar till att definiera livsnödvändiga gener i trådsvampar (exklusive jästsvampar) är få, och hittills finns endast en representant i databasen för essentiella gener (DEG), som kommer från den opportunistiska mänskliga patogenen Aspergillus fumigatus [56–58]. Vi identifierade Z. tritici-ortologen för alla 28 gener som experimentellt visat sig vara väsentliga för livet i A. fumigatus och beräknade återigen de relativa mutationshastigheterna för varje i förhållande till sekvenslängder (Ytterligare fil 7 Tabell S5). Återigen fann vi en tydlig statistiskt signifikant minskning (p=0.0148) i frekvensen av höga och måttliga SNP-mutationer i dessa essentiella kandidatgener, som sedan observerades för gener som inte visade sig vara nödvändiga för vare sig virulens eller liv ( Fig. 6). Däremot fanns det ingen signifikant skillnad (p=0.2128) mellan mutationshastigheter för experimentellt validerade virulensgener och de förutsagda essentiella generna (Fig. 6). Dessa data tillsammans stöder konceptet att nivåer av aminosyrapolymorfismer i populationer skulle kunna användas för att förutsäga generernas relativa betydelse för organismens kärnlivsstil.
Fig. 6 Analys av kärngenuppsättningar av experimentellt validerad patogenicitet och/eller förutspådda gener som är livsnödvändiga avslöjar lägre mutationshastigheter än vad som ses i icke-essentiella gener. De genomsnittliga höga och måttliga (H/M) mutationshastigheterna uttryckt som ett kännetecken för proteinlängder (aa) för genlistor som kodar för proteiner som har varit; 1- experimentellt bestämt sig för att inte spela några (eller mycket små) roller i svampvirulens; 2-experimentellt bestämt sig för att spela en viktig roll i virulens och; 3-som förutspås koda för förmodade livsviktiga gener genom ortologi till proteiner som experimentellt karakteriseras i Aspergillus fumigatus. Asterisk (*)-symbolen indikerar en statistiskt signifikant skillnad mellan mutationshastigheter mellan de angivna genuppsättningarna. Genlistor och tillhörande polymorfismdata visas i ytterligare fil 6: Tabell S4
Användbarheten av det kombinerade prediktiva tillvägagångssättet för att avslöja patogensvaghet stöds genom genetiska komplementstudier på en gendeletionsmutant med fem "kärnor"
Z. tritici är mottaglig för vidarebefordran av genetiska screeningar baserade på slumpmässig integrering av T-DNA via Agrobacterium-medierad svamptransformation (AMT). Vårt tidigare arbete hade genererat en Z. tritici T-DNA-mutant i synnerhet som inte kunde orsaka fullständig sjukdom på infekterade veteblad (Fig. 7A). Denna mutant, kallad 23-21 (den 23:e omgången av transformation och den 21:a kolonin plockade), kunde växa normalt som vildtyp på näringsrikt agarmedium (YPD) men lyckades inte utöka jämförbara nivåer av svamphyfer när den odlades på en näringsberövat medium, inklusive vattenagar (fig. 7A). Vi använde Illumina-baserad omsekvensering av hela genomet av 23-21 för att avslöja positionen för den potentiellt orsakande T-DNA-insättningen. Denna analys avslöjade en enda T-DNA-integration mellan positionerna 899878 och 912699 på kromosom 8, vilket orsakade en deletion/avbrott av fem förutsagda kodande sekvenser (Fig. 7B). SNP- och indelanalys avslöjade inga ytterligare omärkta mutationer i 23-21-stammen i förhållande till vildtypsgenomsekvensen för IPO323. 23-21 T-DNA-deletionen tog effektivt bort fem gener, som alla finns i kärngenomet, och med följande funktionella (Interpro) förutsägelser; gen 1=Cytokrom P450; gen 2=S-adenosylmetioninmetyltransferas; gen 3=Zink (2) DNA-bindande protein av C6-typ; gen 4=nukleosid-difosfatkinas (NDK) och gen 5=glykosylhydrolas 31 (fig. 7B). Vi undersökte det relativa antalet höga och måttliga mutationer i varje protein som en egenskap av proteinlängd, vilket avslöjade att protein 4 (NDK) hade mycket färre mutationer som påverkade aminosyrasekvensförändringar än de andra fyra analyserade sekvenserna över den isolerade uppsättningen (Fig. 7C och ytterligare fil 2: Fig. S4). Vi undersökte sedan det genomsnittliga relativa uttrycket av alla fem generna över alla de testade isolaten. Det avslöjade också att gen 4 (som kodar för NDK) var signifikant högre uttryckt än alla andra kandidater (Fig. 7D och Ytterligare fil 2: Fig. S5). Vi antog således att förlusten av den minst polymorfa och högst uttryckta genen, gen 4, NDK, var ansvarig för förlusten av virulens och associerad defekt i att förlänga hyfala flament. För att testa detta transformerade vi var och en av de fem kandidatgenerna individuellt tillbaka till 23-21 Z. tritici-mutantstammen, var och en driven av sin egen endogena promotor. Flera transformanter erhölls från var och en och testades om med avseende på virulens på veteblad och förmågan att förlänga filamentösa hyfer på vattenagar. Detta visade att återinförandet av enbart NDK-genen (gen 4) helt återställde både virulens och hyphal tillväxt till vildtypsnivåer (Fig. 7E och Ytterligare fil 2: Fig. S6). Återinförande av var och en av de andra fyra kandidaterna orsakade ingen förändring i fenotyp från den ursprungliga mutantstammen 23-21 (Fig. 7E). För att säkerställa att alla återintroducerade gener uttrycktes i deras respektive komplementerade stam, gjordes RT-PCR på var och en av transformanterna och den ursprungliga 23-21-mutanten. Detta bekräftade den förväntade avsaknaden av varje transkript i 23-21-mutanten och visade korrekt uttryck av varje målgen i de kompletterade isolaten (Fig. 7F). Tus, återinförande av den enda genen med de minsta populationsnivåpolymorfismerna av de fem kandidaterna, och högsta relativa uttryck, återställde de defekta fenotyperna i denna vetepatogen. Denna experimentella observation stöder användbarheten av att kombinera pangenomics och transcriptomics för att förutsäga gener som är potentiellt viktiga för viktiga funktionella livsegenskaper.
Fig. 7 Funktionella komplementanalyser på en icke-patogen Z. tritici-mutant med deletion av fem gener stöder den kombinerade användningen av pangenom-härledd mutationshastighet och expressionsnivåanalys som prediktorer för viktiga livsstilsgener. A Tillväxt- och infektionsegenskaper hos en Z. tritici slumpmässig T-DNA-insättningsmutant "23-21". Stammen växer normalt på rik näringsagar men är defekt i filamentös tillväxt på dålig näringsagar och allvarligt äventyrad i veteblads sjukdomsframkallande aktivitet. Skalstaplar representerar 1 cm. B Helgenomsekvensering av stam 23-21 avslöjar en T-DNA-medierad deletion av en 13 kb genomisk region som stör eller tar bort fem förutsagda gener från kärnpangenomet. C Visar genomsnittliga händelser av hög och måttlig mutation för varje gen (märkt 1-5) från pangenomet i förhållande till kodad proteinlängd (aa)
Diskussion
Kombinerad pangenomik och transkriptomik kan användas som vapen mot snabbt utvecklande patogener
Pangenomics analyses have been performed on other fungi and yeasts including Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans var. grubii, and Aspergillus fumigatus [10]. All four species are model organisms in eukaryotic genomics and the latter three can also cause human diseases. Recent pangenome analyses on each of these species revealed that > 80% of all genes detected were core and thus found in every strain [10]. Our current study, and those previously [27, 28], clearly highlight that Z. tritici has a larger (>40% av de totala generna) accessoriska genom än dessa arter. Varför och hur Z. tritici och potentiellt andra växtpatogena svampar upprätthåller en så stor tillbehörskomponent är oklart. Till exempel har de minsta åtta kromosomerna som identifierats i IPO323 inte någon tydlig större inverkan på virulens, eller några andra processer, med endast en studie som för närvarande tyder på att kromosomerna 14, 16, 18, 19 och 21 spelar en subtil roll i virulens på utvalda vetesorter [59]. Ändå bibehålls kombinationer av dessa små kromosomer i populationer. Det har föreslagits att de tillhandahåller rekombinationshändelser som kan ligga bakom svampens förmåga att utvecklas snabbt för att anpassa sig till miljöpåfrestningar, potentiellt i kombination med hög aktivitetsgrad av transponerbara element [60-62]. Ett liknande fall kan argumenteras för det stora accessoriska genomet. Stöd för detta ges av den funktionella betydelsen av två accessoriska genomkomponenter som hänvisas till i denna studie, SDH-subenheten C paralogue och AvrStb6, som båda har nyckelroller i att interagera med variabla delar av den yttre miljön (fungicidapplicering och sorter med matchande sjukdomsresistensgener) [25, 45]. Andra biologiska processer har beskrivits som också kan gå förlorade i enskilda Z. tritici-isolat utan tydliga konditionsdefekter inklusive kontroll av melanisering (pigmentering) [63]. Vår studie har visat att Z. triticis tillbehör, snabbt utvecklande genom potentiellt kan användas mot det när fokus istället läggs på det som inte går att förlora eller har begränsad polymorfism. Denna studie har försökt göra detta genom att betrakta kärngener som inte bara närvarande och funktionella i alla isolat utan också uttryckta av alla isolat. Vi tog också tillvägagångssättet att försöka rangordna genuppsättningar i kärngenomet, baserat på nivåer av aminosyrasekvensvariabilitet. Det finns naturligtvis några varningar med de metoder vi har använt, särskilt i det att redundanta (identisk typ och position) mutationer inte enkelt kan separeras från ett liknande antal mutationer som kan förekomma vid unika positioner i varje isolat (icke-redundanta mutationer). Således är vår metod inte lämpad för att rangordna snabbt utvecklande gener. Icke desto mindre möjliggör metoden att gener med ingen och låg variabilitet lätt kan identifieras baserat på låga frekvenser av polymorfismer som påverkar aminosyraförändringar. Tillvägagångssättet visade att experimentellt verifierade och förutspådda livsviktiga gener eller virulensgener innehöll betydligt mindre polymorfism av denna typ mellan isolat än de vars funktioner är nödvändiga för dessa processer. Slutligen utökade vi detta tillvägagångssätt för att identifiera en ny virulensfunktion för ett nukleosid-difosfatkinas (NDK), som uppvisade den minsta variationen av alla gener i en 5--gen T-DNA-deletion. Baserat på dessa fynd föreslår vi att nivåer av polymorfism i kärngener identifierade i pangenomics kan användas för att sluta sig till viktiga funktioner för de kodade proteinerna och därigenom prioritera gener för funktionell analys för att identifiera nya mål för växtskydd och potentiellt djurhälsa.
En framväxande svaghet i infektionsbiologin hos Z. tritici och relaterade patogener?
Denna studie gav också ytterligare specifika insikter i infektionsbiologin för denna viktiga vetepatogen. För det första erhölls inga bevis som stöder närvaron av stora nekrotrofiska effektoraktiviteter för 88 utsöndrade proteiner valda från både kärn- och accessoargenomet. Vi kan inte förkasta möjligheten att vi inte valde de korrekta proteinerna eller att flera effektorer kunde arbeta tillsammans för att åkalla växtcelldöd (även föreslagit av liknande uttrycksprofiler). Om det senare är fallet, skulle detta skilja sig från den tydliga betydelsen av enskilda nekrotrofiska effektorer i relaterade vete-infekterande svampar, särskilt Parastagonospora nodorum och Pyrenophora-arter [35]. Det är också möjligt att uttrycksnivåerna vi härleder från det transienta FoMV-systemet är lägre än de som krävs för effektorer vars igenkänning är mindre uttalad än den för SnToxA. Icke desto mindre ger de data som presenteras här inget stöd för idén att övergången till symptomatisk tillväxt och växtcelldöd åberopas av igenkännandet av större (enkla) nekrotrofa Z. tritici-effekter. Det är därför möjligt att massproduktionen av dessa proteiner i början av symtomen istället kan tjäna till att skydda svamphyfer från den uppenbara hyperaktiveringen av celldöd och växtsvar. I överensstämmelse med detta har utsöndrade effektorer från denna och andra svampar visat sig ha förmågan att hämma växthärledda proteaser, kitinaser och andra cellväggarattackerande enzymer som själva induceras av växter under försvarssvar [46, 48, 64, 65 ]. På senare tid har svampeffektorer också visat sig manipulera och omforma mikro- och mikrobiomer [66, 67].
cistanche fördelar för män stärker immunförsvaret
Identifieringen av en nyckelroll i virulens för NDK är dock betydande. Dessa proteiner har tillskrivits flera funktioner från olika prokaryota och eukaryota organismer. Hos svampar finns det en rapport som tillskriver modulering av växtimmunitet en roll [68], medan en annan art (A. fumigatus) har visats en livsviktig funktion [69]. Den primära och konserverade funktionen hos dessa proteiner är dock att fosforylera nukleosid-difosfater, vanligtvis med ATP som substrat, för att generera andra nukleosidtrifosfater (NTP) som krävs för att hjälpa till att driva på olika cellulära processer [70, 71]. Detta är särskilt viktigt när begränsade resurser försvårar genereringen av vissa NTP på andra sätt. Däremot presenterar NDK:er en viktig räddningsvägsaktivitet för regenerering av NTP:er som troligen är viktig när extracellulära resurser är begränsade. Viktiga roller för flera andra räddningsvägar, och i synnerhet biosyntetiska vägar, har nyligen framkommit från andra genfunktionsstudier på Z. tritici. Till exempel är lysinbiosyntes väsentlig för infektion och hyftillväxt på dåliga näringsämnen [72], liksom purinbiosyntes [73]. Dessa funktioner är överflödiga för tillväxt på kompletta media. Tidigare transkriptomdata om det mycket tidiga stadiet av bladytkolonisering har indikerat att svampen är i en näringsfattig miljö och är beroende av att använda intracellulära förråd [33]. Tillsammans med de tidigare funktionella studierna, och nyckelrollen som visades för NDK, är det tydligt att Z. tritici är extremt känslig för hämning av viktiga biosyntetiska och räddningsvägar när de är på bladytan under tidig kolonisering, och potentiellt fram till induktion av växtcellsdöd cirka 7–10 dagar senare. Sålunda kan nya växtskyddsprodukter eller strategier riktas mot hämning av dessa processer, vilket kan representera en svaghet hos Z. tritici, och potentiellt för en mängd andra relaterade svampar med liknande infektionssätt.
Slutsatser
Denna studie ger initialt stöd för den kombinerade användningen av pangenomics och transcriptomics för att definiera gener som representerar kärnan, och potentiellt exploaterbara, svagheter i snabbt utvecklande patogener. Men i princip skulle tillvägagångssätten kunna användas för genprioritering i alla biologiska system där flera genom och transkriptom är tillgängliga. Vi förväntar oss att dessa tillvägagångssätt kan främja upptäcktspipelines av biologiska kärnprocesser i många olika biologiska system.
Referenser
1. Fisher MC, Hawkins NJ, Sanglard D, Gurr SJ. Den världsomspännande uppkomsten av resistens mot svampdödande läkemedel utmanar människors hälsa och livsmedelssäkerhet. Vetenskap. 2018;360. https://doi.org/10.1126/science.aap7999.
2. Fisher MC, Henk DA, Briggs CJ, Brownstein JS, Madoff LC, McCraw SL, et al. Nya svamphot mot djur, växter och ekosystems hälsa. Natur. 2012;484. https://doi.org/10.1038/nature10947.
3. Lucas JA, Hawkins NJ, Fraaije BA. Utvecklingen av fungiciderresistens. Adv Appl Microbiol. 2015;90. https://doi.org/10.1016/bs.aambs.2014.09.001.
4. Heitman J. Sexuell reproduktion och utvecklingen av mikrobiella patogener. Curr Biol. 2006;16. https://doi.org/10.1016/j.cub.2006.07.064.
5. Dong S, Raffaele S, Kamoun S. Tvåhastighetsgenomen hos filamentösa patogener: vals med växter. Curr Opin Genet Dev. 2015;35:57–65. https://doi.org/10.1016/J.GDE.2015.09.001.
6. Tettelin H, Masignani V, Cieslewicz MJ, Donati C, Medini D, Ward NL, et al. Genomanalys av flera patogena isolat av Streptococcus agalactiae: implikationer för det mikrobiella "pan-genomet". Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102. https://doi.org/10.1073/pnas.0506758102.
7. Lefébure T, Stanhope MJ. Evolution av kärnan och pan-genomet av strep-till coccus: positivt urval, rekombination och genomsammansättning. Genome Biol. 2007;8. https://doi.org/10.1186/gb-2007-8-5-r71.
8. Tian CF, Zhou YJ, Zhang YM, Li QQ, Zhang YZ, Li DF, et al. Jämförande genomik av rhizobia-nodulerande sojabönor tyder på omfattande rekrytering av härstamningsspecifika gener i anpassningar. Proc Natl Acad Sci US A. 2012;109. https://doi.org/10.1073/pnas.1120436109.
9. Syme RA, Tan KC, Rybak K, Friesen TL, McDonald BA, Oliver RP, et al. Panparastagonospora jämförande genomanalys-effektorprediktion och genomevolution. Genome Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/ gbe/evy192.
10. McCarthy CGP, Fitzpatrick DA. Pan-genomanalyser av modellsvamparter. Microb. Genomik. 2019;5. https://doi.org/10.1099/mgen.0.000243.
11. Yang X, Li Y, Zang J, Li Y, Bie P, Lu Y, et al. Analys av pan-genom för att identifiera kärngener och väsentliga gener av Brucella spp. Mol Gen Genomics. 2016;291. https://doi.org/10.1007/s00438-015-1154-z.
12. Barber AE, Sae-Ong T, Kang K, Seelbinder B, Li J, Walther G, et al. Aspergillus-lus fumigatus pan-genomanalys identifierar genetiska varianter associerade med mänsklig infektion. Nat Microbiol. 2021;6. https://doi.org/10.1038/ s41564-021-00993-x.
13. Zhang X, Liu B, Zou F, Shen D, Yin Z, Wang R, et al. Resekvensering av hela genomet avslöjar naturlig variation och adaptiv utveckling av Phytophthora sojae. Främre Microbiol. 2019;10. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019. 02792.
14. Torriani SFF, Melichar JPE, Mills C, Pain N, Sierotzki H, Courbot M. Zymoseptoria tritici: ett stort hot mot veteproduktion, integrerade metoder för kontroll. Svamp Genet Biol. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.010.
15. Zhan J, Mundt CC, McDonald BA. Mätning av immigration och sexuell reproduktion i fältpopulationer av Mycosphaerella graminicola. Fyto-patologi. 1998;88. https://doi.org/10.1094/PHYTO.1998.88.12.1330.
16. Zhan J, Kema GHJ, Waalwijk C, McDonald BA. Fördelning av alleler av parningstyp i vetepatogenen Mycosphaerella graminicola över rumsliga skalor från lesioner till kontinenter. Svamp Genet Biol. 2002;36. https://doi. org/10.1016/S1087-1845(02)00013-0.
17. Stukenbrock EH, Banke S, Javan-Nikkhah M, McDonald BA. Ursprung och domesticering av svampvetepatogenen Mycosphaerella gramini-cola via sympatrisk artbildning. Mol Biol Evol. 2007;24. https://doi.org/10. 1016/S1087-1845(02)00013-0.
18. Linde CC, Zhan J, McDonald BA. Befolkningsstruktur för Mycosphaere‑lla graminicola: från lesioner till kontinenter. Fytopatologi. 2002;92. https://doi.org/10.1094/PHYTO.2002.92.9.946.
19. Croll D, McDonald BA. Den genetiska grunden för lokal anpassning för patogena svampar i jordbrukets ekosystem. Mol Ecol. 2017;26. https://doi.org/ 10.1111/mec.13870.
20. Croll D, Lendenmann MH, Stewart E, McDonald BA. Effekten av rekombinationshotspots på genomutvecklingen av en svampväxtpatogen. Genetik. 2015;201. https://doi.org/10.1534/genetics.115.180968.
21. Dutta A, Croll D, McDonald BA, Barrett LG. Upprätthållande av variation i virulens och reproduktion i populationer av en jordbruksväxtpatogen. Evol Appl. 2021;14. https://doi.org/10.1111/eva.13117.
22. Feurtey A, Stevens DM, Stephan W, Stukenbrock EH, Stajich J. Interspecifikt genutbyte introducerar hög genetisk variabilitet i grödans patogen. Genome Biol Evol. 2019;11. https://doi.org/10.1093/gbe/evz224.
23. Hartmann FE, Sánchez-Vallet A, McDonald BA, Croll D. En svampvetepatogen utvecklade värdspecialisering genom omfattande kromosomomarrangemang. ISME J. 2017;11. https://doi.org/10.1038/ismej.2016.196.
24. Fouché S, Plissonneau C, McDonald BA, Croll D. Meiosis leder till genomgripande kopietalsvariation och förvrängt nedärvning av accessoriska kromo- vissa av vetepatogenen Zymoseptoria tritici. Genome Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/gbe/evy100.
25. Stephens C, Ölmez F, Blyth H, McDonald M, Bansal A, Burcu Turgay E, et al. Anmärkningsvärda senaste förändringar i genetisk mångfald av avirulensgenen AvrStb6 i globala populationer av vetepatogenen Zymoseptoria tritici. Mol Plant Pathol. 2021. https://doi.org/10.1111/mpp.13101.
26. Goodwin SB, M'Barek S, Dhillon B, Wittenberg AHJ, Crane CF, Hane JK, et al. Det färdiga genomet av svampvetepatogenen Mycosphaerella graminicola avslöjar dispenseringsstruktur, kromosomplasticitet och smygpatogenes. PLoS Genet. 2011;7. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002070.
27. Badet T, Oggenfuss U, Abraham L, McDonald BA, Croll D. En 19-isolat referenskvalitet globalt pangenom för svampvetepatogenen Zymoseptoria tritici. BMC Biol. 2020;18. https://doi.org/10.1186/ s12915-020-0744-3.
28. Plissonneau C, Hartmann FE, Croll D. Pangenomanalyser av vetepatogenen Zymoseptoria tritici avslöjar den strukturella grunden för ett mycket plastiskt eukaryotiskt genom. BMC Biol. 2018;16. https://doi.org/10.1186/ s12915-017-0457-4.
29. Wittenberg AHJ, van der Lee TAJ, M'Barek SB, Ware SB, Goodwin SB, Kilian A, et al. Meios driver extraordinär genomets plasticitet i den haploida svampväxtpatogenen Mycosphaerella graminicola. PLoS One. 2009;4. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005863.
30. Steinberg G. Cellbiologi av Zymoseptoria tritici: patogen cellorganisation och veteinfektion. Svamp Genet Biol. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.002.
31. Kema GHJ, Yu DZ, Rijkenberg FHJ, Shaw MW, Baayen RP. Histologi av patogenesen av Mycosphaerella graminicola i vete. Fytopatologi. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-777.
32. Rudd JJ, Kanyuka K, Hassani-Pak K, Derbyshire M, Andongabo A, Devon-Shire J, et al. Transkriptom- och metabolitprofilering av infektionscykeln av Zymoseptoria tritici på vete avslöjar en bifasisk interaktion med växtimmunitet som involverar differentiella patogena kromosomala bidrag och en variation av den hemibiotrofa livsstilsdefinitionen. Plant Physiol. 2015;167. https://doi.org/10.1104/pp.114.255927.
33. Keon J, Antoniw J, Carzaniga R, Deller S, Ward JL, Baker JM, et al. Transkriptionell anpassning av Mycosphaerella graminicola till programmerad celldöd (PCD) hos dess mottagliga vetevärd. Mol Plant-Microbe Interact. 2007;20. https://doi.org/10.1094/MPMI-20-2-0178.
34. Rudd JJ, Keon J, Hammond-Kosack KE. De vetemitogenaktiverade proteinkinaserna TaMPK3 och TaMPK6 är differentiellt reglerade på flera nivåer under kompatibla sjukdomsinteraktioner med Mycosphaerella graminicola. Plant Physiol. 2008;147. https://doi.org/10.1104/pp.108. 119511.
35. Friesen TL, Faris JD. Karakterisering av effektor-målinteraktioner i nekrotrofiska patosystem avslöjar trender och variationer i värdmanipulation. Annu Rev Phytopathol. 2021;59. https://doi.org/10.1146/annur ev-phyto-120320-012807.
36. Friesen TL, Faris JD, Solomon PS, Oliver RP. Värdspecifika toxiner: effektorer av nekrotrofisk patogenicitet. Cell Microbiol. 2008;10. https://doi.org/10. 1111/j.1462-5822.2008.01153.x.
37. Ben M'Barek S, Cordewener JHG, Tabib Ghafary SM, van der Lee TAJ, Liu Z, Mirzadi Gohari A, et al. FPLC och vätskekromatografi masspektrometri identifierar kandidat nekrosinducerande proteiner från kulturfiltrat av svampvetepatogenen Zymoseptoria tritici. Svamp Genet Biol. 2015;79. https://doi.org/10.1016/j.fgb.2015.03.015.
38. Wyka S, Mondo S, Liu M, Nalam V, Broders K. Ett stort accessoriskt genom och höga rekombinationshastigheter kan påverka den globala distributionen och det breda värdområdet för svampväxtpatogenen Claviceps purpurea. PLoS One. 2022;17. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.
39. Moolhuijzen PM, Se PT, Shi G, Powell HR, Cockram J, Jørgensen LN, et al. Ett globalt pangenom för vetesvamppatogenen Pyrenophora triticirepentis och förutsägelse av strukturell homologi av efectorprotein. Microb. Genomik. 2022;8. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.
40. Kema GHJ, Sayoud R, Annone JG, Van Silfhout CH. Genetisk variation för virulens och resistens i vete-Mycosphaerella graminicola path-system II. Analys av interaktioner mellan patogenisolat och värdkultivarer. Fytopatologi. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-213.
41. Kema GHJ, Annone JG, Sayoud R, Van Silfhout CH, Van Ginkel M, De Bree J. Genetisk variation för virulens och resistens i vetet Mycosphaerella graminicola patosystem I. interaktioner mellan patogenisolat och värdkultivarer. Fytopatologi. 1996;86. https://doi.org/ 10.1094/Phyto-86-200.
42. Zhan J, Pettway RE, McDonald BA. Den globala genetiska strukturen hos vetepatogenen Mycosphaerella graminicola kännetecknas av hög nukleär mångfald, låg mitokondriell mångfald, regelbunden rekombination och genflöde. Svamp Genet Biol. 2003;38. https://doi.org/10.1016/S1087- 1845(02)00538-8.
43. Palma-Guerrero J, Torriani SFF, Zala M, Carter D, Courbot M, Rudd JJ, et al. Jämförande transkriptomiska analyser av Zymoseptoria tritici-stammar visar komplexa livsstilsövergångar och intraspecifik variation i transkriptionsprofiler. Mol. Plant Pathol. 2016;17. https://doi.org/10.1111/mpp.12333.
44. Kellner R, Bhattacharyya A, Poppe S, Hsu TY, Brem RB, Stukenbrock EH. Uttrycksprofilering av vetepatogenen Zymoseptoria tritici avslöjar genomiska transkriptionsmönster och värdspecifika regulatoriska program. Genome Biol Evol. 2014;6. https://doi.org/10.1093/gbe/evu101.
45. Steinhauer D, Salat M, Frey R, Mosbach A, Luksch T, Balmer D, et al. En dispenserbar paralog av succinatdehydrogenassubenhet C förmedlar stående resistens mot en underklass av SDHI-fungicider i Zymosep‑toria tritici. PLoS Pathog. 2019;15. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 1007780.
46. Marshall R, Kombrink A, Motteram J, Loza-Reyes E, Lucas J, Hammond Kosack KE, et al. Analys av två planta-uttryckta LysM efector-homologer från svampen Mycosphaerella graminicola avslöjar nya funktionella egenskaper och varierande bidrag till virulens i vete. Plant Physiol. 2011;156. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.
47. Lee WS, Rudd JJ, Hammond-Kosack KE, Kanyuka K. Mycosphaerella graminicola list efector-medierad stealth patogenes undergräver igenkänning genom både cerk1 och cebip homologer i vete. Mol Plant-Microbe Interact. 2014;27. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.
48. Tian H, MacKenzie CI, Rodriguez-Moreno L, van den Berg GCM, Chen H, Rudd JJ, et al. Tre LysM-effekter av Zymoseptoria tritici avväpnar kollektivt kitinutlöst växtimmunitet. Mol Plant Pathol. 2021;22. https:// doi.org/10.1104/pp.111.176347.
49. Zhong Z, Marcel TC, Hartmann FE, Ma X, Plissonneau C, Zala M, et al. Ett litet utsöndrat protein i Zymoseptoria tritici är ansvarigt för avirulens på vetesorter som bär Stb6-resistensgenen. Ny Phytol. 2017;214. https://doi.org/10.1111/nph.14434.
50. Kema GHJ, Mirzadi Gohari A, Aouini L, Gibriel HAY, Ware SB, Van Den Bosch F, et al. Stress och sexuell reproduktion påverkar dynamiken hos värmepatogeneffektorn AvrStb6 och strobilurinresistens. Nat Genet. 2018;50. https://doi.org/10.1111/nph.14434.
51. Saintenac C, Lee WS, Cambon F, Rudd JJ, King RC, Marande W, et al. Vetereceptorkinasliknande protein Stb6 kontrollerar gen-för-gen-resistens mot svamppatogen Zymoseptoria tritici. Nat Genet. 2018;50. https://doi.org/ 10.1038/s41588-018-0051-x.
52. Tan KC, Oliver RP, Solomon PS, Mofat CS. Proteinhaltiga nekrotrofiska effekter i svampvirulens. Funktion Plant Biol. 2010;37. https://doi.org/10. 1071/FP10067.
53. Bouton C, King RC, Chen H, Azhakanandam K, Bieri S, Hammond-Kosack KE, et al. Foxtail mosaikvirus: en viral vektor för proteinuttryck i spannmål. Plant Physiol. 2018;177. https://doi.org/10.1104/pp.17.01679.
54. Motteram J, Küfner I, Deller S, Brunner F, Hammond-Kosack KE, Nürn-berger T, et al. Molekylär karakterisering och funktionell analys av MgNLP, det enda NPP1-domäninnehållande proteinet, från svampvetebladpatogenen mycosphaerella graminicola. Mol Plant-Microbe Interact. 2009;22. https://doi.org/10.1094/MPMI-22-7-0790.
55. Faris JD, Zhang Z, Lu H, Lu S, Reddy L, Cloutier S, et al. En unik resistensliknande gen för vetesjukdomar styr effektorutlöst känslighet för nekrotrofiska patogener. Proc Natl Acad Sci US A. 2010;107. https://doi. org/10.1094/MPMI-22-7-0790.
56. Lu Y, Deng J, Rhodes JC, Lu H, Lu LJ. Förutsäga viktiga gener för att identifiera potentiella läkemedelsmål i Aspergillus fumigatus. Comput Biol Chem. 2014;50. https://doi.org/10.1016/j.compbiolchem.2014.01.011.
57. Osmani AH, Oakley BR, Osmani SA. Identifiering och analys av essentiella Aspergillus nidulans-gener med hjälp av heterokaryon-räddningstekniken. Nat Protoc. 2006;1. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.406.
58. Hu W, Sillaots S, Lemieux S, Davison J, Kaufman S, Breton A, et al. Essentiell genidentifiering och prioritering av läkemedelsmål i Aspergillus fumigatus. PLoS Pathog. 2007;3. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 0030024.
59. Habig M, Quade J, Stukenbrock EH. Den framåtgående genetikmetoden avslöjar den värdgenotypberoende betydelsen av accessoriska kromosomer i svampvetepatogenen Zymoseptoria tritici. MBio. 2017;8. https://doi. org/10.1128/mBio.01919-17.
60. Fouché S, Badet T, Oggenfuss U, Plissonneau C, Francisco CS, Croll D. Stress-driven transposerbar element de-repression dynamik och virulens evolution i en svamp patogen. Mol Biol Evol. 2020;37. https://doi. org/10.1093/molbev/msz216.
61. Möller M, Habig M, Freitag M, Stukenbrock EH. Extraordinär genominstabilitet och utbredda kromosomomläggningar under vegetativ tillväxt. Genetik. 2018;210. https://doi.org/10.1534/genetics.118.301050.
62. Bertazzoni S, Williams AH, Jones DA, Syme RA, Tan KC, Hane JK. Tillbehör gör outfiten: tillbehörskromosomer och andra dispenserbara DNA-regioner i växtpatogena svampar. Mol Plant-Microbe Interact. 2018;31. https://doi.org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.
63. Krishnan P, Meile L, Plissonneau C, Ma X, Hartmann FE, Croll D, et al. Transponerbara elementinsättningar formar genreglering och melaninproduktion i en svamppatogen av vete. BMC Biol. 2018;16. https://doi. org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.
64. Sánchez-Vallet A, Tian H, Rodriguez-Moreno L, Valkenburg DJ, Saleem Batcha R, Wawra S, et al. En utsöndrad LysM-effekt skyddar svamphyfer genom kitinberoende homodimerpolymerisation. PLoS Pathog. 2020;16. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008652.
65. Breen S, Williams SJ, Winterberg B, Kobe B, Solomon PS. Vete PR-1-proteiner riktas mot nekrotrofa patogeneffektorproteiner. Plant J. 2016;88. https://doi.org/10.1111/tpj.13228.
66. Snelders NC, Petti GC, van den Berg GCM, Seidl MF, Thomma BPHJ. Ett uråldrigt antimikrobiellt protein samordnat av en svampväxtpatogen för manipulation av planta mycobiom. Proc Natl Acad Sci US A. 2021;118. https://doi.org/10.1073/pnas.2110968118.
67. Snelders NC, Rovenich H, Petti GC, Rocafort M, van den Berg GCM, Vorholt JA, et al. Mikrobiommanipulation av en jordburen svampväxtpatogen med hjälp av effektorproteiner. Nat Plants. 2020. https://doi.org/10. 1038/s41477-020-00799-5.
68. Rocha RO, Wilson RA. Magnaporthe oryzae nukleosid-difosfatkinas krävs för metabolisk homeostas och redoxmedierad värds medfödd immunitetssuppression. Mol Microbiol. 2020;114. https://doi.org/ 10.1111/mmi.14580
