Att övervinna immunbrist med allogrooming
Oct 19, 2023
Enkel sammanfattning:
Vi undersökte om två närbesläktade termitarter skiljer sig åt i deras beroende av social eller individuell immunitet mot två arter av patogena svampar, som alla samlades in från samma plats. Våra resultat indikerar att ömsesidig grooming (allogrooming) är mycket effektivt för att begränsa dödliga infektioner i den utsträckning att det kan kompensera för relativt svagt individuellt immunförsvar. Efter att patogener har påträffats använder termiter en alternativ strategi för social distansering och för att begränsa spridningen av smittsamma sjukdomar och går istället samman för att rensa varandra. Variation i intensiteten av detta beteendesvar indikerar ett nyanserat svar på hotnivån.
cistanche tillägg fördelar-öka immunitet
Abstrakt:
Allogrooming verkar vara väsentligt hos många sociala djur för skydd mot rutinmässig exponering för parasiter. Hos sociala insekter tycks det vara avgörande för att avlägsna patogena propaguli från nagelbandet innan de kan starta en infektionscykel. För underjordiska termiter inkluderar detta svampsporer som ofta förekommer i jorden, såsom Metarhizium conidia, som snabbt kan gro och penetrera nagelbandet. Vi undersökte om det finns en skillnad i beroende av social och medfödd immunitet hos två närbesläktade underjordiska termiter för skydd mot dödliga infektioner av två lokalt påträffade Metarhizium-arter. Våra resultat indikerar att relativt svag medfödd immunitet hos en termitart kompenseras av mer ihållande allogrooming. Detta inkluderar förbättrad allogrooming som svar på koncentrationer av konidier som återspeglar mer rutinmässig kontaminering av nagelbanden såväl som på kraftig kutikulär kontaminering som framkallar en nätverksansluten nödsituation.
Nyckelord:
social immunitet; medfödd immunitet; entomopatogener; larmbeteende; terminal
cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret
Klicka här för att se produkter från Cistanche Enhance Immunity
【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
1. Introduktion
Sociala försvarsmekanismer kan vara mycket effektiva för att motverka känslighet för smittsam sjukdom trots att sällskaplighet gynnar dess spridning [1,2]. Hos termiter och myror verkar utvecklingen av effektiva sociala mekanismer för immunförsvar ha avslappnat det selektiva trycket på individuella medfödda immunmekanismer [3-6]. Efter att patogener har påträffats, kommer hotet om sjukdomar hos sociala insekter att bero på effektiviteten hos medfödda frontlinjeförsvar, som inkluderar fysiska hinder för infektion. Många svamppatogener producerar asexuella sporer (konidier) som direkt kan penetrera insektens nagelband. Socialt immunförsvar som hjälper till att skydda nagelbandet, inklusive allogrooming och utsöndrade svampdödande medel, verkar vara särskilt viktigt hos termiter för försvar mot Metarhizium spp [7–9]. Metarhizium conidia finns allestädes närvarande i jorden som många termiter rör sig genom medan de söker föda och når koncentrationer som upprätthåller ett konstant hot om infektion [10]. Termiter som söker föda, såsom arter av släktet Reticulitermes, rör sig genom jorden för att utöka sina koloniers räckvidd och komma åt flera matställen, som vanligtvis är träresurser som vilar på markytan [11]. Deras koloniers underjordiska nätverk kan sträcka sig över tiotals meter, innehålla över hundra tusen individer och nå tätheter på över hundra kolonier per hektar [12]. De utvecklades från en förfader med kolonier begränsade till ett enda stycke trä [13,14]. Denna övergång skulle ha resulterat i ökade möten med rovdjur, patogener och konkurrenter och sammanföll med utvecklingen av en dedikerad verklig arbetarkast som vanligtvis avstår från direkt reproduktion. Förbättrad hygien har sannolikt varit avgörande för denna övergång och den efterföljande strålningen och nuvarande ekologiska framgång för termiter, vars bidrag till träförfall kan överstiga mikrobiell nedbrytning [15,16] och som verkar vara redo att snabbt expandera globalt när temperaturerna stiger [17] . Under övergången till födosök sammanföll en avslappning av det selektiva trycket på medfödda immungener med dess intensifiering på två gener som producerar utsöndrade antimykotisk proteiner [6]. Dessa proteiner verkar vara väsentliga för avlägsnande av svampkonidier med allogrooming. Det kontrasterande selektiva trycket på komponenter i individuella medfödda och sociala försvarsmekanismer i det förflutna antyder att det fortsätter att finnas en adaptiv kompromiss mellan termiters beroende av individuell medfödd och social immunitet för skydd mot svampsjukdomar. Detta stöds av observationen att det medfödda immungenuttrycket är lägre i grupper än individer av Reticulitermes-arbetare som har exponerats för Metarhizium conidia [18]. Allogrooming minskar behovet av att aktivera interna immunförsvar. I denna studie undersökte vi skillnader i social och medfödd immunitet hos två arter av underjordiska termiter mot två lokala arter av Metarhizium som möter varandra naturligt. Metarhizium-arterna isolerades från jorden under eller bredvid stockar där termiter samlades in. De två termitarterna, Reticulitermes virginicus och Reticulitermes flavipes, samlades in från samma plats i Maryland. Även om de verkar vara agonistiska, hittas de ofta föda bredvid varandra eller till och med ibland i samma stock. Interspecifik aggression mellan arbetare resulterar ofta i dödliga sår i petriskålagonismanalyser [19]. Den svampdödande aktiviteten av kutikulära tvättar av R. virginicus-arbetare har tidigare visat sig vara mer effektiva för att inaktivera Metarhizium conidia än tvättar från R. flavipes-arbetare [20]. Detta tyder på att även om dessa två termiter är nära besläktade och stöter på samma patogener, kan de skilja sig åt i deras beroende av individuell medfödd eller social immunitet. Vi använde ett jämförande tillvägagångssätt för att undersöka om det finns en skillnad mellan beroendet av och integrationen av social och medfödd immunitet och om det finns en potentiell kompromiss mellan de två. Förbättrad social immunitet kan vara associerad med mindre effektiva medfödda immunmekanismer, vilket kan inkludera styrkan hos utsöndrade svampdödande medel och vice versa. Svagare individuell immunitet kan kompenseras av effektivare social immunitet. Överlevnaden av termitarbetare i sena stadiet i grupper om tolv, par eller singlar undersöktes efter att de hade utmanats med svampar från antingen Metarhizium robertsii eller Metarhizium brunneum. Grupper om 12 arbetare exponerades kort för en hög dos av svampen. Denna potentiellt dödliga koncentration orsakar liknande beteendereaktioner som de som observeras när termiter möter ett sporbildande kadaver, vilket i vissa fall framkallar en avsevärd ökning av ett larmsvar som resulterar i snabba longitudinella oscillerande rörelser, LOMs [21–23]. Frekvensen av LOM under de första 12 minuterna efter att termiter exponerats för konidier av olika stammar och arter av Metarhizium är positivt korrelerad med frekvensen av anfall av allogrooming. LOM, som är lättare att mäta än allogrooming, kan därför användas som ett indirekt mått på allogroomingnivåer. Detektering av svampen verkar vara försenad tills ytorna på termiter är kontaminerade med konidier, vilket tyder på att igenkänningsreceptorer associerade med mundelar är avgörande för uppkomsten av förhöjt larm och allogrooming. Par och singlar exponerades för en låg dos av svampen som är mer sannolikt att återspegla nivåerna av exponering som termiter möter när de bygger gallerier genom jorden, i motsats till direkta möten med sporbildande kadaver. Till skillnad från enstaka termiter är termitpar nästan helt resistenta mot dödliga infektioner vid denna dos under 10 dagar. För att reta isär social och medfödd immunitet vid denna låga dos, separerades par av termiter vid olika tidpunkter kort efter utmaningar med svampkonidier, och överlevnaden av dessa par jämfördes med singelbarn som inte hade några möjligheter till social interaktion efter svamputmaningar. Allogrooming och LOMs observerades före separationstidpunkterna för termitpar. Dessutom testades den antifungala aktiviteten hos råextrakt av hela termiter för att ytterligare bedöma skillnader i medfödd immunitet mellan de två termitarterna som svar på de två svamparterna.
Fördelarna med cistanche tubulosa-stärka immunförsvaret
2. Metoder
2.1. Studera organismer
Termiterna R. flavipes och R. virginicus, och svamparna M. brunneum och M. Roberts, samlades in från sekundärt växande lövskog i Baltimore County (Pleasant Hills och Monkton), Maryland. Termitarter identifierades med hjälp av intra- och interspecifika agonismanalyser [19] och mitokondriella rRNA-sekvenser [4]. Metarhizium-arterna isolerades från jordprover nära termituppsamlingsplatser (<30 cm) using a baiting technique with Tenebrio molitor larvae [24]. The conidia and mycelia of two clonal lines of the species were used for DNA purification with a QIAGEN DNeasy Blood and Tissue kit. The 50 regions of translation elongation factor 1-alpha were PCR-amplified using PCR primers EF1T and EF2T [25]. These regions were Sanger-sequenced (Psomagen, Rockville, MD) for species identification. Foraging groups of R. flavipes and R. virginicus (>1000) och veden som de matade i samlades upp och förvarades i plastbehållare under mörka, fuktiga förhållanden vid 25 ◦C. Termiter som tillhör samma art samlades in från platser som var åtskilda med minst 60 m, vilket vanligtvis räcker för att säkerställa att samlingarna kommer från olika kolonier [12]. Dessa separata samlingar hänvisas till som kolonier nedan. Termiter samlades in sommaren 2018 och 2019 för experimenten med grupperna om 12 samt in vitro-experiment med termitråextrakt och 2021 och 2022 för experimenten med par och singlar. Termiter användes i sina respektive experiment inom 4 månader efter insamling. Arbetare togs försiktigt bort från träbitar och hölls i grupper med 12 55 mm diameter petriskålar fodrade med fuktat filterpapper (Whatman 1) i 24 timmar i omgivande ljus innan de användes för våra experiment. Detta gjorde det möjligt för dem att acklimatisera sig till ljus och rengöra sina kutikulära ytor från partiklar innan svampexponeringen. Vi inkluderade inte soldater eftersom de inte ansar bokamrater, representerar 1–2 % av kolonin och inte konsekvent finns i födosöksgrupper.
2.2. Överlevnad och larmsvar för grupper om tolv
Grupper om 12 R. flavipes eller R. virginicus arbetare exponerades för en hög dos av 10 6 konidier mL−1 av 0.05 % Tween 80 (MilliporeSigma , Burlington, MA, USA) eller 0,05 % Tween 80 för kontroller. Tween 80 inkluderades för att hjälpa till att bryta upp klumpar av konidier vid framställning av suspensionerna. Dagen före dessa behandlingar märktes alla 12 termiterna med en liten prick av färgad emaljfärg på ryggsidan av buken så att de kunde identifieras individuellt. Allogrooming tog bort färgen från ett fåtal individer, men dessa individer kunde fortfarande identifieras individuellt vid tidpunkten för döden genom att kartlägga de överlevande och genom naturlig individuell variation hos arbetarna, såsom graden av mörk färg i buken. Termiterna som användes för varje replikat av 12 utmanade termiter och kontroller var från olika kolonier. Fem kolonier användes för både R. flavipes och R. virginicus (n=480 arbetare). Experiment med M. Roberts kolonier upprepades efter tre månader för att testa för konsistens i överlevnad. Totalt fanns det 60 replikat av 12 eller 11 termiter (n=709). I 11 replikat dog en termit före svampexponering, vilket verkade bero på hantering vid färgmarkering. Termiter exponerades för konidier framställda från en klonal kultur av antingen M. Roberts eller M. brunneum. Arbetare sattes till 1,5 ml rör innehållande 500 µL av konidiespädningarna, eller 0,05 % Tween 80 för kontroller, med en liten plasttratt och omrördes försiktigt i 10 s för att säkerställa fullständig nedsänkning. Arbetarna placerades sedan på filterpapper för att absorbera överskottsvätska, överfördes till petriskålar med diametern 55 mm fodrade med fuktat filterpapper (Whatman 1), och video spelades in under 12 minuter. Dödligheten övervakades dagligen under två veckor. Döda individer avlägsnades, ytsteriliserades med 70 % etanol och placerades på fuktigt filterpapper i petriskålar (55 mm) som hölls vid 24 ◦C och 100 % luftfuktighet för att bekräfta Metarhizium-infektion (grön muskardintillväxt efter 3–4 dagar). Det totala antalet LOM som observerades i videorna under 12 min poängsattes för varje termit. LOM varade mellan 2–7 s och måste ha stannat och sedan återupptagits för att poängsättas som separata händelser [23].
2.3. Överlevnad och allogrooming för par och singlar
Överlevnaden av termitpar jämfördes med singlar efter exponering för en låg dos (104 konidier mL−1) av konidier som inte orsakade överdriven dödlighet och sannolikt återspeglar koncentrationer som termiter möter när de rör sig genom marken [10] . Par och singlar jämfördes för att mäta överlevnad som ges av sociala försvarsmekanismer. Grupper om 12 arbetare utmanades initialt med eller utan svampar som beskrivits ovan, förutom att konidiasuspensioner på cirka 107 konidier ml-1 bereddes i 0,1 % Tween 80 och virvlades kraftigt före spädningar med sterilt vatten till 104 konidier ml-1. Tween 80 inkluderades inte i spädningarna eftersom suspensioner av individuella konidier kunde hållas vid låga koncentrationer och eftersom det ytaktiva medlet kan störa vidhäftningen av konidier till nagelbandet. Dessa individer var inte målarmärkta. Omedelbart efter behandlingar och innan termiter hade möjlighet att interagera, delades de upp i par eller singlar i brunnarna på 24-brunnsplastcellodlingsplattor (CELLTREAT Scientific, Pepperell, MA). Varje brunn kläddes med fuktat filterpapper (Whatman 1). För varje termit-/svampkombination (n=4) separerades fyra termitpar i singlar efter 15 minuter, 2 timmar, 5,5 timmar, 8 timmar och 27 timmar (n=160), och för varje termit/svampkombination 12 termiter som aldrig hade möjlighet att interagera separerades i svampbehandlade eller kontrollsinglar (n=96). Dessa individuella termiter delades också upp i 24-brunnsplattor klädda med filterpapper. Termiternas dödlighet övervakades därefter under tio dagar, och döda individer avlägsnades för att bekräfta infektion med Metarhizium. En enda koloni användes för både R. flavipes behandlad med M. robertsii eller M. brunneum och R. virginicus behandlad med M. robertsii eller M. brunneum (n=256). Sex obehandlade par hölls också i 24-brunnsplattor i 10 dagar för varje art. Ett separat experiment med samma kolonier fokuserade på att registrera allogrooming före separationstiderna för paren vid 15 minuter, 2 timmar, 5,5 timmar, 8 timmar och 27 timmar. Sex olika par av varje termitart behandlades med varje svamp eller vatten för kontroller och poängsattes för allogrooming i 15 minuter före separationstidpunkterna (n=180). Allogrooming-händelser poängsattes när mun-till-kropp-kontakt mellan två termiter involverade rörelse av mundelar (palper), och varaktigheten av varje oavbruten allogrooming-händelse registrerades. Allogrooming poängsattes av en enda observatör som var blind för vilken behandling termiter hade fått. LOMs poängsattes också men var försumbara och användes inte i analysen. Självvård observerades inte.
Fördelarna med cistanche tubulosa-stärka immunförsvaret
2.4. In vitro antimykotisk aktivitet
Tolv arbetare från 5 R. flavipes- eller R. virginicus-kolonier kallimmobiliserades i 1,5 ml Eppendorf-rör och 12 0 µL kallt, sterilt vatten sattes till varje rör. Arbetarna från båda arterna som användes i denna studie var ungefär lika stora (längd 4–5 mm). Termiterna homogeniserades med en plaststöt och extraktet centrifugerades vid 16, 000 g under 2 min. Supernatanten filtersteriliserades med 0,22 µm Ultrafree-filter (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA). Tio µL av filtratet inkuberades under 24 timmar med 10 µL innehållande 100 konidier av M. robertsii eller M. brunneum och 20 µL av 100 µg ml-1 ampicillin för att ytterligare undvika bakteriell kontaminering. Kontrollerna inkluderade 10 µL sterilt vatten i stället för det råa extraktet. Två replikat för varje inkuberad blandning spreds på potatisdextrosagar (PDA) kompletterad med 50 µg ml-1 ampicillin (60 mm petriskålar) och inkuberades vid rumstemperatur i mörker i 4–5 dagar. Antifungal aktivitet mättes genom att jämföra kolonibildande enheter (CFU) i råextraktbehandlingar med kontroller.
2.5. Statistik
Kaplan-Meier uppskattningar av genomsnittliga överlevnadstider användes för parvisa jämförelser av överlevnad. Hazard ratios of death (HRs) beräknades med Cox regressionsanalys. Vi använde Cox-regression för att undersöka skillnader i dödlighet mellan individer som uppvisar LOMs eller inte uppvisar LOMs samtidigt som vi kontrollerade för andra kategoriska variabler (svampbehandling eller kontroll, svamparter, termiter, ursprungskoloni). LOMs kategoriserades som frånvarande eller närvarande hos individer på grund av frekvensen av extremvärden och bristen på normalitet. I överlevnadsanalysen med termitpar och singlar baserades HR på en jämförelse mellan konidierbehandlade par (separerade vid olika tidpunkter) och konidierbehandlade singlar. Dessa HR:er ger därför ett mått på överlevnad som ges av sociala försvarsmekanismer samtidigt som de kontrollerar individuella försvarsmekanismer. Sambandet mellan tid som ett par och förändring i HR mättes med Pearson-korrelationer. Fördelningen av LOM mellan olika behandlingar jämfördes med ett Kruskal–Wallis-test med Bonferroni-korrigeringar för flera tester för parvisa jämförelser. Den genomsnittliga CFU eller varaktigheten av allogrooming-händelser jämfördes med ett ANOVA-test med Bonferroni-korrigeringar för parvisa jämförelser. Vi använde IBM SPSS Statistics (version 28) för de statistiska testerna.
3. Resultat
3.1. Överlevnad och larm för utmanade grupper om tolv
The Cox regression model of survivorship that included categorical variables for fungal treatment, LOMs, termite species, fungi species, and a colony of origin was significant (Chi-square = 246.29, df = 12, p < 0.001). Challenged termites were 9.28 times more likely to die than untreated termites (Wald = 143.05, p < 0.001) while controlling for the other variables. Termites that displayed LOMs (n = 422) were 1.52 times more likely to survive (Wald = 8.30, p = 0.004) than individuals that did not display LOMs (n = 286). R. virginicus workers were 2.08 times more likely to die than R. flavipes workers (Wald = 6.31, p = 0.012). Fungal species did not contribute significantly to the model (Wald = 0.841, p = 0.359). The colony of origin contributed significantly to the model (Wald = 50.16, p < 0.001), which is consistent with previously reported colony variation in Reticulitermes resistance to Metarhizium infections [24]. Survivorship did not differ between the same colony when the experiment was repeated 3 months later with workers that were exposed to M. Roberts (Breslow pairwise comparison, Chi-square = 0.342, p = 0.559). Most deaths in the challenged termites were attributable to Metarhizium infection (>9 0 % bekräftelse). För utmanade termiter med M. Roberts observerades 129 dödsfall bland 237 individer, och den genomsnittliga överlevnadstiden för R. virginicus (9,10 dagar) var signifikant lägre än för R. flavipes (10). 98 dagar)(Breslow=10.05, df=1, p=0.002) (Figur 1). För utmanade termiter med M. brunneum observerades 79 dödsfall bland 120 individer, och den genomsnittliga överlevnaden för R. flavipes (9,70 dagar) var lägre än för R. virginicus (10,68 dagar) men inte signifikant (Breslow=2 .74, df=1, sid=0.098). Fördelningen av LOMs (Figur 2) mellan svamp- och kontrollbehandlingar var signifikant olika (Kruskal–Wallis=176.897, df=5, p < 0,001). Frekvensen av LOM skilde sig inte signifikant mellan M. brunneum-behandlingar och deras respektive kontroller för R. flavipes (justerad p=0.097) och R. virginicus (justerad p=1.000 ). Frekvensen av LOMs var dock signifikant högre för M. Roberts-behandlingar jämfört med deras respektive kontroller för R. flavipes (justerat p < 0,001) och R. virginicus (justerat p < 0,001) (Figur 2). För M. Roberts-behandlingen var frekvensen av R. flavipes LOMs signifikant högre än R. virginicus LOMs (justerad p < 0,001). För M. brunneum-behandlingen skilde sig dock frekvensen av R. flavipes LOM inte signifikant från R. virginicus LOM (justerad p=1.000). I motsats till M. brunneum resulterade grupper om 12 termiter som utmanats med M. Roberts konidier i en signifikant beteenderespons.
3.2. Överlevnad av utmanade par och singlar
Överlevnaden av termitpar som separerades vid olika tidpunkter kort efter patogenutmaning jämfördes med överlevnaden av utmanade singlar med hazard ratios of death (HRs). En HR på 1 motsvarar lika överlevnad i de separerade paren och singlar under tio dagar. Värden mindre än ett indikerar att det finns minskad dödlighet i de separerade paren jämfört med enlingarna. Korrelationen mellan tid som ett par och minskningen av HR var endast signifikant för R. flavipes som behandlades med antingen M. Roberts (r=−0.978, p=0.{ {7}}04) eller M. brunneum (r=−0.983, s=0.003), och inte för R. virginicus behandlad med någondera M. Roberts (r=−0,643, s=0.242) eller M. brunneum (r=−0,812, s=0.095). Detta återspeglas också i R2-värdena från linjära regressioner som visas i figur 3 (tiden log-transformerades för beräkning av Pearson-korrelationerna och R2-värdena). Inget dödsfall observerades i obehandlade par (6 par för varje termitart) och ett dödsfall i 16 behandlade par (4 par för varje termit/svampkombination) som aldrig separerades under 10 dagar.
Figur 1. Överlevnad för grupper om 12. Rf motsvarar R. flavipes, Rv med R. virginicus, Mr med M. robertsii och Mb med M. brunneum. Signifikanta överlevnadsskillnader för parvisa jämförelser baserades på Breslow-tester (generaliserade Wilcoxon-tester). * Signifikant skillnad mellan behandlingar, NS ingen signifikant skillnad mellan behandlingar (s< 0.025 Bonferroni adjusted α). The distribution of LOMs (Figure 2) among fungal and control treatments was significantly different (Kruskal–Wallis = 176.897, df = 5, p < 0.001). The frequency of LOMs was not significantly different between M. brunneum treatments and their respective controls for R. flavipes (adjusted p = 0.097) and R. virginicus (adjusted p = 1.000). However, the frequency of LOMs was significantly greater for M. robertsii treatments compared to their respective controls for R. flavipes (adjusted p < 0.001) and R. virginicus (adjusted p < 0.001) (Figure 2). For the M. robertsii treatment, the frequency of R. flavipes LOMs was significantly greater than R. virginicus LOMs (adjusted p < 0.001). However, for the M. brunneum treatment, the frequency of R. flavipes LOMs was not significantly different from R. virginicus LOMs (adjusted p = 1.000). In contrast to M. brunneum, groups of 12 termites challenged with M. robertsii conidia resulted in a significant behavioral response.
Figur 1. Överlevnad för grupper om 12. Rf motsvarar R. flavipes, Rv med R. virginicus, Mr med M. robertsii och Mb med M. brunneum. Signifikanta överlevnadsskillnader för parvisa jämförelser baserades på Breslow-tester (generaliserade Wilcoxon-tester). * Signifikant skillnad mellan behandlingar, NS ingen signifikant skillnad mellan behandlingar (s< 0.025 Bonferroni adjusted α). For the survivorship of pathogen-challenged single termites (Figure 4), 47 deaths were observed among 48 individuals, and the mean survival time for R. flavipes (4.21 days) was significantly lower than for R. virginicus (6.17 days)(Breslow, chi-square = 33.927, df = 1, p < 0.001). This relationship held for both species of fungi: For M. robertsii exposure, the mean survival time for R. flavipes (4.25 days) was significantly lower than for R. virginicus (5.83 days) (chi-square = 16.133, df = 1, p < 0.001); For M. brunneum exposure, the mean survival time for R. flavipes (4.17 days) was significantly lower than for R. virginicus (6.50 days) (chi-square = 20.994, df = 1, p < 0.001). 3.3. Antifungal Activity of Crude Extracts The two species of fungi were analyzed separately (the viability of conidia on PDA differs between the two species). For M. robertsii, mean colony-forming units (CFUs) among fungal and control treatments were significantly different (F = 18.08, df = 2, p < 0.001) (Figure 5a). Crude extracts of R. virginicus but not R. flavipes workers showed significant antifungal activity against M. robertsii compared to the control (adjusted p < 0.001 and p = 1.000, respectively). The antifungal activity of R. virginicus extracts against M. robertsii was significantly greater than the antifungal activity of R. flavipes extracts against M. robertsii (adjusted p < 0.001). For M. brunneum, mean CFUs (Figure 5b) among fungal and control treatments were significantly different (F = 27.26, df = 2, p < 0.001). Crude extracts of R. virginicus but not R. flavipes showed significant antifungal activity against M. brunneum compared to the control (adjusted p < 0.001 and p = 0.072, respectively). The antifungal activity of R. virginicus extracts against M. brunneum was significantly greater than the antifungal activity of R. flavipes against M. brunneum (adjusted p < 0.001).
3.3. Antifungal aktivitet av råextrakt
De två svamparterna analyserades separat (viabiliteten av konidier på PDA skiljer sig mellan de två arterna). För M. robertsii var medelkolonibildande enheter (CFU) bland svamp- och kontrollbehandlingar signifikant olika (F=18.08, df=2, p < 0 .001) (Figur 5a). Råextrakt av R. virginicus men inte R. flavipes-arbetare visade signifikant svampdödande aktivitet mot M. robertsii jämfört med kontrollen (justerad p < 0.001 och p=1.{{ 10}}, respektive). Den svampdödande aktiviteten hos R. virginicus-extrakt mot M. robertsii var signifikant högre än den antimykotiska aktiviteten hos R. flavipes-extrakt mot M. robertsii (justerat p < 0,001). För M. brunneum var medel-CFU (Figur 5b) bland svamp- och kontrollbehandlingar signifikant olika (F=27.26, df=2, p < 0,001). Råextrakt av R. virginicus men inte R. flavipes visade signifikant antifungal aktivitet mot M. brunneum jämfört med kontrollen (justerat p < 0,001 respektive p=0}.072). Den svampdödande aktiviteten hos R. virginicus-extrakt mot M. brunneum var signifikant större än den antimykotiska aktiviteten hos R. flavipes mot M. brunneum (justerat p < 0,001).
Figur 2. Larmreaktion på svampangrepp. Boxplots representerar fördelningen av LOMs (LOMs poängsatta i 709 målarmärkta individer). Rutor motsvarar avståndet mellan övre och nedre kvartilen från medianen (IQR). Morrhår motsvarar 1,5 × IQR. Cirklar och asterisker visar extremvärden bortom 1,5 × IQR respektive 3 × IQR. Olika bokstäver indikerar signifikanta skillnader mellan fördelningar för svamp- och kontrollbehandlingar (Bonferroni justerad). Rf motsvarar R. flavipes, Rv med R. virginicus, Mr med M. robertsii och Mb med M. brunneum.
3.4. Allogrooming bland utmanade par
Frekvensen av allogrooming-anfall minskade signifikant med svampangrepp (utmaningsmedelvärde {{0}}.55, kontrollmedelvärde=8.80, t=−4.461, p < {{20}}.001). Den genomsnittliga varaktigheten av allogrooming ökade dock signifikant med svampangrepp (utmaningsmedelvärde=19.01 s, kontrollmedelvärde=5.62 s, t=4.876, p < 0.001). Varaktigheten av allogrooming-anfall för varje interaktion mellan termitpar skilde sig signifikant mellan behandlingar och kontroller (F=7.166, df=5, p < 0,001) (Figur 6). Allogrooming-varaktigheten per händelse var signifikant förhöjd i R. flavipes-par behandlade med M. robertsii (justerat p < 0,001) eller M. brunneum (justerat p=0}.037) jämfört med kontroller men inte i R. virginicus-par som behandlats med M. robertsii (justerad p=1.000) eller M. brunneum (justerad p=1.000) i förhållande till kontroller.
Figur 3. Överlevnaden av två termiter jämfört med en jämfördes med riskkvoter för dödsfall (n=80 par, 96 singlar). Rf motsvarar R. flavipes, Rv med R. virginicus, Mr med M. robertsii och Mb med M. brunneum. Tiden logtransformerades för beräkning av R2-värdena.
Figur 4. Överlevnad av enstaka termiter efter en svampangrepp (n=96). Rf motsvarar R. flavipes, Rv med R. virginicus, Mr med M. robertsii och Mb med M. brunneum. Se texten för detaljer om statistiska skillnader mellan behandlingar. Signifikanta överlevnadsskillnader för parvisa jämförelser baserades på Breslow-tester (generaliserade Wilcoxon-tester). * Signifikant skillnad mellan behandlingarna (p < 0.025 Bonferroni justerad).
Figur 5. Antifungal aktivitet av råextrakt mot M. robertsii (a) och M. brunneum (b). Värden ovanför staplarna representerar genomsnittliga CFU (±SD), och olika bokstäver indikerar signifikanta skillnader (Bonferroni justerad). Rf motsvarar R. flavipes och Rv med R. virginicus. Analysen använde två replikat från 5 kolonier från varje termitart, 6 replikat för Rf-kontrollen och 2 replikat för Rv-kontrollen.
Figur 6. Varaktighet för allogrooming per interaktion (n=161 allogrooming-händelser). Värden ovanför staplarna representerar medelvaraktigheten av allogrooming-interaktioner (±SD), och distinkta bokstavskombinationer indikerar signifikanta skillnader (Bonferroni justerad). Rf motsvarar R. flavipes, Rv med R. virginicus, Mr med M. robertsii och Mb med M. brunneum.
4. Diskussion
R. flavipes förlitar sig på sociala försvarsmekanismer mot lokala svamppatogener i större utsträckning än R. virginicus. För R. flavipes-arbetare som utmanats med någon av Metarhizium-arterna, fanns det ett starkt negativt samband mellan tiden två termiter tillbringade tillsammans och deras sannolikhet att dö i förhållande till utmanade enstaka termiter. Riskkvoten för dödsfall i förhållande till utmanade enstaka termiter halverades på cirka två timmar (Figur 3). Tidiga sociala interaktioner verkar därför vara avgörande för överlevnad när R. flavipes-arbetare stöter på låga koncentrationer av Metarhizium conidia. Däremot visade R. virginicus-arbetare ett svagt samband mellan tiden två termiter tillbringade tillsammans och deras sannolikhet för döden. Dessutom, till skillnad från R. virginicus, ökade R. flavipes arbetarpar signifikant varaktigheten av allogrooming-anfall efter en svampangrepp (Figur 6). Detektering av konidier på en bokamrats nagelband har sannolikt lett till denna ökning. Effektivare avlägsnande av konidier från kutikulära ytor genom att öka varaktigheten av allogrooming-anfall verkar förklara R. flavipes överlägsna sociala immunitet. Våra resultat indikerar också att R. virginicus förlitar sig på individuella medfödda försvarsmekanismer mot lokala svamppatogener i större utsträckning än R. flavipes. Dödligheten för enstaka R. flavipes-arbetare som utmanats med någon av Metarhizium-arterna var signifikant högre än dödligheten för R. virginicus-arbetare (Figur 4). Den svampdödande aktiviteten hos R. virginicus arbetare kutikulära tvättar mot Metarhizium conidia har tidigare visat sig vara betydligt starkare än aktiviteten hos R. flavipes-arbetare [20]. Den svampdödande aktiviteten hos råextrakt av hela termiter var också starkare hos R. virginicus än hos R. flavipes (Figur 5). Dessa extrakt inkluderar föreningar från symbionter i tarmen, som tillsammans med svampdödande termitföreningar också kan bidra till att eliminera intagna konidier [26]. Variationen i riskkvoter för dödsfall och deras svaga korrelation med separationstider hos R. virginicus-arbetare överensstämmer med ett större beroende av medfödda immunförsvarsmekanismer som varierar mellan individer snarare än sociala immunmekanismer. R. flavipes visade också ett större beroende av social immunitet när grupper om 12 arbetare kortvarigt exponerades för höga koncentrationer av M. robertsii conidia. Omedelbart efter exponering för M. robertsii conidia visade båda termitarterna förhöjda LOM. Denna larmaktivitet var signifikant högre hos R. flavipes än hos R. virginicus (Figur 2), och motståndet mot dödliga infektioner var också signifikant högre hos R. flavipes än hos R. virginicus (Figur 1). Däremot var det en förhöjd men svag larmreaktion på M. brunneum conidia. I enlighet med detta resultat har det tidigare visats att förhöjt larm hos R. flavipes som svar på konidier hos olika Metarhizium-stammar och -arter är korrelerat med förhöjd allogrooming och överlevnad [23]. R. flavipes-arbetare kan ha en lägre tröskel än R. virginicus-arbetare för att känna igen och reagera kollektivt och effektivt på kutikulär kontaminering med M. robertsii conidia. M. robertsii, som är den vanligaste Metarhizium-arten i vår studieplats [24], kan representera ett hot mot R. flavipes som kräver ett starkt socialt immunsvar eftersom denna termit har relativt svagt medfödd immunförsvar mot sig. Effektiviteten hos svampdödande föreningar associerade med salivkörtelsekret är sannolikt avgörande för de individuella försvar som observerats i denna studie [20]. Dessa föreningar finns på ytan av arbetarna före svampproblem eftersom de uttrycks konstitutivt och ständigt sprids genom basala nivåer av allogrooming, vilket därför integrerar individuella och sociala försvar. Denna gestalt inkluderar sannolikt den lilla defensinliknande svampdödande peptiden termicin, som utsöndras i spottkörteln och är avgörande för försvaret mot dödliga infektioner av Metarhizium [27]. En studie av R. flavipes och R. virginicus från samma insamlingsplats i Maryland som användes i denna studie avslöjade att termiciner nyligen utsattes för ett selektivt svep som resulterade i en minskning av nukleotidpolymorfism, och denna minskning var större hos R. flavipes än R. virginicus [28].
cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret
Svepningen kan ha varit och kanske fortsätter att vara allvarligare för R. flavipes eftersom R. virginicus har mer effektiva medfödda immunmekanismer som minskade dess beroende av termiciner för försvar mot en nyligen genomförd svampepidemi. Alternativt kan adaptiva begränsningar för termiters utveckling (avsaknad av genetisk variation) ha lämnat R. flavipes med svagare vapen inför en ny svampepidemi. Begränsning av adaptiv förändring av termiciner under starkt selektivt tryck är också uppenbart i australiensiska Nasutitermes [29]. Den stokastiska processen med genduplicering verkar ha släppt denna begränsning i olika nasuta linjer, vilket resulterade i den upprepade utvecklingen av två termiciner med olika molekylära laddningar. Detta kan ha gynnat antifungalt försvar eftersom två terminaler med olika laddningsegenskaper begränsar möjligheterna till utveckling av svampresistens mot dem. Termiter som uppvisar larm (LOMs) efter exponering för en hög dos konidier var mindre benägna att dö under två veckor än individer som inte visade något larm. LOM är positivt korrelerade med R. flavipes arbetaraggregation och allogrooming [23], vilket tyder på att individer som uppvisar larm i denna studie begärde mer grooming från nestmates. LOM rapporteras sällan i forskning som undersöker Metarhizium-infektioner i termiter och har diskonterats som spelar en roll för att signalera patogenexponering [30]. De kan dock missas eftersom de inte förekommer hos isolerade individer, inte framkallas väsentligt av vissa stammar och arter av Metarhizium, tar cirka 3 minuter efter en utmaning innan de eskalerar och avtar efter cirka 30 minuter [22,23]. Våra resultat tyder på att LOMs kommunicerar en nödvarning efter exponering för en hög dos av konidier, som upptäcks under allogrooming. LOM är dock inte nödvändigt för ett proaktivt beteendesvar eftersom varaktigheten av allogrooming ökade efter en lågdosexponering när LOM var försumbar.
5. Slutsatser
LOM:er verkar vara en del av en nödåtgärd på kraftig kutikulär kontaminering som använder nätverkskommunikation för att snabbt eskalera borttagningen och förstörelsen av de flesta konidier innan de har en chans att fästa och gro, vilket tar cirka 12 timmar [31]. Denna akutinsats kommer sannolikt att bli energiskt dyr. Förbättrad social immunitet hos R. flavipes som svar på M. robertsii kan vara en adaptiv avvägning som R. virginicus inte behöver göra i samma utsträckning eftersom den har effektivare medfödda immunmekanismer. När de står inför låga nivåer av exponering för patogener som födosökande arbetare rutinmässigt måste tåla, verkar allogrooming också kompensera för svaga medfödda immunmekanismer.
Referenser
1. Cremer, S.; Dra, CD; Fuerst, MA Social immunitet: Uppkomst och utveckling av sjukdomsskydd på koloninivå. Annu. Rev. Entomol. 2018, 63, 105–123. [CrossRef] [PubMed] 2. Cremer, S.; Armitage, SA; Schmid-Hempel, P. Social immunitet. Curr. Biol. 2007, 17, R693–R702. [CrossRef] [PubMed]
3. Evans, JD; Aronstein, K.; Chen, YP; Hetru, C.; Imler, JL; Jiang, H.; Kanost, M.; Thompson, GJ; Zou, Z.; Hultmark, D. Immunvägar och försvarsmekanismer hos honungsbin Apis mellifera. Insekt Mol. Biol. 2006, 15, 645–656. [CrossRef] [PubMed]
4. Harpur, BA; Zayed, A. Accelererad evolution av medfödda immunitetsproteiner i sociala insekter: Adaptiv evolution eller avslappnad begränsning? Mol. Biol. Evol. 2013, 30, 1665–1674. [CrossRef] [PubMed]
5. Han, S.; Sieksmeyer, T.; Che, Y.; Mora, MAE; Stiblik, P.; Banasiak, R.; Harrison, MC; Šobotník, J.; Wang, Z.; Johnston, PR; et al. Bevis för minskad immungendiversitet och aktivitet under termiters utveckling. Proc. R. Soc. Ser. B 2021, 288, 20203168. [CrossRef]
6. Bulmer, MS; Stefano, AM Termit eussocialitet och kontrasterande selektivt tryck på social och medfödd immunitet. Behav. Ecol. Sociobiol. 2022, 76, 1–12. [CrossRef]
7. Yanagawa, A.; Shimizu, S. Termitens motståndskraft, Coptotermes formosanus Shiraki mot Metarhizium anisopliae på grund av grooming. BioControl 2007, 52, 75–85. [CrossRef]
8. Rosengaus, RB; Traniello, JF; Bulmer, MS Ekologi, beteende och utveckling av sjukdomsresistens hos termiter. In Biology of Termites: A Modern Synthesis; Bignell, DE, Roisin, Y., Lo, N., Eds.; Springer: London, Storbritannien, 2011; s. 165–192.
9. Zhukovskaya, M.; Yanagawa, A.; Forschler, BT Grooming beteende som en mekanism för försvar av insektssjukdomar. Insekter 2013, 4, 609–630. [CrossRef]
10. Milner, RJ Urval och karakterisering av stammar av Metarhizium anisopliae för kontroll av jordinsekter i Australien. I biologisk bekämpning av gräshoppor och gräshoppor; Lomer, CJ, Prior, C., Eds.; CAB International: Wallingford, Storbritannien, 1991; s. 200–207.
11. Traniello, JF; Leuthold, RH Beteende och ekologi för födosök hos termiter. I termiter: Evolution, socialitet, symbioser, ekologi; Abe, T., Bignell, DE, Higashi, M., Higashi, T., Abe, Y., Eds.; Springer: Dordrecht, Nederländerna, 2000; s. 141–168.
12. Vargo, E.; Husseneder, C. Biologi av underjordiska termiter: Insikter från molekylära studier av Reticulitermes och Coptotermes. Annu. Rev. Entomol. 2009, 54, 379–403. [CrossRef]
13. Abe, T. Utveckling av livstyper hos termiter. In Evolution and Coadaptation in Biotic Communities; Kowana, S., Connell, JH, Hidaka, T., Eds.; University of Tokyo Press: Tokyo, Japan, 1987; s. 128–148.
14. Shellman-Reeve, JS Spektrum av eusocialitet hos termiter. I The Evolution of Social Behaviour in Insects and Arachnids; Choe, JC, Crespi, BJ, Eds.; Cambridge University Press: Cambridge, Storbritannien, 1997; s. 52–93.
15. Griffiths, HM; Eggleton, P.; Hemming-Schroeder, N.; Swinfield, T.; Woon, JS; Allison, SD; Coomes, DA; Ashton, LA; Parr, CL Kolflöde och skogsdynamik: Ökad nedbrytning av död ved i tropisk regnskogs trädfallsluckor. Glob. Chang. Biol. 2001, 27, 1601–1613. [CrossRef]
16. Guo, C.; Tuo, B.; Ci, H.; Yan, ER; Cornelissen, JH Dynamisk återkoppling bland trädfunktionella egenskaper, termitpopulationer och omsättning av död ved. J. Ecol. 2021, 109, 578–1590. [CrossRef]
17. Zanne, AE; Flores-Moreno, H.; Powell, JR; Cornwell, WK; Dalling, JW; Austin, AT; Classen, AT; Eggleton, P.; Okada, KI; Parr, CL; et al. Termiters känslighet för temperatur påverkar den globala nedbrytningshastigheten för trä. Science 2022, 377, 1440–1444. [CrossRef] [PubMed]
18. Liu, L.; Wang, W.; Liu, Y.; Sun, P.; Lei, C.; Huang, Q. Inverkan av allogrooming beteende på individuell medfödd immunitet i den underjordiska termiten Reticulitermes chinensis (Isoptera: Rhinotermitidae). J. Insect Sci. 2019, 19, 6. [CrossRef] [PubMed]
19. Polizzi, JM; Forschler, BT Intra- och interspecifik agonism i Reticulitermes flavipes (Kollar) och R. virginicus (Banks) och effekter av arena och gruppstorlek i laboratorieanalyser. Insectes Sociaux 1998, 45, 43–49. [CrossRef]
20. Hamilton, C.; Lay, F.; Bulmer, MS Profylaktiska sekret från underjordiska termiter och externa svampdödande försvar. J. Insect Physiol. 2011, 57, 1259–1266. [CrossRef]
21. Rosengaus, RB; Jordan, C.; Lefebvre, ML; Traniello, JFA Patogenlarmbeteende i en termit: En ny form av kommunikation hos sociala insekter. Sci. Nat. 1999, 86, 544–548. [CrossRef]
22. Myles, TG Larm, aggregering och försvar av Reticulitermes flavipes som svar på ett naturligt förekommande isolat av Metarhizium anisopliae. Sociobiologi 2002, 40, 243–256.
23. Bulmer, MS; Franco, BA; Fields, EG Sociallarm för underjordiska termiter och hygieniska svar på svamppatogener. Insekter 2019, 10, 240. [CrossRef]
24. Denier, D.; Bulmer, MS Variation i underjordiska termiters känslighet för dödliga infektioner av lokala Metarhizium-jordisolat. Insectes Sociaux 2015, 62, 219–226. [CrossRef]
25. Bischoff, JF; Rehner, SA; Humber, RA En multilocus fylogeni av Metarhizium anisopliae härstamning. Mycologia 2018, 101, 512–530. [CrossRef]
26. Rosengaus, RB; Schultheis, KF; Yalonetskaya, A.; Bulmer, MS; DuComb, WS; Benson, RW; Thottam, JP; Godoy-Carter, V. Symbiont-härledda -1, 3-glukanaser i en social insekt: ömsesidighet bortom nutrition. Främre. Microbiol. 2014, 5, 607. [CrossRef] [PubMed]
27. Hamilton, C.; Bulmer, MS Molekylärt svampdödande försvar i underjordiska termiter: RNA-interferens avslöjar in vivo roller av terminus och GNBPs mot en naturligt påträffad patogen. Dev. Comp. Immunol. 2012, 36, 372–377. [CrossRef] [PubMed]
28. Bulmer, MS; Lay, F.; Hamilton, C. Adaptiv evolution i underjordiska termiter antifungala peptider. Insekt Mol. Biol. 2010, 19, 669–674. [CrossRef] [PubMed]
29. Bulmer, MS; Crozier, RH Duplicering och diversifierande urval bland termit-svamppeptider. Mol. Biol. Evol. 2004, 21, 2256–2264. [CrossRef]
30. Moran, MN; Aguero, CM; Eyer, PA; Vargo, EL Räddningsstrategi i en termit: Arbetare som exponeras för en svamppatogen återintegreras i kolonin. Främre. Ecol. Evol. 2022, 10, 840223. [CrossRef]
31. Davis, HE; Meconcelli, S.; Radek, R.; McMahon, DP Termiter formar sin kollektiva beteenderespons baserat på infektionsstadiet. Sci. Rep. 2018, 8, 14433. [CrossRef]
