Koordinera reglering av systemisk och njurtryptofanmetabolism av läkemedelstransportörerna OAT1 och OAT3

Jeffry C. Granados¹, Anne Richelle², Jahir M. Gutierrez¹, Patrick Zhang³, Xinlian Zhang⁴, Vibha Bhatnagar⁵, Nathan E. Lewis^1,2,6och Sanjay K. Nigam^2,7,*

^{Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com}

cistanche upplevelse

Hur organ känner av cirkulerande metaboliter är en nyckelfråga. Här visar vi att de multispecifika organiska anjontransportörerna av läkemedel, OAT1 (SLC22A6 eller NKT) och OAT3 (SLC22A8), spelar en roll i organsinne. Metabolomiska analyser av serumet från Oat1 och Oat3 knockoutmöss avslöjade förändringar i tryptofanderivat involverade i metabolism och signalering. Flera av dessa metaboliter härrör från tarmmikrobiomet och är inblandade som uremiska toxiner ikronisknjuresjukdom. Direkt interaktion med transportörerna stöddes med cellbaserade transportanalyser. För att bedöma effekten av förlusten av OAT1- eller OAT3-funktion på njuren, ett organ där dessa upptagstransportörer är mycket uttryckta, kartlades knockout-transkriptomiska data på en "metabolisk uppgift"-baserad beräkningsmodell som utvärderar över 150 cellulära funktioner. Trots förändringarna av tryptofanmetaboliter i båda knockouterna, ökade endast i Oat1 knockouten flera tryptofanrelaterade cellulära funktioner. Sålunda, berövad förmågan att ta kynurenin, kynurenat, antranilat och N-för-mylantranilat genom OAT1, svarar njuren genom att aktivera sina egna tryptofanrelaterade biosyntetiska vägar. Resultaten stödjer Remote Sensing and Signaling Theory, som beskriver hur "drog"-transportörer hjälper till att optimera nivåerna av metaboliter och signalmolekyler genom att underlätta överhörande av organ. Eftersom OAT1 och OAT3 hämmas av många läkemedel, antyder data potentialen för läkemedel-metabolitinteraktioner. Faktum är att behandling av människor med probenecid, en OAT-hämmare som används för att behandla gikt, förhöjda cirkulerande tryptofanmetaboliter. Dessutom, med tanke på att tillsynsmyndigheter har rekommenderat att läkemedel testas för OAT1- och OAT3-bindning eller transport, följer det att dessa metaboliter kan användas som endogena biomarkörer för att avgöra om läkemedelskandidater interagerar med OAT1 och/eller OAT3.

De organiska anjontransportörerna OAT1 (SLC22A6, ursprungligen NKT (1)) och OAT3 (SLC22A8, ursprungligen ROCT (2)) finns i den proximala tubulinjureoch choroid plexus i hjärnan och kontrollerar den fysiologiska fördelningen och elimineringen av många läkemedel och miljögifter samt endogena metaboliter såsom -ketoglutarat, prostaglandiner och urat (3, 4). Dessutom hjälper OAT till att reglera nivåerna av intagna naturliga produkter och tarmmikrobiom-härledda föreningar (t.ex. epikatekin, 3-indoxylsulfat, p-kresolsulfat) (5, 6).

OAT1 och OAT3, medlemmar av SLC22-familjen, är bland de mest kända multispecifika läkemedelstransportörerna. Denna grupp av läkemedelstransportörer inkluderar andra medlemmar av superfamiljerna SLC (solute carrier) och ABC (ATP-bindande kassett) (7, 8). Det finns omfattande litteratur om de farmaceutiska och toxikologiska rollerna för dessa transportörer, men de endogena funktionerna hos dessa evolutionärt konserverade proteiner, såväl som det regulatoriska nätverk där de deltar, börjar bara karakteriseras (9). Dessa multispecifika transportörer påverkar många aspekter av fysiologi och patofysiologi, troligen genom att fungera i kombination med mono- eller oligospecifika transportörer. Tre välkarakteriserade patofysiologiska exempel är rollerna för OAT1, OAT3, URAT1 och ABCG2 vid gikt (10), rollen för OAT1 och OAT3 i ackumuleringen av uremiska toxiner associerade med kroniskanjuresjukdom (CKD) (11, 12) och SLC22-familjen i akutnjureskada (13).

På grund av det stora utbudet av små organiska anjonföreningar som transporteras av OAT1 och OAT3, kan ett brett utbud av främlingsfientliga ämnen och endogena molekyler tänkas konkurrera om tillgång till och renal clearance av dessa OAT-transportörer (14, 15). Detta har viktiga konsekvenser eftersom många av metaboliterna, inklusive de som härrör från tarmmikrobiomet och transporteras av OAT1 och OAT3, reglerar endogen fysiologi och har kopplats till utvecklingen av kliniska störningar, såsom CKD, metabolt syndrom och diabetes (14, 16, 17). Till exempel har mängden CMPF (3-karboxi-4-metyl-5-propyl-2- furanpropansyra), ett substrat för OAT3, i cirkulationen relaterats till diabetes. CMPF är en furanfettsyrametabolit som finns i fiskoljor, vegetabiliska oljor, smör och andra livsmedel och stör bukspottkörtelns cellfunktion, vilket leder till glukosintolerans (18, 19). De potentiella konsekvenserna av konkurrens på transportörnivå mellan ett läkemedel och den transporterade endogena metaboliten inkluderar (a) förändrade intracellulära koncentrationer av metaboliter eftersom ett transporterat läkemedel blockerar metabolitens inträde i cellen; (b) förändrade serumkoncentrationer av läkemedlet, metaboliten eller båda, vilket leder till ökade halveringstider och/eller metabolitnivåer; och (c) förändrad systemisk metabolism som härrör från distala kaskadeffekter på flera metabola vägar som beror på OAT1 eller OAT3 eller båda.

Vi tillämpade ett systembiologiskt tillvägagångssätt som använde metabolomik och transkriptomiska data från Oat1 och Oat3knockout (KO) möss för att analysera de viktigaste metaboliska funktionerna som påverkas av OAT1 och OAT3. Serummetabolomiska data från Oat1 och Oat3 KO-möss representerade den inverkan som dessa transportörer har på endogen systemisk metabolism. Vi använde transkriptomiska data frånnjure, som är uttrycksplatsen för de kodande transportörgenerna, för att utvärdera aktiviteten hos hundratals metaboliska funktioner med hjälp av metabolisk uppgiftsanalys. Genom att göra det kunde vi komplettera en förståelse av extracellulära metabolitförändringar på grund av förlusten av OAT1- eller OAT3-transportören med en analys av påverkade intracellulära metaboliska vägar.

Tillsammans ger multiomics-metoden och systembiologianalysen som används här ett porträtt av de lokala och systemiska metabola och signalvägar som moduleras separat och gemensamt av OAT1 och OAT3. Vi visar att OAT1 inte bara reglerar tryptofanmetabolism systemiskt utan också spelar en nyckelroll i tryptofanmetaboliska vägar inuti vävnaden där det finns. Sålunda indikerar våra resultat att studier av nya läkemedelsenheter inte bara bör beakta effekterna av läkemedel-metabolitinteraktion (DMI) i serumet utan också utvärdera potentiella förändringar i cellulär metabolism på grund av förlust av metabolitinflöde genom konkurrens på transportörens nivå. Till stöd för den mänskliga relevansen av vårt arbete visar vi att många av de förändringar i serumnivåer av tryptofanmetaboliter som ses hos knockoutmössen också observeras hos människor efter administrering av probenecid, ett läkemedel som används för att behandla gikt som hämmar OAT1 och OAT3.

\

cistanche manliga fördelar

Resultat

Sammanfattning av det övergripande tillvägagångssättet

SLC22-genfamiljen (OAT, OCT, OCTN) kodar för transportörer som deltar i upptaget av många unika föreningar över flera vävnader, även om mycket av forskningen har fokuserat på en handfull medlemmar (SLC22A1, SLC22A2, SLC22A6, SLC22A8) som hanterar många vanliga droger (20, 21). Dessa gener är dock mycket konserverade, med ortologer i fluga, mask, fisk och sjöborre (22); detta innebär att de har viktiga fysiologiska roller utöver att hantera läkemedel. För att bestämma de endogena rollerna för OAT1 och OAT3 vid kontroll av metabolism på vävnadsnivå och organismnivå oberoende av deras välkända roller som läkemedels- och toxintransportörer, analyserade vi vävnadsspecifika transkriptomiska data och serummetabolomikdata (Fig. 1). Vi jämförde data från möss med genetiskt bristfälliga antingen Oat1 eller Oat3 och deras vildtypskontroller. Dessa datamängder har tidigare undersökts ur ett kemoinformatiskt perspektiv (23) och för att ge en bred översikt över påverkade vägar (24), men här lägger vi tonvikt på deras specifika roll i dispositionen av tryptofanmetaboliter. Eftersom dessa två transportörer finns injure, analyserade vinjuretranskriptomiska data med hjälp av Metabolic Task Analysis, en systembiologisk metod som grupperar gener enligt deras samordnade roller i biosyntesen av en begränsad uppsättning nyckelmetabolitintermediärer från olika metabolitingångar (se avsnittet Metoder för mer information). Vi stödde dessa studier inom vitro-transportanalyser; vi stödjer också den kliniska relevansen av våra resultat med human metabolomics data.

Kända egenskaper hos Oat1 KO och Oat3 KO-möss Nästan alla egenskaper hos möss med brist på Oat1 eller Oat3 liknar dem hos vildtypsmöss (25–27) (tabell 1). Knockoutmössen är livskraftiga med överlevnad jämförbar med den för vildtypsmöss. Dessutom uppvisar de inga uppenbara utvecklings- eller tillväxtavvikelser, och histologisk och fysiologisk undersökning av dessa olika knockouts (i åldern ~2–8 månader) avslöjade små eller inga skillnader från vildtyp, annat än Oat3 KO-mössen som hade ett något lägre blodtryck ( 28). En trend mot hepatisk lipiddeposition i Oat1 KO har också noterats men endast för mycket gamla möss (29).

Dessa transportör knockout-möss har också karakteriserats ur en farmakologisk och toxikologisk synvinkel (tabell 2). OAT1 och OAT3 spelar viktiga roller i hanteringen av olika läkemedel och gifter, både miljömässigt och endogent framställda (30–38). Båda knockoutmössen har förändrat svar på loop- och tiaziddiuretika på grund av dessa läkemedels oförmåga att komma åt nefronets lumen – en process som är beroende av OAT1- eller OAT3-förmedlat upptag i den proximala tubulicellen . Oat1 KO-djur är skyddade mot kvicksilverinducerad nefrotoxicitet på grund av brist pånjureupptag av kvicksilverkonjugat. Båda mössen ackumulerade uremiska toxiner i serumet och uppvisade minskad utsöndring av urinsyra. Ex vivo analys av vävnader från antingen Oat1 KO eller Oat3 KO möss visar minskat upptag av flera antivirala medel.

Vi har rapporterat att djur med 1-havrebrist kan ha minskat uttryck av OAT3 (39). Ett antal studier har dock visat att den funktionella påverkan av detta i bästa fall är blygsam i basaltillståndet. Till exempel Oat1 knockoutnjurarhar markant minskat PAH-transport, men ingen uppenbar transportförlust av OAT3-substratet, östronsulfat (26). Kemoinformatisk analys har identifierat uppsättningar av molekylära egenskaper som skiljer metaboliter som förändrats i Oat1 jämfört med möss med Oat3-brist (23). Dessutom embryonalnjureorgankulturer från båda linjerna av möss transporterade olika uppsättningar av antivirala medel (36–38). Det finns också skillnader i de typer av uremiska toxiner som finns i Oat1 kontra Oat3 KO (34).

Tryptofanmetabolismen förändras systemiskt hos Oat1 och Oat3 KO möss

Publicerade metabolomiska analyser av Oat1 KO och Oat3 KO möss tyder på fysiologiskt viktiga förändringar i hanteringen av endogena metaboliter och tarmmikrobiomer, inklusive vissa uremiska toxiner (34, 35). Här analyserade vi 731 metaboliter med känd identitet i serumet som samlats in från kontroll- och Oat1 KO-möss. På samma sätt detekterades 611 metaboliter med känd identitet i serumet från kontroll- och Oat3 KO-möss.

För Oat1 KO-möss fann vi att 63 metaboliter i aminosyrasupervägen (kompletterande tabell S1) ökade signifikant (p Mindre än eller lika med 0.05, 54 metaboliter, varav 12 metaboliter hade veckförändringar högre än 3) eller trendade mot signifikant ökade (0.05 Mindre än eller lika med p Mindre än eller lika med 0,10, nio metaboliter), vilket tyder på att de antingen är OAT1-substrat eller att deras serumkoncentrationer beror på på OAT1. För Oat3 KO-möss fann vi att tio metaboliter i Amino Acid Superpathway ökade signifikant, medan 11 trendade mot signifikant ökning (kompletterande tabell S2). Som ett komplement till p-värdena beräknade vi även Cohens d, som visade stora effektstorlekar (från 1,76 till 4,17) för tryptofanmetaboliter. I överensstämmelse med andra farmakologiska och fysiologiska data som erhållits från OAT1 och OAT3 knockoutmöss eller deras vävnader som indikerar viktiga funktionella skillnader (23, 36, 38), jämförelse av förändringar i serummetaboliter på Amino Acid Superpath-sättet mellan Oat1 KO (63 metaboliter) och Oat3 KO (21 metaboliter) möss avslöjade endast tio överlappande metaboliter i dessa undergrupper (kompletterande tabell S3).

Varje metabolit klassificerades med hjälp av Metabolons programvara i en av åtta supervägar (aminosyra, kolhydrat, kofaktorer och vitaminer, energi, lipider, nukleotid, peptid, främlingsfientliga läkemedel) och en av 90 undervägar. Av de 17 metaboliterna som signifikant ackumulerades i serumet från både Oat1 KO och Oat3 KO-djuren, tillhörde fyra Tryptophan Metabolism Subpathway, vilket indikerar att dessa två transportörer har en viktig delad roll i regleringen av systemisk tryptofanmetabolism (Fig. 2). . Oberoende av varandra var tryptofanmetabolism bland de mest berikade sub-vägarna för båda knockout-modellerna (Fig. 3). Sexton Figur 3. Tryptofanmetabolism är en av de mest förändrade vägarna hos båda knockoutmössen. En vulkanplot för Oat1 KO (n=5) ​​visar tryptofanmetaboliterna mot alla andra uppmätta metaboliter. B, tryptofanmetabolism är den näst mest berikade vägen för signifikant förhöjda metaboliter. C, vulkandiagram för Oat3 KO (n=3) som visar tryptofanmetaboliterna mot alla andra uppmätta metaboliter. D, tryptofanmetabolism är den mest berikade vägen för signifikant förhöjda metaboliter baserat på metabolonsubpathwayanalys. OAT1 och OAT3s roll i tryptofanmetabolism 4 J. Biol. Chem. (2021) 296 100575tryptofanmetaboliter mättes i serum från båda mössen, och 12 förändrades signifikant i minst en grupp. Oat1 KO-mössen hade 11 förhöjda metaboliter, inklusive en (N-formylanthranilat) som inte mättes i serumet för Oat3 KO (tabell 3). Analys av Oat3 KO visade att sex av de 16 metaboliterna var signifikant eller trendade mot signifikant förändrade. Vissa av dessa metaboliter, inklusive de som härrör från bakterier i tarmmikrofloran, är kända för att ha distala effekter på flera andra organ. Till exempel är 3-indoxylsulfat associerat med utvecklingen avnjuresjukdom och uremiskt syndrom (12, 40). Data indikerar att OAT1 och OAT3 arbetar tillsammans för att reglera systemisk tryptofanmetabolism, och ändå har de också specifika funktioner inom tryptofanmetabolismen genom att hantera distinkta uppsättningar av metaboliter som påverkar olika biokemiska reaktioner.

Utvärdering av läkemedel-metabolitinteraktioner hos människor som involverar ett OAT-hämmande läkemedel och tryptofanmetaboliter

Probenecid, ett läkemedel som används för att behandla gikt, administrerades till människor för att fastställa den kortsiktiga effekten av ett högaffinitets OAT-bindande läkemedel på nivåerna av cirkulerande metaboliter. Probenecid har tre väletablerade mål: SLC22A12 (URAT1, Rst), OAT1 och OAT3, som alla är närbesläktade gener i den organiska anjontransportörgruppen i SLC22-familjen av lösta ämnen. URAT1 är en urinsyratransportör placerad på det apikala membranet (sidan som vetter mot urinen) av den proximala tubuli, så OAT1 och OAT3, som är multispecifika och uttrycks på den blodvända sidan av den proximala tubuli, förväntas utöva en mer djupgående effekt på serummetabolomen. Jämförelser av metaboliska mätningar på blodet före och 5 timmar efter dosering visar stora förändringar av tryptofanmetabolismsubpathway (tabell 4). På grund av olika plattformar fanns det 22 metaboliter i denna underväg, varav 16 var signifikant förändrade. Fjorton metaboliter mättes över alla tre plattformarna och avslöjade flera likheter mellan knockoutmössen och probenecidbehandlade människor (Fig. 4). Till exempel observerades ökningar av 3-indoxylsulfat, kynurenin, N-acetylkynurenin och indollaktat i både knockout-mössgrupper och människor. Det fanns dock mer överlappning mellan Oat1 KO-musen och människor behandlade med probenecid. Alla åtta metaboliter som var signifikant förhöjda i Oat1 KO var också signifikant förhöjda hos läkemedelsbehandlade människor. Endast serotonin, som var förhöjt i Oat3 KO-musen, förändrades inte hos människor.

Möss behandlade med ett OAT-hämmande läkemedel visar förändringar i tryptofanmetabolismen

Som en mellanhand mellan våra knockout-musmodeller och människor behandlade vi vildtypsmöss med probenecid, ett väletablerat OAT-hämmande läkemedel. Denna läkemedelsbehandling ledde till en ökning av sex tryptofanmetaboliter, inklusive kynurenin, kynurenat och indolelaktat (fig. 5). Dessa metaboliter var förhöjda i ett eller båda knockout-experimenten och de probenecidbehandlade människorna.

Således stödjer de övergripande resultaten i probenecid-behandlade människor och möss, såväl som knockoutmöss, rollen av OAT1 och OAT3 för att reglera cirkulerande nivåer av tryptofanmetaboliter.

Tryptofanmetaboliter interagerar med human OAT1 och OAT3 in vitro transportanalyser För att bekräfta våra fynd utförde vi in ​​vitro transportanalyser med celler som överuttrycker human OAT1 och OAT3. Många av metaboliterna i denna subpathway har testats mot dessa transportörer (tabell 3), men andra metaboliter förblir outforskade. Transportanalyser för indolättiksyra (ILA) visade att ILA interagerar med OAT1 och OAT3 (IC50=229.1 ± 74,56 μM, 74,49 ± 23,29 μM respektive) (Fig. 6). Vidare interagerade serotonin, som var unikt förhöjt i Oat3 KO, endast med OAT3 in vitro (IC50=288.2 ± 167.0 μM) (data visas inte). IC50-värdena integrerades sedan med kända Km-värden för att beräkna hämmande konstanter. Den hämmande konstanten (Ki) för ILA med OAT1 var 119,3 μM.

Knockout-njuremetabolomisk uppgiftsanalys indikerar en avgörande roll för OAT1 i proximal tubulusavkänning av tryptofanmetaboliter

Vi använde microarray-data frånnjurarav Oat1 KO, Oat3 KO och deras vildtypskontroller för att identifiera hur transportörändringarna påverkarnjuremetaboliska funktioner. För detta ändamål använde vi en systembiologimetod (metabolisk uppgiftsanalys (41) från CellFie-verktyget) som förutsäger hur förändringar i genuttryck påverkar en fördefinierad lista med 175 metaboliska uppgifter (kompletterande tabell S4), som täcker de allmänna metaboliska systemen i en cell (energi, nukleotid, kolhydrater, aminosyra, lipid, vitamin och kofaktor och glykanmetabolism). Såsom beskrivs i Metoder tar beräkningen av en "metabolisk uppgiftspoäng" transkriptomiska data och tillskriver en genaktivitetspoäng för varje gen. En genomskalemodell av metabolism används för att sammanställa en lista över reaktioner som krävs för att utföra var och en av de 175 metaboliska uppgifterna. Således kan transkriptomisk analys användas direkt för att kvantitativt jämföra den relativa aktiviteten för varje metabolisk funktion under de olika förhållandena (t.ex. vildtyp kontra Oat1 KO, vildtyp kontra Oat3 KO).

Vi fann att tryptofanrelaterade metaboliska uppgifter var vanliga bland de med stor skillnad mellan havre KO och vildtypsmöss. Vad som dock var oväntat var attnjuretryptofanrelaterade metaboliska uppgifter var beroende av OAT1 men inte OAT3. Hos Oat1 KO-möss hade syntesen av kynurenin, kynurenat, antranilat och N-för-mylantranilat från tryptofan ökat poängvärden för metabola uppgifter, medan var och en av dessa uppgifter hade en minskad metabolisk uppgiftspoäng i Oat3 KO. Detta överensstämmer med serummetabolomiska analyser, som visar signifikanta höjningar av nivåerna av kynurenin, kynurenat, antranilat och N-för-mylantranilat i Oat1 KO.

Diskussion

OAT1 och OAT3 är erkända för sin roll i elimineringen av hundratals läkemedel (42). In vivo och in vitro studier av OAT1 och OAT3 har dock visat att dessa proteiner är involverade i transporten av många endogena och tarmmikroberhärledda metaboliter, uremiska toxiner, signalmolekyler, intagna näringsämnen, industriella toxiner och naturliga produkter (9, 24, 26, 34, 35, 43). Detta verkar också vara fallet för andra multispecifika läkemedelstransportörer, vilket tyder på att deras bidrag till endogen metabolism är mycket underskattat (44).

Dessa multispecifika läkemedelstransportörer uttrycks i hög grad i nästan alla vävnader och spelar en särskilt kritisk roll i figur 4. Tryptofanmetaboliter var förhöjda i havre-knockoutmöss och probenecidbehandlade människor. Ett Venn-diagram av signifikant förändrade tryptofanmetaboliter i knockoutmöss och människor behandlade med probenecid. Av de 14 metaboliterna som är gemensamma för alla tre plattformarna var 12 signifikant förhöjda i minst ett av experimenten. Fyra metaboliter var signifikant förhöjda i varje experiment. B, kemiska strukturer av metaboliter förhöjda i varje experiment: 3-indoxylsulfat, indolelaktat, kynurenin och N-acetylkynurenin. C, boxplots för varje metabolit i de probenecidbehandlade människorna (n=20), Oat1 KO-möss (n=5) och Oat3 KO-möss (n=3). Linjer i boxplots indikerar medianen. OAT1 och OAT3s roll i tryptofanmetabolism. Biol. Chem. (2021) 296 100575 7epitel- och endotelbarriärer mellan blod och andra kroppsvätskor/kompartment (t.ex. blod-hjärnbarriär, blod-näthinnabarriär, blod-CSF-barriär, näs-hjärnbarriär, blod-urinbarriär). Som regulatorer av systemisk metabolism, såväl som lokal metabolism i deras uttrycksvävnad, kan den typ av studier och analyser som vi har beskrivit här om de utförs för alla "drog"-transportörer radikalt förändra vår fysiologiska syn på dessa evolutionärt konserverade proteiner.

Den kliniska farmaceutiska betydelsen av dessa transportörer är enorm, och tillsynsmyndigheter har rekommenderat screening av nya läkemedelsenheter mot minst sju multispecifika läkemedelstransportörer (OAT1, OAT3, OATP1B1, OATP1B3, OCT2, P-GP, BCRP) för att begränsa möjligheten av läkemedels- läkemedelsinteraktioner (DDI) – fall där två eller flera läkemedel konkurrerar om tillgång till samma transportör. Transportörmedierade DDI kan förändra koncentrationen av läkemedlen i blodet, vilket potentiellt kan leda till negativa kliniska effekter (45). Med tanke på antalet substrat för OAT1 och OAT3 kan ett liknande fenomen förekomma mellan läkemedel och metaboliter i cirkulation. Dessa DMI har också potential att påverka vävnadsfunktionen, eftersom metaboliter och signalmolekyler kanske inte kan komma in i cellen och utöva sina effekter på normal cellfysiologi. Den föreliggande studien stöder denna möjlighet.

I våra metabolomiska analyser av serumet från Oat1 och Oat3 knockout möss, fanns det markanta förändringar i tryptofan-relaterade metaboliter. Ökningen av systemiska nivåer av metaboliter, på grund av frånvaron av dessa transportörer i blodets gränssnitt mednjure, ökade risken för minskad intracellulär koncentration injureproximala tubuliceller. Hur kan dessa celler i sin tur svara? Vi använde transkriptomikbaserad metabolisk uppgiftsanalys för att ta itu med denna fråga. Vi identifierade flera lokala (njure) tryptofanrelaterade metaboliska uppgifter som påverkas av frånvaron av transportörerna. Dessa förändringar i metaboliska uppgiftspoäng orsakas av kompenserande ökningar i uttrycket av de metaboliska uppgiftsassocierade generna i samband med OAT1-brist. Medan många metabola vägar undersöktes av både metabolomik och transkriptomikbaserad metabolisk uppgiftsanalys, gav användningen av båda tillvägagångssätten oss unika insikter om hur vissa läkemedelstransportörer deltar i kommunikationen mellan vävnaden och den extracellulära miljön. Således, medan tryptofanmetaboliter reglerades av båda transportörerna på systemisk nivå, var tryptofanrelaterade metaboliska uppgifter i njuren främst beroende av OAT1.

Resultaten indikerar att den proximala tubuli avnjure, där OATs finns, är inte bara en ledning för renal eliminering av tryptofanmetaboliter; den känner av tryptofanmetaboliter och reagerar på förändringar i deras intracellulära överflöd. Sammantaget stödde data uppfattningen att OAT1 spelar en nyckelroll inte bara för att rensa tryptofanrelaterade metaboliter från cirkulationen genom att främja deras upptag avnjuremen också att denna transportör reglerar intracellulär metabolism, särskilt tryptofanmetabolism.

Detta stöder uppfattningen att OAT1-förmedlad transport av kynurenin, kynurenat, antranilat och N-för-mylantranilat är viktigt förnjurefunktion (fig. 8). Dessa fyra metaboliter tillhör kynureninundervägen för tryptofannedbrytning, och förutom kynurenat är de involverade i produktionen av cellulär energi genom syntesen av NAD plus (46). Det är således möjligt att bristen på OAT1 leder till försämrad cellulär metabolism som åtminstone delvis kan återvinnas genom produktionen av dessa metaboliter.

Nästan allt intaget tryptofan metaboliseras i tre huvudsakliga undervägar: kynurenin, serotonin och indol (47, 48). Utöver sin roll i att producera NAD plus producerar kynurenin-subpathwayen metaboliter som har en mängd olika funktioner i både friska och sjuka tillstånd (46, 49). Serotoninvägen producerar signalsubstansen serotonin, som har en roll i många fysiologiska processer, framför allt som en regulator av CNS-funktionen (50). Indolsubvägen, som förmedlas av tarmmikrobiomet, producerar signalmolekyler som deltar i värd-mikrobiell kommunikation (51). Systemiskt modulerar OAT1 och OAT3 biotillgängligheten av tryptofanmetaboliter från var och en av de tre undervägarna, även om de flesta av metaboliterna kommer från kynurenin- och indolundervägarna.

Med tanke på den myriad av signaleringsroller som de förhöjda metaboliterna har, finns det potential för OAT1 och OAT3 att påverka många aspekter av fysiologi. Till exempel aktiverar kynurenat GPR35, ett läkemedelsmål, och en GPCR involverad i inflammatoriska svar och hjärt-kärlsjukdomar (52). Många av de signifikant förändrade tryptofanmetaboliterna är också etablerade eller förmodade ligander av arylkolvätereceptorn (AhR) (tabell 3), en transkriptionell regulator som uttrycks i nästan alla vävnader som svarar på xenobiotika (53).

De metabolomiska studierna av de två knockoutmössen visade att en nyckelfunktion hos OAT1 och OAT3 är att reglera systemiska nivåer av tryptofanmetaboliter. Således skulle ett läkemedel som riktar sig till OAT1 och OAT3 förväntas ha en liknande inverkan på metabolomen. Som förutspått stöddes translationspotentialen hos våra knockoutmöss som modeller av DMIs starkt av resultaten från människor som behandlats med probenecid, ett OAT-hämmande läkemedel som används över hela världen för att behandla gikt. Flera av tryptofanmetaboliterna var förhöjda i både serum från människor och knockoutmöss.

Det finns således potential för att föreningarna förhöjda i studier på människor och gnagare kan användas som biomarkörer för nya läkemedelsenheter som kan hämma OAT1 och OAT3. Medan knockout-musmodellerna (som har normal livslängd) och de probenecidbehandlade människorna var friska, är några av de förhöjda metaboliterna kända uremiska toxiner som är förhöjda i serumet hos människor som lider av kronisk njursvikt och förknippas med negativa utfall (54 55). Överlappningen av metaboliter som är inblandade i aspekter av CKD och våra studier antydde att OAT kan spela en nyckelroll i manifestationer av CKD eller dess progression, även om det också är möjligt att metabolitkoncentrationerna kan öka på grund av förlust av sekret som ett resultat av vävnad skada (56, 57). CKD kan också leda till multiorgansvikt, delvis på grund av ackumulering av uremiska toxiner, och detta kan delvis bero på upptag i andra vävnader via SLC och ABC läkemedelstransportörer (12, 58).

Tryptofanmetabolismvägen kräver en samordnad funktion av flera organ. Tryptofan absorberas av tarmen, modifieras av levern eller andra organ, och metaboliterna transporteras slutligen avnjure, delvis genom funktionen av OAT1 och OAT3. Konventionellt ses detta helt enkelt som en elimineringsväg. Våra resultat, som indikerar att celler injurereagera på frånvaron av dessa metaboliter och signalmolekyler genom att förbereda sig för att producera dem, föreslår annat. Även om deras specifika roll injureproximal tubuli är dåligt definierad, är det tydligt att många av de mellanprodukter som produceras är signalsubstanser och har en viktig roll i CNS-funktionen (46, 49, 59, 60). Förutom interorgankommunikation återspeglar tryptofanmetabolismen också interorganismkommunikation mellan värden och tarmmikrobiomet. Serumet från bakteriefria möss har faktiskt minskade nivåer av 3-indoxylsulfat, indolpropionat och serotonin (61). Dessutom har tidigare studier visat att inom njur-OAT1-positiva celler, 3-indoxylsulfat fungerar i cellsignalering genom att aktivera AhR och reglera sin egen utsöndring genom OAT1 (62). Våra fynd att tarmhärledda metaboliter ökade i serumet från både Oat1 KO och Oat3 KO-mössen – tillsammans med vår demonstration att vissa är ligander in vitro, ger ytterligare stöd för vikten av dessa transportörer för att reglera kommunikationen mellan värden och kommensal organismer. Sammantaget överensstämmer våra resultat med Remote Sensing and Signaling Theory, som föreslår att läkemedelstransportörer och läkemedelsmetaboliserande enzymer deltar i interorgan- och interorganismkommunikation genom transport och modifiering av små molekyler för att upprätthålla homeostas (63, 64). Därför är det viktigt att förstå omfånget av endogena fysiologiska funktioner hos läkemedelstransportörer systemiskt och lokalt.

Med förbättrade metabolomiska data identifierade vi metaboliter påverkade av frånvaron av OAT1 och OAT3 i gnagarmodeller och metaboliter påverkade av hämningen av OAT1 och OAT3 hos människor som behandlats med OAT-hämmande läkemedel. Vår grupp har tidigare använt metaboliska rekonstruktionsnätverk för att förutsäga metabolisk funktion och rapporterat flera delade och unika vägar som regleras av OAT1 och OAT3 (43, 65). Emellertid var dessa studier begränsade av tidiga versioner av rekonstruktionsverktyg och mycket lite metabolomikdata. Här, med hjälp av ett annat tillvägagångssätt, lade Metabolic Task Analysis en mycket större tonvikt på rollen av OAT1 i intracellulär tryptofanmetabolism avnjure. Vårt tillvägagångssätt kan användas för att undersöka de endogena funktionerna hos andra SLC- och ABC-familjemedlemmar och bygga separata men överlappande nätverk för alla dessa läkemedelstransportörer, som inte bara finns i möss utan också i sin helhet och maskar (20, 66). Sådana representationer kommer också att underlätta förståelsen av den fulla omfattningen av DMI för läkemedel som interagerar med OAT1, OAT3 eller båda, vilket sannolikt går utöver enkel konkurrens på transportörsnivå.

Experimentella procedurer

Djur

Alla experimentella protokoll som involverar användning av djur godkändes av UCSD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alla djur hanterades i enlighet med de institutionella riktlinjerna för användning av levande djur för forskning. Vuxna WT-, Oat1 KO- och Oat3 KO-hanar inhystes separat under en 12-h ljus-mörkercykel och fick ad libitum tillgång till mat och vatten. Dessa djur har beskrivits i tidigare publikationer (26, 27). Probenecid-behandlade möss administrerades en daglig intraperitoneal injektion av 200 mg/kg probenecid eller PBS under 3 dagar före avlivning. Den slutliga injektionen administrerades 2 timmar före avlivning. Datauppsättningarna som används för denna analys har också delvis beskrivits (23, 24). Oat1 KO-datauppsättningen har delvis studerats ur ett kemoinformatiskt perspektiv, men detaljerad väganalys utfördes inte (23). Oat3 KO-datauppsättningen analyserades om och endast två grupper jämfördes (24).

Mänskliga studier med probenecid

Alla experimentella protokoll granskades och godkändes av den institutionella granskningsnämnden och följer Helsingforsdeklarationen om etiska principer. Helblodsprover togs från 20 individer (14 honor, sex män). Medelåldern var 30,85 ± 10,98, och medel-BMI var 24,18 ± 3,52. Deltagare som inte tog några mediciner och var på vegetarisk kost under studiens varaktighet. En oral dos på 1 gram probenecid administrerades och efter 5 timmar samlades helblod upp igen. Varje prov hölls fryst vid -80 grader tills metabolomisk analys.

Metabolomics Mänskliga serumprover förvarades omedelbart vid –80 grader och skickades på torris till Metabolon Inc. Musserumprover samlades in och analyserades, som tidigare beskrivits (23, 24). För att kort sammanfatta, för varje prov, utfördes målinriktad metabolomisk profilering av Metabolon Inc. MicroLab STAR-systemet från Hamilton Company användes för att förbereda varje prov, och flera återvinningsstandarder lades till för kvalitetskontroll. Serumet fälldes ut med metanol och omrördes med Glen Mills GenoGrinder 2000 för att avlägsna proteiner från serumet och frigöra molekyler bundna till dessa proteiner. Den resulterande lösningen separerades i fyra mindre prover. Två analyserades med omvänd fas (RP) ultraperformance vätskekromatografi (UPLC) masspektrometri (MS) med positiv jonmodelektrosprayjonisering (ESI). Ett prov analyserades med RP/UPLC-MS/MS med negativ jonmod ESI. Ett prov analyserades med HILIC/UPLC-MS/MS. Det organiska lösningsmedlet avlägsnades genom att placera varje prov på en TurboVap (Zymark).

Statistik

För både human- och musprover normaliserades råvärdena till volym, log-transformerades och saknade värden ersattes med det lägsta observerade värdet för varje förening. I de humana serumproverna bestämdes statistisk signifikans med ANCOVA-kontraster som inkluderar BMI och ålder. För musserumprover bestämdes signifikansen med Welchs tvåprovs t-test med metaboliter som uppnådde statistisk signifikans (p Mindre än eller lika med 0.05), såväl som de som närmade sig signifikans ( 0.05 Mindre än eller lika med p Mindre än eller lika med 0,10) som ingår i efterföljande analyser. Anrikning bestämdes med hjälp av ekvation 1, där k är antalet signifikant förändrade metaboliter i en underväg, m är antalet metaboliter i en underväg, n är antalet signifikant förändrade metaboliter i den totala datamängden och N är antalet av uppmätta metaboliter i den totala datamängden.

Metabolisk uppgiftsanalys

Vi använde den metaboliska uppgiftsanalysen, som implementerad i CellFie-modulen i GenePattern, för att kvantifieranjurensmetaboliska funktioner och påverkan av OAT-transportörändringar från genuttrycksdata (41) (dvs mikroarraydata från njurarna av Oat1 KO, Oat3 KO och deras vildtypskontroller). Denna analys förutsäger aktiviteten hos en kurerad samling av hundratals uppgifter som täcker sju huvudmetaboliska aktiviteter i en cell (energigenerering, nukleotid, kolhydrat, aminosyra, lipid, vitamin och kofaktor och glykanmetabolism) direkt från transkriptomiska data genom att använda genom- skalamodeller av mänsklig metabolism. Mer specifikt förlitar sig beräkningen av den relativa aktiviteten för en metabolisk uppgift (dvs. den metaboliska uppgiftspoängen) först på förbearbetningen av tillgängliga transkriptomiska data och tilldelningen av en genaktivitetspoäng för varje gen (67). Genomskalemodellen för mänsklig metabolism används vidare för att identifiera listan över reaktioner som krävs för att utföra varje metabolisk uppgift och, genom att göra det, för att identifiera listan över gener som kan bidra till förvärvet av en metabolisk funktion baserat på GPR-regler (dvs. , regler för genproteinreaktion). Därför beräknas den metaboliska uppgiftspoängen som den genomsnittliga aktivitetspoängen för alla gener som bidrar till en metabolisk funktion. Genom att göra det kan transkriptomiska data direkt användas för att kvantifiera den relativa aktiviteten för varje metabolisk funktion i ett specifikt tillstånd.

In vitro transportanalyser

Mänskligt embryonaltnjure(HEK)-293-celler som stabilt överuttrycker humant OAT1 och OAT3 (Solvo Biotechnology) odlades till sammanflöde i Dulbeccos Modified Eagle'sMedium (Invitrogen) kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum och 1 procent penicillin/streptomycin och bibehölls i 5 procent CO2 vid 37 C. De OAT1--uttryckande cellerna selekterades i närvaro av blasticidin, och de OAT3--uttryckande cellerna selekterades i närvaro av puromycin. Båda cellinjerna testade negativa för Mycoplasma-kontamination. Före funktionella analyser ströks cellerna ut på 96-brunnsplattor, inkuberades i 24 timmar och kompletterades med media. Konkurrenskraftiga upptagsexperiment utfördes genom att inkubera celler i buffertlösning med en fixerad koncentration på 10 μM 6-karboxifluorescein och en serieutspädd koncentration av det föreslagna substratet med början på 2 mM. Bufferten avlägsnades efter en 10- min inkubation vid rumstemperatur och cellerna sköljdes med DPBS tre gånger. FL-fluorescensen bedömdes sedan med användning av en FL-fluorescerande plattläsare. IC50-värden bestämdes med hjälp av GraphPad Prism 8.

Fluorescerande intensitetsvärden normaliserades så att det lägsta värdet sattes till 0 procent och det högsta värdet sattes till 100 procent. Efter normalisering anpassades data till en icke-linjär modell och IC50 bestämdes med hjälp av ekvation 2.

Ki beräknades sedan för varje metabolit med hjälp av Cheng-Prusoff-ekvationen (Ekvation 3), med Km för hOAT1 HEK293-celler härledda från tidigare experiment (68).

Datatillgänglighet

Alla relevanta metabolomiska data finns i artikeln och tilläggsmaterialet. Transkriptomisk data är tillgänglig på begäran från snigam@health.ucsd.edu. hypotes, övervakade projektet, designade experimenten och skrev och redigerade artikeln.

Finansiering och ytterligare information—Detta arbete stöddes av ett anslag från National Institutes of Health (NIH) till SKN från National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) (R01GM132938). Stöd till JCG kommer från utbildningsbidraget som beviljas av National Institute of Biomedical Imaging and bioengineering (NIBIB) (T32EB009380) och ett tillägg till R01GM132938. Detta arbete finansierades delvis av generös finansiering från NIGMS till NEL (R35GM119850), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) till NEL (UH2AI153029), ett LIFA-stipendium till AR och ett stipendium till JMG från Mexikos regering ( CONACYT) och University of California Institute för Mexiko och USA (UC-MEXUS). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis NIH:s officiella åsikter. Vissa figurer genererades med hjälp av Biorender. Den här artikeln är tillägnad minnet av Vibha Bhatnagar, MD, MPH.

Intressekonflikt—Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter med innehållet i denna artikel.

Förkortningar—De använda förkortningarna är: AhR, arylkolvätereceptor; CKD, kronisknjuresjukdom; DMI, läkemedel-metabolitinteraktion; ESI, elektrosprayjonisering; HEK, mänskligt embryonaltnjure; ILA, indolättiksyra; KO, knockout; RP/UPLC/MS, omvänd fas ultrapresterande vätskekromatografi – masspektrometri.

Cistanche tubulosa förebygger njursjukdom, klicka här för att få provet

Från 1 Institutionen för bioteknik, 2 Institutionen för pediatrik, 3 Institutionen för biologi, 4 Avdelningen för biostatistik och bioinformatik, Institutionen för familjemedicin och folkhälsa, 5 Institutionen för familje- och förebyggande medicin, 6NovoNordisk Foundation Center for Biosustainability vid UC San Diego, och 7Department University of California SanDiego, La Jolla, Kalifornien, USARedigerad

av Mike Shipston

Referenser

1. LopezNieto, CE, You, GF, Bush, KT, Barros, EJG, Beier, DR och Nigam, SK (1997) Molecular cloning and characterization of NKT, en genprodukt relaterad till den organiska katjontransportörfamiljen som nästan uteslutande är uttryckt injure. J. Biol. Chem. 272, 6471-6478

2. Brady, KP, Dushkin, H., Fornzler, D., Koike, T., Magner, F., Her, H., Gullans, S., Segre, GV, Green, RM, och Beier, DR (1999) ) En ny förmodad transportör kartlägger osteoskleros (oc)-mutationen och uttrycks inte i OC-mutantmusen. Genomics 56, 254–261

3. Riedmaier, AE, Nies, AT, Schaeffeler, E., och Schwab, M. (2012) Organiska anjontransportörer och deras implikationer i farmakoterapi.Pharmacol. Upps. 64, 421–449

4. Ahn, SY och Bhatnagar, V. (2008) Uppdatering om den molekylära fysiologin hos organiska anjontransportörer. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 17, 499–505

5. Nigam, SK (2018) SLC22-transportörfamiljen: Ett paradigm för påverkan av läkemedelstransportörer på metabola vägar, signalering och sjukdom. Annu. Rev. Pharmacol. 58, 663-687

6. Lowenstein, J., och Grantham, JJ (2016) Återfödelsen av intresse för njurtubulär funktion. Am. J. Physiol. Renal 310, F1351–F1355

7. Govindarajan, R. och Sparreboom, A. (2016) Drug transporters: Advances and opportunities. Clin. Pharmacol. Ther. 100, 398–403

8. Du, GF och Morris, ME (2014) Förord. I Drug Transporters Molecular Characterization and Role in Drug Disposition, 2nd Edition. Wiley Ser Drug Disc, Hoboken, NJ. Xix

9. Nigam, SK, Wu, W., Bush, KT, Hoenig, MP, Blantz, RC och Bhatnagar, V. (2015) Hantering av läkemedel, metaboliter och uremiska toxiner avnjureproximala tubuli läkemedelstransportörer. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 10, 2039–2049

10. Bhatnagar, V., Richard, EL, Wu, W., Nievergelt, CM, Lipkowitz, MS, Jeff, J., Maihofer, AX och Nigam, SK (2016) Analys av ABCG2 och andra urattransportörer i urinsyra homeostas i kroniskanjuresjukdom: Möjlig roll för fjärranalys och signalering. Clin.NjureJ. 9, 444–453 Roll av OAT1 och OAT3 i tryptofanmetabolism

12 J. Biol. Chem. (2021) 296 100575

11. Nigam, SK och Bhatnagar, V. (2018) Urinsyratransportörernas systembiologi: rollen för fjärranalys och signalering. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 27, 305-313

12. Nigam, SK och Bush, KT (2019) Uremiskt syndrom av kronisknjuresjukdom: Förändrad fjärranalys och signalering. Nat. Rev. Nephrol. 15, 301–316

13. Saito, H. (2010) Patofysiologisk reglering av renal SLC22A-organisationstransportörer vid akutnjureskada: Farmakologiska och toxikologiska konsekvenser. Pharmacol. Terapeut. 125, 79–91

14. Lepist, EI och Ray, AS (2017) Bortom läkemedelsinteraktioner: effekter av transportörhämning på antibiotika, näringsämnen och toxiner. Expertutlåtande. Drug Metab. Toxicol. 13, 1075-1087

15. Duan, P., Li, SS, Ai, N., Hu, LQ, Welsh, WJ och You, GF (2012) Potenta inhibitorer av humana organiska anjontransportörer 1 och 3 från kliniska läkemedelsbibliotek: upptäckt och molekylär karakterisering . Mol. Pharmaceut. 9, 3340–3346

16. Evers, R., Piquette-Miller, M., Polli, JW, Russel, FGM, Sprowl, JA, Tohyama, K., Ware, JA, de Wildt, SN, Xie, W., Brouwer, KLR, och Consortium, IT (2018) Sjukdomsrelaterade förändringar hos läkemedelstransportörer kan påverka läkemedels farmakokinetik och/eller toxicitet: En vitbok från International Transporter Consortium. Clin. Pharmacol. Ther.104, 900–915

17. Masereeuw, R., Mutsaers, HA, Toyohara, T., Abe, T., Jhawar, S., Sweet, DH och Lowenstein, J. (2014) Thenjureoch avlägsnande av uremiskt toxin: Glomerulus eller tubuli? Semin. Nephrol. 34, 191-208

18. Liu, Y., Prentice, KJ, Eversley, JA, Hu, C., Batchuluun, B., Leavey, K., Hansen, JB, Wei, DW, Cox, B., Dai, FHF, Jia, WP , och Wheeler, MB (2016) Snabb höjning av CMPF kan fungera som en tipppunkt vid diabetesutveckling. Cell Rep. 14, 2889-2900

19. Prentice, KJ, Luu, L., Allister, EM, Liu, Y., Jun, LS, Sloop, KW, Hardy, AB, Wei, L., Jia, WP, Fantus, IG, Sweet, DH, Sweeney , G., Retnakaran, R., Dai, FF och Wheeler, MB (2014) Furanfettsyrametaboliten CMPF är förhöjd vid diabetes och inducerar betacellsdysfunktion. Cell Metab. 19, 653-666

20. Engelhart, DC, Granados, JC, Shi, D., Saier, MH, Jr., Baker, ME, Jr., Abagyan, R. och Nigam, SK (2020) Systembiologianalys avslöjar åtta SLC22-transportörundergrupper, inklusive OATs, OCTs och OCTNs.Int. J. Mol. Sci. 21, 1791