Den skyddande effekten av echinacoside på diabetisk nefropati

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Skyddande effekter av Echinacoside på njurfunktion, njurvävnad och mesangial cellskada hos råttor med diabetesnefropati

HE Qin, LIU Fan, WANG Hongli, LI Jianping, DUAN Jun

Abstrakt:

Mål Att utforska den skyddande effekten avechinakosid(ECH) om njurdysfunktion, histopatologi och mesangial cellskada idiabetikernefropati(DN)-råttor och dess mekanism. Metoder Sextio SD-råttor delades slumpmässigt in i kontrollgrupp, modellgrupp, ECH (echinakosid) grupp (höga, medelhöga och låga doser ECH (echinakosid),100,50, 20 mg·kg'·d') och losartankaliumgrupp(losartankalium,16 mg·kg'·d'),10 råttor i varje grupp. Modellgruppen, ECH (echinakosid)-gruppen och losartan-kaliumgruppen matades med en diet med hög fetthalt och hög sockerhalt och intraperitonealt injicerade streptozotocin (40 mg·kg") för att etablera DN-råttmodeller. Efter 2 veckors behandling, kroppsvikt, vattenintag dygnet runt , och urinvolymen hos råttor registrerades. Innehållet av fasteblodsocker, serumkreatinin, ureakväve, urinmikroprotein, hyaluronsyra(HA), vävnadsmetalloproteinashämmare-1(TIMP-1) och laminin (LN) bestämdes. HE-färgning och TUNEL-färgning utfördes för att observera patologiska förändringar i njurvävnad. RT-PCR utfördes för att detektera uttryck av B-cellslymfom(Bcl-2),Bcl2-associerat X-protein(Bax), Caspase-3 mRNA. Wester Blot utfördes för att bestämma expressionsnivåer av vaskulär celladhesionsmolekyl-1(VCAM-1), Transforming growth factor (TGF-), - Slätmuskelaktin( -SMA). Resultat Jämfört med kontrollgruppen minskade modellgruppens kroppsvikt signifikant (P< 0.05),="" water="" intake,="" urine="" volume,="" fasting="" blood="" glucose,="" urine="" microalbumin,="" urea="" nitrogen,="" creatinine,="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" were="" significantly="" increased=""><0.05). bax,="" caspase-3="" mrna,="" and="" expression="" of="" vcam-1,="" tgf-β="" and="" α-sma="" protein="" were="" significantly="">< 0.05),="" expression="" of="" bcl-2="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="">< 0.05).="" compared="" with="" the="" model="" group,="" bodyweight="" of="" rats="" was="" significantly="" increased="" in="" the="" medium-dose="" ech="">echinakosid) grupp, högdos ECH (echinakosid) grupp och losartan kalium grupp (P<0.05), water="" intake,="" urine="" volume,="" fasting="" blood="" glucose,="" urine="" microalbumin,="" urea="" nitrogen,="" creatinine,="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" were="" significantly=""><0.05).bax,caspase-3 mrna,="" expression="" of="" vcam-1,tgf-β="" and="" α-sma="" protein="" were="" significantly="">< 0.05);="" and="" expression="" of="" bcl-2="" mrna="" was="" significantly=""><0.05).he and="" tunel="" staining="" showed="" that="" pathological="" changes="" in="" renal="" tissue="" were="" significantly="" decreased.="" conclusion="" medium="" and="" high="" doses="" of="" ech="">echinakosid)kan skydda njurvävnadsskada och förbättra njurfunktionen hos DN-råttor genom att hämma proteinuttryck av TGF- och VCAM-1 och hämma njurinterstitiell fibros och njurcellsapoptos.

Nyckelord:Cistanches herba;Echinacoside; diabetikernefropati; renal interstitiell fibros; apoptos; råttor

cistanche echinacoside behandla diabetisk nefropati

Introduktion

Diabetiker nefropati(Diabetisk nefropati, DN) är en vanligdiabetikermikrovaskulär komplikation, som inte bara kan orsaka njurskador utan även påverka andra organ. Den kliniska patologiska egenskapen hos njurtubulointerstitiell fibros är den komplicerade patogenesen avdiabetikernefropati. Tidigare studier [P2-5 tror att sjukdomen främst beror på hyperglykemi idiabetikerpatienter, vilket orsakar njurhemodynamiska förändringar och onormal metabolism. De kliniska manifestationerna är främst proteinuri och minskad glomerulär filtrationshastighet. För närvarande,diabetikernefropatiPatienterna saknar fortfarande effektiva kliniska behandlingsmetoder och att hitta nya effektiva läkemedel är nyckeln till behandlingen avdiabetikernefropati.

echinakosid(ECH) är ett av extrakten av Cistanche Tubulosa. Det har effekten att stärka njurarna och stärka yang." Moderna farmakologiska studier har visat att echinakosid har antioxidanter, anti-apoptotisk, antiinflammatorisk och förbättrat blodflöde Mikrocirkulation och andra farmakologiska effekter kan också reglera kroppens glukosmetabolism och förbättra glukos Under senare år har studier visat att echinakosid kan hämma signalvägen för transformationstillväxtfaktor (Transforming growth factor, TGF-) och hämmadiabetikernefropati. Interstitiell fibros av råttnjurar skyddar råttnjurvävnad. Det finns dock få rapporter i litteraturen om behandling avdiabetikernefropatimedechinakosidoch dess specifika mekanism för att skyddadiabetikernefropatihos råttor är inte klart. Därför undersökte denna studie ytterligare effekten avechinakosidom njurfibros och njurcellsapoptos idiabetikernefropatiråttor och dess möjliga mekanism är avsedd att ge en teoretisk grund för den kliniska tillämpningen avechinakosid.

Fördel med cistanche: behandla njursjukdom och förbättra njurfunktionen

1 Material och metoder

1.1 Djur:

60 SD-råttor, hanar, SPF-klass, 8 veckor gamla, kroppsvikt 240~280 g, tillhandahållna av Beijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd., djurlicensnummer: SCXK (Beijing) 2015-0001, djurkvalitet är kvalificerad Certifikatnummer: 11400700106210, uppvuxen i djurcentrets laboratorium på sjukhuset, håller rumstemperaturen konstant på 25 grader, simulerar dag och natt, ändrar ljusförhållandena en gång var 12:e timme, och djuren är fria att äta och dricka .

1.2 Läkemedel och reagenser:

Echinacoside, China Institute for Food and Drug Control, batchnummer: 111670-201706; Losartan kalium, Hangzhou Merck Pharmaceutical Co., Ltd., National Medicine Standard: H20030654; Streptozotocin, American Sigma Company, batchnummer: 040103; Urin Proteininnehåll detektionskit, Ningbo Meikang Biotechnology Co., Ltd., batchnummer: 20170612; TUNEL-detektionskit, Amicage Technology Co., Ltd., batchnummer: 20180406; RNA-extraktionssats, omvänd transkriptionssats, Shanghai Hengfei Bio-Technology Co., Ltd., batchnummer: 20180705, 20180904; Serumhyaluronsyra (HA), vävnadsmetalloproteinashämmare-1 (TIMP-1) och laminin (laminin, LN) detektionskit, Shanghai Yuanmu Biotechnology Co., Ltd., batchnumren är 20180612, 20180624, 20180706.

1.3 Apparatur

7600 typ automatisk biokemisk analysator, Japan HITACHI företag; bärbar blodsockermätare, Beijing Yicheng Bioelectronics Technology Co, Ltd; B X60 optiskt mikroskop, Japan OLYMPUS företag; SN-695B radioimmunoanalysanalysator, företaget Shanghai Rihuan Instrument Shenbei Co., Ltd.

1.4 Gruppering, modellreplikering och administrationsmetod

Efter en veckas förmatning delades 60 råttor slumpmässigt in i kontrollgruppen, modellgruppen,echinakosidhög-, medel- och lågdosgrupper och Losartan-kaliumgruppen, med 10 råttor i varje grupp. Modellgruppen,echinakosidgruppen och losartan kaliumgruppen behandlades med diet med hög fetthalt och hög sockerhalt kombinerad med lågdos streptozotocin för att induceradiabetikernefropatihos råttor. Innan modellen replikerades fastade råttorna med vatten i 12 timmar. Råttorna i kontrollgruppen matades med vanligt foder och de andra grupperna matades med foder med hög fetthalt och hög sockerhalt. Efter 4 veckors kontinuerlig matning gavs råttorna i kontrollgruppen en enda intraperitoneal injektion av en lika stor volym citratbuffert, och de återstående grupperna gavs en enda intraperitoneal injektion av streptozotocin Bacteriocin (40 mg·kg') för att replikera råttmodell avdiabetikernefropati. 72 timmar efter att råttorna injicerades med streptozotocin, var blodsockret högre än eller lika med 16,7 mmol·L, och urinproteinutsöndringshastigheten på 24 timmar efter 3 veckor var högre än för kontrollgruppen. Det kvantitativa urinproteinet på 24 timmar var större än 50 procent före modellreplikeringen, vilket tyder på att modellen framgångsrikt replikerats. Fyra veckor efter injektionen av streptozotocin, låg-, medel- och högdosgruppernaechinakosidgavs 20 mg·kg', 50 mg·kg och 100 mg·kg'echinakosid(enligt 5mL·kg hos råttor). kg"' kroppsvikt löses i 37 graders normala koksaltlösningar), råttor i Losartan-kaliumgruppen administreras intragastriskt med Losartan-kalium 16mg·kg', och modellgruppen och kontrollgruppen administreras intragastriskt med lika volymer normal saltlösning en gång om dagen Gavage fortsatte i 2 veckor.

1.5 Provtagning

Efter den sista administreringen fastade råttorna utan mat och vatten. Råttornas 24 timmars dricksvatten registrerades och de 24 timmarna med urin samlades upp. Tidigt på morgonen den andra dagen vägdes råttorna. Efter uppsamling av urin, intraperitoneal injektion av 2 procent pentobarbitalnatriumlösning 2mL·kg~ för anestesi, separation av abdominalt aortablod från råtta, centrifugering (3 500 r·min²', 15 min), ta serumet och placera i kylskåp- Förvara tillfälligt vid 20 grader ; separera råttnjurvävnad och dela i två delar, en del fixeras i 4 procent paraformaldehyd, den andra delen bereds som 10 procent homogenat och placeras i -80 graders kylskåp för senare användning.

1.6 Bestämning av glukos- och lipidmetabolism hos råttor

Serumet från varje grupp av råttor togs, fastande blodsocker mättes med en blodsockermätare och triglycerid-, kolesterol- och lågdensitetslipoproteinnivåer detekterades med en automatisk biokemisk analysator.

1.7 24 h urinprotein, njurfunktion och njurfibrosrelaterade indikatorer

24-timmesurinen från råttor i varje grupp samlades in, och 24-timmarnas urinmikroproteininnehåll bestämdes med radioimmunanalys. Operationen utfördes i strikt enlighet med instruktionerna. Serumet från varje grupp av råttor samlades in, och den automatiska biokemiska analysatorn användes för att detektera nivåerna av blodkreatinin och ureakväve, som är relaterade till njurfunktionen, nivån av serum TIMP-1 detekterades med ELISA, och nivåerna av HA och LN detekterades genom radioimmunoanalys. Operationen utfördes i strikt enlighet med instruktionerna.

1.8 HE-färgning för att observera patologiska förändringar av njurvävnad och TNUEL-färgning för att observera apoptos av njurvävnadsceller

De fixerade njurvävnaderna från varje grupp togs, inbäddades rutinmässigt i paraffin och snittades. En sektion används för HE-färgning för att observera de morfologiska förändringarna av njurtubuli, glomeruli och njurinterstitium under ett ljusmikroskop; den andra sektionen används för TUNEL-färgning, arbetar enligt satsens instruktioner och observerar antalet och positiviteten hos njurvävnadsceller under mikroskopet. Antalet celler beräknas som förhållandet mellan antalet positiva celler och antalet njurvävnad celler, vilket är graden av apoptos.

1.9 RT-PCR-metod för att detektera uttrycket av apoptosrelaterade gener i njurvävnad

Ta råttnjurvävnadshomogenat, extrahera totalt RNA med Trizol-metoden, bestäm koncentrationen med ultraviolett spektrofotometer och syntetisera cDNA med omvänd transkriptionskit.

1.10 Western Blot-metod för att bestämma uttrycket av njurvävnad VCAM-1, TGF- och -SMA-protein.

Ta cirka 50 mg av råttnjurevävnadshomogenat, lös upp det med cellysat som innehåller proteashämmare och extrahera totalt protein med cellysat, med hjälp av BCA-metoden för proteinkvantifiering. Det totala proteinprovet extraherat med 50 μmol·L" överfördes till ett nitrocellulosamembran genom polyakrylamidgelelektrofores och förseglades med 5 procent skummjölk, och den primära antikroppen (1∶1000) respektive -aktinproteinet tillsattes. Antikropp (1: 300), inkubera över natten vid 4 grader. Tillsätt slutligen den sekundära antikroppen och inkubera i 2 timmar vid 37 grader, övervakat av elektrokemiluminescens. Använd Photoshop bildanalysprogram för att analysera gråvärdet av proteinband.

1.11 Statistiska bearbetningsmetoder

SPSS 17.0-programvaran användes för att analysera de erhållna data, och mätdata som uppfyller normalfördelningen uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse ((x±s), och enkelfaktorvariansanalys används för att jämför skillnaderna mellan grupper. Parvis jämförelse mellan grupper använder SNK- Med q-test, P<0.05 indicates="" that="" the="" difference="" is="" statistically="">

2 resultat

2.1 Effekterna av echinakosid på kroppsmassa, dricksvatten och urinproduktion hos råttor med diabetisk nefropati visas i tabell 1.

Tabell 1 Effekter av ECH på kroppsvikt, vattenintag och urinvolym hos DN-råttor（x ± s,n=10）

Jämfört med kontrollgruppen reducerades kroppsvikten hos råttorna i modellgruppen signifikant och 24-timmarnas dricksvatten- och urinproduktion ökade signifikant. Skillnaden var statistiskt signifikant (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" doses="" of="">echinakosidKroppsvikten hos råttorna i Losartan-kaliumgruppen ökade signifikant, och 24-timmansdrickandet och urinproduktionen minskade signifikant, och skillnaden var statistiskt signifikant (P<>

2.2 Effekterna av echinakosid på glukos- och lipidmetabolism hos råttor med diabetesnefropati visas i tabell 2.

Tabell 2 Effekter av ECH på glukos- och lipidmetabolism i DN-råttor

Notera:Jämfört med kontrollgruppen,' P<0.05; compared="" with="" the="" model="" group,=""><>

Jämfört med kontrollgruppen ökade det fastande blodsockret hos modellgruppen råttor signifikant, och skillnaden var statistiskt signifikant (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" increased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05) ). Jämfört med modellgruppen, fastande blodsocker hos råttor i mitten och hög dos grupper avechinakosidoch losartan-kaliumgruppen reducerades signifikant, och skillnaden var statistiskt signifikant (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" decreased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05).

2.3 Effekterna av echinakosid på 24-timmes urinprotein och njurfunktion hos råttor med diabetesnefropati visas i tabell 3.

Jämfört med kontrollgruppen ökade nivåerna av urinmikroalbumin, ureakväve och kreatinin i modellgruppen signifikant, och skillnaderna var statistiskt signifikanta (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" dose="">echinakosidgrupper Nivåerna av mikroalbumin i urinen, ureakväve och kreatinin hos råttor i och losartan-kaliumgruppen minskade signifikant, och skillnaderna var statistiskt signifikanta (P<>

Tabell 3 Effekter av echinakosid på 24 timmars urinprotein och njurfunktion hos råttor med diabetisk nefropati (x±s, n=10)

2.4 Effekterna av echinakosid på njurfibros hos råttor med diabetesnefropati visas i tabell 4.

Jämfört med kontrollgruppen ökade serumnivåerna av HA, TIMP-1 och LN i modellgruppen signifikant, och skillnaderna var statistiskt signifikanta (P<0.05); the="" levels="" of="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" of="" rats="" in="" the="" sartan="" potassium="" group="" were="" significantly="" reduced,="" and="" the="" differences="" were="" statistically="" significant=""><>

Tabell 4 Effekter av ECH på njurfibros hos DN-råttor

2.5 HE-färgning för att observera de patologiska förändringarna av njurvävnad hos råttor med diabetesnefropati (se figur 1).

HE-färgning av råttor i kontrollgruppen visade att strukturen av njurvävnadsceller var intakt, och inga uppenbara patologiska förändringar sågs. HE-färgningen av råttor i modellgruppen och lågdosenechinakosidgruppen visade: glomerulus svällde och förstorade i storlek, njurtubulära epitelceller svällde eller föll av, njurinterstitium åtföljdes av inflammatorisk cellinfiltration och viss mesangial hyperplasi och interstitiell proliferation var också synlig. Kvalitativ fibros.Echinacosidemedel- och högdosgrupper och Losartan-kaliumgrupper. Färgningen visade att de patologiska förändringarna av njurvävnaden reducerades signifikant, åtföljda av en liten mängd inflammatorisk cellinfiltration, och graden av mesangial hyperplasi och interstitiell fibros var också lättare än den för modellgruppen.

Figur 1 Patologiska förändringar av njurvävnad hos råttor i varje grupp

2.6 Effekten av echinakosid på apoptos av njurvävnad hos råttor med diabetesnefropati visas i figur 2.

TUNEL-färgning visade att jämfört med kontrollgruppen ökade apoptosfrekvensen hos råttor i modellgruppen signifikant och skillnaden var statistiskt signifikant (P＜0.05); jämfört med modellgruppen, mellan- och högdoserna avechinakosidoch Corsa Den apoptotiska frekvensen av råttor i kaliumgruppen reducerades signifikant och skillnaden var statistiskt signifikant (P<>

Figur 2 Apoptos av njurvävnadsceller i DN-råttor

2.7 Effekten av echinakosid på uttrycket av apoptosrelaterade gener i njurvävnad hos råttor med diabetesnefropati visas i tabell 6.

RT-PCR-resultat visade att jämfört med kontrollgruppen var uttrycket av Bax- och Caspase-3-mRNA i modellgruppen signifikant uppreglerat, och uttrycket av Bcl-2-mRNA var signifikant nedreglerat , och skillnaden var statistiskt signifikant (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group="" in="" comparison,="" the="" expression="" of="" bax="" and="" caspase-3="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="" in="" the="" middle="" and="" high-dose="">echinakosidgrupper och Losartan-kaliumgruppen, och uttrycket av Bcl-2-mRNA var signifikant uppreglerat, och skillnaderna var statistiskt signifikanta (P<>

Tabell 6 Effekter av ECH på uttrycket av den apoptosrelaterade genen i njurvävnad hos DN-råttor

2.8 Effekterna avechinakosidpå uttrycket av VCAM-1-, TGF- och -SMA-proteiner idiabetikernefropatiråttor visas i figur 3 och tabell 7. Jämfört med kontrollgruppen var uttrycket av VCAM-1-, TGF- och -SMA-protein i modellgruppen signifikant uppreglerat, och skillnaden var statistiskt signifikant (P ＜0.05); Uttrycken av VCAM-1-, TGF- och -SMA-proteiner hos råttor i dosgruppen och Losartan-kaliumgruppen var signifikant nedreglerade och skillnaderna var statistiskt signifikanta (P<>

KLICKA HÄR FÖR ATT DELA Ⅱ