Hur ökar Cistanche echinacoside androgen genom endotelceller?

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrakt.

Echinacoside (ECH) är en naturlig förening med en endotelberoende vasodilaterande effekt. Kväveoxid (NO) är ett viktigt vasorelaxant som frisätts från endotelceller. För att undersöka den molekylära mekanismen för ECH-inducerad NO-produktion i endotelceller, undersökte denna studie involveringen av androgenreceptor (AR) och fosfatidylinositol 3-kinas (PI3K)/proteinkinas B (Akt)-vägen i fosforyleringen av endotelial kväveoxidsyntas (eNOS) i humana navelvenendotelceller (HUVEC). Med användning av den fluorescerande sonden DAF-FM visade sig produktionen av NO vara signifikant ökad, och eNOS fosforylerades vid Ser1177 på ett koncentrationsberoende sätt under 0.01-10 µM ECH-behandling i HUVEC. Dessutom minskade NO-produktion och eNOS-fosforylering inducerad av ECH när de förbehandlades med AR-antagonisten nilutamid, eller när de transfekterades med AR små interfererande RNA. Vidare upphävdes den ECH-inducerade fosforyleringen av Akt vid Ser473 av 5 µM wortmannin (en PI3K-hämmare). Dessa data indikerade att ECH stimulerade NO-produktion via den AR-beroende aktiveringen av eNOS i HUVECs och att PI3K/Akt-vägen kan vara involverad i eNOS-fosforylering inducerad av ECH.

Cistanche deserticola har många effekter, klicka här för att veta mer

Introduktion

Cistanche Hoffman. Et Link är en flerårig parasitört av ett släkte från familjen Orobanchaceae. HerbaCistanche, stammen avCistanche deserticolaYC MA ochCistanche tubulosa(Schenk). Cistanche är en stärkande ört som hade använts för att behandlanjurbrist, impotens, sjuklig leukorré och senil förstoppning (1), vilket kan bero på dess androgenliknande eller könshormonreglerande effekt (2). Echinakosid (ECH; C35H46O20; molekylvikt, 786,73; Fig. 1), är en av de fenyletanoidglykosider (PhG) som isolerats från Herbas stjälkarCistancheoch uppvisar flera biologiska egenskaper, inklusive antioxidant, antiaging, antiinflammatorisk, leverskyddande och neuroprotektiva effekter (3). Moderna farmakologiska undersökningar har visat att olika beståndsdelar av HerbaCistancheinklusive ECH,akteosid, kankanos, lankesisk sida F, ochcistanosidF, uppvisar vasorelaxerande aktivitet (4).

Endotelet är en kritisk regulator av kärlsystemet, och kväveoxid (NO) är en viktig avslappnande faktor som frisätts avendotelceller.Genom att diffundera in i glatta muskelceller aktiverar NO guanylatcyklas, ökar nivåerna av cykliskt guanosinmonofosfat (cGMP) och aktiverar sedan cGMP-beroende proteinkinaser (PKGs) för att främja glattmuskelavslappning (5). Det har tidigare visats att ECH vid 350-400 µM direkt verkar på vaskulär glatt muskulatur och hämmar hypoxiinducerad proliferation i glatta muskelceller i lungartären hos råtta (6), medan 30-300 µM ECH orsakade akut vasorelaxation i endotel- intakta ringar på ett koncentrationsberoende sätt, och ökad cGMP-produktion i corpus cavernosum glatt muskulatur i aortaringarna kontrakterade av fenylefrin (7). Genom att öppna NO-cGMP-PKG-BKCa-kanalerna i glatta muskelceller, undertryckte 100 eller 300 µM ECH noradrenalin-inducerad kontraktion i lungartärerna hos råttor, särskilt i endotel-blottade ringar (8).Endotelcellerär nyckelregulatorer av kardiovaskulär funktion och i flera fall har det visat sig att den endotelberoende avslappningen berodde på en överförbar substans, såsom NO, som frigjordes från endotelet (9). Den uppströms molekylära mekanismen för ECH-inducerad NO-produktion i vaskuläraendotelcellerkräver ytterligare utredning. I det vaskulära endotelet medieras NO-generering främst av endotelial NO-syntas (eNOS). Flera grupper har visat att fosfatidylinositol 3-kinas (PI3K)-vägen aktiverar serin-treonin-proteinkinas B (Akt), som orsakar direkt eNOS-fosforylering vid serin 1177 (Ser1177) (10). Androgenreceptorn (AR) är en medlem av kärnreceptorunderfamiljen s3, som kanoniskt modifierar genuttryck. AR-lokalisering till kaveolerna i cellmembranet är involverad i den icke-genomiska regleringen av endotelcellsfunktion eller genuttryck genom att trigga c-Src/PI3K/Akt-kaskaden, vilket i slutändan resulterar i eNOS-fosforylering och NO-produktion (11). I mänsklig aortaendotelceller, har testosteron rapporterats aktivera PI3K/Akt-signalering och snabbt inducera NO-produktion på grund av den direkta interaktionen mellan AR och p85-subenheten av PI3K på det kardiovaskulära systemet (12). Det rapporterades att ECH förvärrar hormonbristrelaterade symtom och utövar sina androgenliknande effekter på grund av kompetitiv bindning till AR istället för testosteron (2). Därför antog den aktuella studien att PI3K/Akt-vägen kan vara involverad i NO-produktion genom AR-beroende eNOS-fosforylering inducerad av ECH. Syftet med denna studie var att utvärdera följande effekter av ECH: i) Induktion av NO-produktion och eNOS-fosforylering; ii) involvering av AR i eNOS-fosforylering och iii) aktivering av PI3K/Akt-vägen i humana navelvenendotelceller (HUVECs), en välkänd experimentell modell för att studera regleringen av endotelcellsfunktioner och angiogenes (13).

Material och metoder

Kemikalier och reagens. ECH (renhet, 92,5 procent) erhölls från National Drug Reference Standards i National Institute for the Food and Drug Control. Antikroppar mot p-Akt (Ser473; kat. nr. ab8805), Akt (kat. nr. ab81283), p-eNOS (Ser1177; kat. nr. ab184154) och eNOS (kat. nr. ab76198) köptes från Abcam . Inhibitorerna av nilutamid och ICI 182780 erhölls från Sigma-Aldrich; Merck KGaA. L-NAME köptes från Adamas-Beta, Ltd., och wortmannin köptes från Pribolab.

Cellodling och läkemedelsbehandling.

HUVECs erhölls från ScienCell Research Laboratories Inc. och odlades iendotelcellmedium (ECM; ScienCell Research Laboratories) med 5 procent (v/v) fetalt bovint serum (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.) och 1 procent endotelcelltillväxttillskott (ECGS) vid 37˚C (5 procent CO2 och 95 procent luftfuktighet) (14). När de nådde sammanflödet digererades cellerna med trypsin och ströks ut i ECM med 1 procent FBS och 1 procent ECGS. För alla experiment ströks HUVECs ut i en koncentration av 1x104/ml och odlades tills de nådde sammanflödet. Före behandling med ECH eller andra stimulatorer inkuberades cellerna i fenolrödfri ECM utan FBS och EKG i 6 timmar för att inducera tillväxtstopp. I de hämmande experimenten förinkuberades HUVEC med olika antagonister eller inhibitorer, inklusive 10 µM nilutamid, 10 µM ICI 182780, 0,5 mM L-NAME eller 5 µM wortmannin, under 30 min, med eller utan ECH vid 37˚C. I alla grupper, inklusive kontrollen, användes DMSO som lösningsmedel i lika koncentrationer av 0,001 procent.

Mätning av intracellulär NO-produktion.

Relativa förändringar i cytosolisk NO-koncentration i HUVEC övervakades med den fluorescerande NO-sonden DAF-FM (Cayman Chemical Company), som tidigare rapporterats (12). Kortfattat laddades cellerna med 5 µM DAF-FM-diacetat under 20 minuter vid 37˚C i en svart mikrotiterplatta och sköljdes flera gånger med PBS (pH 7,4). Fluorescensen bestämdes vid excitations- och emissionsvåglängder på 495 respektive 515 nm, med användning av en fluorescerande mikroplattläsare (Biotek Synergy H4; BioTek Instruments, Inc.) och ett kompakt inverterat mikroskop (Nikon eclipse Ts2R; Nikon Corporation).

Western blot-analys.

Som tidigare rapporterats (15), tvättades sammanflytande monolager av celler två gånger i iskall PBS och lyserades med RIPA-buffert (P0013D; Beyotime Institute of Biotechnology). Proteinkoncentrationen i supernatanten mättes med bicinchoninsyraanalysmetoden (16). Därefter laddades 30 µg protein per bana, separerades med användning av 10 procent polyakrylamidgeler och överfördes till polyvinylidendifluoridmembran. Membranen blockerades med 5 procent skummjölk i 1 timme vid 25˚C. Efter inkubation med monoklonala antikroppar mot Akt (1:1,000 spädning), p-Akt (1:500 spädning), eNOS (1:2,000 spädning) eller p-eNOS (1) :1,000 spädning) vid 4˚C över natten, tvättades membranen med TBST (innehållande 0,1 procent Tween-20) 4 gånger under ~15 minuter per tvätt vid 25˚C. Därefter inkuberades membranen med pepparrotsperoxidaskonjugerade sekundära antikroppar (1:5,000 spädning; antimusantikropp, kat.nr A0216, eller anti-kaninantikropp, kat.nr A0208, Beyotime Institute of Biotechnology) i 1 timme vid 25˚C, och detekteras med hjälp av ett förbättrat kemiluminescenskit (kat.nr 32209, Thermo Fisher Scientific, Inc.). Bandintensiteter kvantifierades med hjälp av Image J gelanalysprogramvara, version 1.8.0_112 (National Institutes of Health).

Liten störande (si) RNA-beredning och transfektion.

De långa dubbelsträngade RNA:n syntetiserades av mål-mRNA:n för AR och östrogenreceptorn (ER) med sekvenser som visas i tabell I. Villkoren för siRNA knockdown involverade transfektering av HUVEC:er vid 70 procent konfluens bibehållen i icke-antimikrobiell odlingsmedium i 60 mm kollagenbelagda odlingsskålar. Transfektion av 5 nM AR-siRNA eller 10 nM ER-siRNA med Lipofectamine 3000-reagens (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) utfördes separat, enligt tillverkarens protokoll. Transfektionseffektiviteten utvärderades genom kvantitativ PCR-analys av omvänd transkription (RT-qPCR), som tidigare rapporterats (17). Termocyklingsbetingelserna var som följer: 10 min vid 95°C; 40 cykler av 95˚C i 5 sek och 60˚C i 1 min, och en smältkurva vid 95˚C i 15 sek, 60˚C i 1 min och 95˚C i 15 sek; tre oberoende biologiska replikat utfördes för varje prov. De efterföljande experimenten utfördes 48 timmar efter transfektion. Primerpar utformades med Primer Premier v5.0-programvara (PREMIER Biosoft) med följande sekvenser: AR framåt, 5'-GGTTACACCAAAGGGCTAGAA-3' och bakåt, 5'-GACTTGTAGAGAGACAGGGTAGA-3'; ER framåt, 5'-CCAGTACCAATGACAAGGGAAG-3' och bakåt, 5'-TCACAGGACCAGACTCCATAA-3'; och GAPDH framåt, 5'-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA-3' och bakåt, 5'-GGGTGGAATCATATTGGAACATGT-3

Statistisk analys.

Alla data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse. Statistiska jämförelser mellan grupper utfördes med Kruskal-Wallis-testet eller tvåvägs ANOVA med Tukeys post hoc-test för flera jämförelser. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Resultat

ECH inducerar NO-produktion och eNOS-fosforylering.

Som visas i Fig. 2A och B ökade 1 µM ECH signifikant intracellulär NO-produktion i HUVEC jämfört med de negativa kontrollcellerna, medan den stimulerande effekten av ECH försvagades till kontrollnivån genom förbehandling med L-NAME. För att erhålla den optimala koncentrationen testades eNOS-fosforylering 60 min efter behandling med ECH vid koncentrationer av 0, 0.01, 0. 1, 1 och 10 µM. Resultaten avslöjade att ECH vid koncentrationer på 0,01-10 µM signifikant kan inducera eNOS-fosforylering vid Ser 1177 på ett koncentrationsberoende sätt, med den maximala eNOS-fosforyleringen observerad vid 10 µM ECH-induktion (Fig. 2C och D). Vidare undersöktes eNOS-fosforylering vid Ser1177 med western blot-analys vid 0, 5, 15, 30, 60 och 120 minuter efter inkubation med 1 µM ECH. Det observerades att eNOS-fosforylering snabbt utlöstes av ECH vid 5 minuter och fortsatte att öka till 30 minuters inkubation (Fig. 2E och F). Därefter, trots ECH-behandling, förblev den relativa magnituden av eNOS-fosforylering stabil från 30 minuter och framåt; därför påverkade ECH inte totalt eNOS-uttryck (Fig. 2C och E).

AR förmedlar ECH-inducerad NO-produktion och eNOS-fosforylering.

RT-qPCR-analysen visade att de störande effekterna av AR-siRNA-1 och ER-siRNA-2 var de mest framgångsrika när det gällde att hämma uttrycket av AR och ER i HUVECs i föreliggande studie (Fig. 3) ). Därefter applicerades en antagonist för AR-inhibition-of-function-analys och siRNA för AR-förlust-of-function-analys för att utvärdera involveringen av AR i ECH-inducerad eNOS-aktivering och NO-produktion. Som visas i Fig. 4A ökade 1 µM ECH signifikant NO-produktionen i HUVEC (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibition="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

ECH aktiverar PI3K/Akt-vägen.

I den aktuella studien testades Akt-fosforylering vid Ser473 60 min efter ECH-inkubation vid koncentrationer av 0, 0.01, 0.1 1 och 10 µM. Resultaten visade att ECH (0.01-10 µM) signifikant kan inducera Akt-fosforylering. De relativa expressionsnivåerna av p-Akt nådde sin topp vid 1 och 10 µM ECH-behandling (Fig. 5A och B). Dessutom undersöktes Akt-fosforylering med western blot-analys vid 0, 5, 15, 30, 60 och 120 minuter efter tillsats av 1 µM ECH till HUVEC-kulturer. Som visas i Fig. 5C och D ökade ECH snabbt Akt-fosforyleringen efter 5 minuters inkubation, och den maximala proteinnivån av p-Akt observerades vid 60 minuter. Däremot påverkade ECH inte det totala Akt-uttrycket (Fig. 5A och C). Dessutom, för att undersöka den potentiella effekten av PI3K-vägen på eNOS-fosforylering, förbehandlades HUVECs med PI3K-hämmaren wortmannin före ECH-applikation. Wortmannin visade sig minska ECH-inducerad NO-produktion till baslinjenivåer (Fig. 5E). Ett liknande fenomen observerades med fluorescensmikroskopi vid undersökning av ECH-inducerad DAF-FM-fluorescens (Fig. 5F). Dessutom kan wortmannin ha förmågan att avskaffa snabb eNOS-fosforylering i HUVEC (Fig. 5G och H). De tidigare nämnda resultaten tyder på att ECH kan aktivera eNOS-fosforylering och NO-produktion via PI3K/Akt-vägen.

Diskussion

ECH är en naturlig förening isolerad från HerbaCistanche, med olika farmakologiska egenskaper. Det har tidigare visat sig att ECH utövade en endotelberoende vaskulär avslappningseffekt genom att öppna NO-cGMP-PKG-BKChannels i glatta muskelceller i blodkärlen (7,8). De nuvarande resultaten ger bevis för att ECH utövade AR-beroende aktivering av eNOS för att inducera NO-produktion med involvering av PI3K/Akt-signalvägen i vaskuläraendotelceller.

Som det innersta lagret av kärlväggen kan endotelet snabbt känna av och reagera på förändringar i blodflödet, vilket i sin tur resulterar i signalöverföring till de underliggande glatta muskelcellerna för att reglera vaskulär tonus (18). Det har rapporterats allmänt att flera endotelhärledda vasodilaterande föreningar existerar, med den mest prototypiska substansen

är NO, bildad från den endoteliala isoformen av eNOS, vilket resulterar i fosforylering (19). Under normala förhållanden förblir eNOS inaktivt när det är bundet till caveolin och aktiveras med följande följd av händelser iendotelceller: i) eNOS dissocierar från caveolin-1 och associerar med Ca2 plus /CaM; ii) värmechockprotein (HSP)90 främjar eNOS.

Vidare har ett ökande antal studier visat att AR uttrycks iendotelcelleri ett antal mänskliga vävnader, vilket antyder en potentiell roll för androgener och deras analoger, som verkar genom AR-medierade processer, i moduleringen av human endotelcellshomeostas (21). I den icke-klassiska PI3K/Akt-vägen kan AR aktivera PI3K genom att direkt interagera med PI3K-regulatorisk subenhet p85 (22). Den aktuella studien visade att en AR-antagonist eller AR-siRNA minskade NO-produktionen och eNOS-fosforyleringen inducerad av ECH i HUVEC. Det har tidigare rapporterats att östrogener inducerar eNOS-fosforylering och stimulerar NO-produktion via klassisk ER-aktivering i endotelceller (23), och administrering av ECH ökar signifikant uttrycket av ER i livmodern (24). Men i den aktuella studien var effekten av AR mer framträdande jämfört med den av ER på ECH-inducerad eNOS-aktivering och NO-produktion. Dessutom observerades det att ECH orsakade akut NO-produktion inom några minuter via AR-involverad eNOS-aktivering i HUVECs, vilket överensstämmer med den icke-genomiska naturen hos svaret i endotelceller. AR är associerat med ställningsproteiner, inklusive HSP90, HSP70 och kinas Src, i cytoplasman, och det kan transporteras till membranet från AR-komplexet inom 5 minuter efter testosteronbehandling (23). Baserat på "målfiske"-strategin identifierades HSP90 som det PhGs-kopplade målet, vilket indikerade att ECH kan underlätta dissociationen av AR från ställningsproteinerna (25). En annan studie föreslog att ECH i hypotalamus kan kombineras med AR-fickan vid aminosyrorna Met-894 och Val-713 och hämma transporten av cytoplasmatisk AR till kärnan (26). Emellertid kräver den underliggande mekanismen genom vilken ECH förmedlar cytoplasmisk AR-translokation till membranet ytterligare undersökning. Därför krävs ytterligare forskning för att belysa mekanismen genom vilken ECH uppnår AR-beroende eNOS-aktivering och hur det kan associeras med bindning till HSP90 i vaskulära endotelceller.

PI3K/Akt-vägen är en av de viktigaste signaleringskaskaderna, vars aktivering induceras genom att producera fosfatidylinositol-3,4,5-trisfosfat för att binda den N-terminala pleckstrinhomologidomänen i Ser/ Thr kinas Akt. Detta underlättar Akt-rekryteringen till plasmamembranet (27). PI3K/Akt-vägen kan spela en viktig roll i kontrollen av NO-beroende relaxation inducerad av ECH. Den aktuella studien avslöjade att ECH-inducerad NO-produktion minskade signifikant när cellerna inkuberades med PI3K-hämmaren wortmannin. En tidigare rapport visade att 15 mg/kg ECH aktiverade PI3K/Akt-signalvägen i 5-fluorouracil-undertryckta benmärgsceller (28). I den aktuella studien minskade PI3K-hämmare signifikant ECH-inducerad eNOS-fosforylering vid Ser1177. Dessutom reglerades Akt-aktiviteten övervägande av uppströms regulatoriska vägar, särskilt PI3K-beroende fosforylering vid Ser473 (20). I föreliggande studie inducerade ECH Akt-fosforylering vid Ser473 på ett dosberoende sätt; på liknande sätt visade en tidigare studie att 5, 10 eller 20 µM ECH utövade en hjärtskyddande effekt mot anoxi/reperfusionsbehandling på ett dosberoende sätt genom att potentiellt uppreglera p-Akt och SLC8A3 (29). Den transkriptionella regleringen av Akt-genen förblir i stort sett okänd (30); därför fokuserade den aktuella studien på de post-transkriptionella regulatoriska effekterna av ECH på Akt. Med hänsyn till ovannämnda fynd drogs slutsatsen att appliceringen av ECH på HUVEC kan leda till aktivering av PI3K/Akt-vägen, som fosforylerar eNOS och, därefter, ökar NO-produktionen.

Sammanfattningsvis är ECH en naturprodukt som huvudsakligen är isolerad frånHerba Cistanche. Den potentiella mekanismen bakom ECH-inducerad NO-produktion iendotelcellerkan innefatta följande (fig. 6): i) ECH fungerar som en funktionell ligand av AR som är lokaliserad till kaveolerna i cellmembranet; ii) PI3K binder till den hydrofoba domänen av Akt vid Ser473 och underlättar rekrytering av Akt till cellmembranet; iii) rekryteringen av PI3K/Akt-kaskaderna utlöser AR-beroende eNOS-fosforylering, och iv) genereringen av NO medieras av eNOS iendotelceller. Observationen att ECH inducerar NO-produktion genom den AR-beroende fosforyleringen av eNOS med involvering av PI3K/Akt-vägen kan bidra till ytterligare förståelse av de vasorelaxerande effekterna av ECH. Dessutom kan ECH som riktar sig till de endotelhärledda NO-vägarna bero på icke-genomiska effekter. Därför kan den aktuella studien hjälpa till att belysa mekanismerna genom vilka ECH utövar sina farmakologiska effekter för att förhindra hjärt-kärlsjukdom.

Författare:

LI GU, DANHONG LIAN, YIMEI ZHENG, WEI ZHOU, JINLEI GU och XIN LIU

Food and Health Engineering Research Centre of State Education Ministry, School of Life Sciences,

Sun Yat-sen University, Guangzhou, Guangdong 510275, PR Kina

Mottaget 1 maj 2019; Godkänd 10 december 2019

Referenser

1. kommission för kinesisk farmakopé:Cistanche Herba. I: Pharmacopoeia of the People's Republic of China 1. chin. Med. Sci. Press, Beijing, s 135, 2015.

2. Jiang Z, Wang J, Li X och Zhang X:EchinacosideochCistanche tubulosa(Schenk) R. wight förbättrar bisfenol A-inducerad testikel- och spermieskada hos råttor genom gonadaxelreglerade steroidogena enzymer. J Ethnopharmacol 193: 321-328, 2016.

3. Liu J, Yang L, Dong Y, Zhang B och Ma X:Echinacoside, en ovärderlig naturprodukt vid behandling av neurologiska och andra störningar. Molecules 23: piiE1213, 2018.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S och Muraoka O: Fenyletanoida aminoglykosider och acylerade oligosocker med vasorelaxerande aktivitet frånCistanche tubulosa. Bioorg Med chem 14: 7468-7475, 2006.

5. Arnold WP, ​​Mittal CK, Katsuki S och Murad F: Kväveoxid aktiverar guanylatcyklas och ökar nivåerna av guanosin 3':5'-cykliskt monofosfat i olika vävnadspreparat. Proc Natl Acad Sci USA 74: 3203-3207, 1977.

6. Gai XY, Tang F, Ma J, Zeng KW, Wang SL, Wang YP, Wren TN, Lu dX, Zhou Y och Ge RL: Antiproliferativ effekt avechinakosidpå glatta muskelceller i lungartären hos råtta under hypoxi. J Pharmacol Sci 126: 155-163, 2014.

7. He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ och Tu PF:Echinacosideframkallar endotelberoende avslappning i aortaringar hos råtta via en NO-cGMP-väg. Planta Med 75: 1400-1404, 2009.

8. Gai XY, Wei YH, Zhang W, Wren TN, Wang YP, Li ZQ, Liu S, Ma L, Lu dX, Zhou Y och Ge RL:Echinacosideinducerar vasorelaxation i lungartären hos råtta genom att öppna NO-cGMP-PKG-BKca-kanalerna och minska intracellulär ca.^{2 plus}nivåer. Acta Pharmacol Sin 36: 587-596, 2015.

9. Maruhashi T, Kihara Y och Higashi Y: Bedömning av endoteloberoende vasodilatation: Från metodik till kliniska perspektiv. J Hypertens 36: 1460-1467, 2018.

10. Ahmad KA, Ze H, Chen J, Khan FU, Chen X, Xu J och ding Q: De skyddande effekterna av ett nytt syntetiskt elementderivat på mänsklig navelvenendotelcellermot oxidativ stress-inducerad skada: Involvering av antioxidation och PI3k/Akt/eNOS/NO signalvägar. Biomed Pharmacother 106: 1734-1741, 2018.

11. Yu J, Akishita M, Eto M, Koizumi H, Hashimoto R, Ogawa S, Tanaka K, Ouchi Y och Okabe T: Src-kinasmedierad androgenreceptorberoende icke-genomisk aktivering av signalkaskad som leder till endotelial kväveoxidsyntas . Biochem Bioph Res Commun 424: 538-543, 2012.

12. Yu J, Akishita M, Eto M, Ogawa S, Son B, Kato S, Ouchi Y och Okabe T: Androgenreceptorberoende aktivering av endotelial kväveoxidsyntas i vaskuläraendotelceller: Roll av fosfatidylinositol 3-kinas/Akt-väg. Endocrinology 151: 1822-1828, 2010.

13. Pittarella P, Squarzanti dF, Molinari c, Invernizzi M, Uberti F och Reno F: NO-beroende proliferation och migration inducerad av vitamin d i HUVEc. J Steroid Biochem 149: 35-42, 2015.

14. He Y, Luan Z, Fu X och Xu X: Överuttryck av frånkopplingsprotein 2 hämmar den högglukosinducerade apoptosen av human navelvenendotelceller. Int J Mol Med 37: 631-638, 2016.

15. Xiao-Hong d, chang-Qin X, Jian-Hua H, Wen-Jiang Z och Bing S: Icariin fördröjer homocysteininduceradendotelcellulärsenescens som involverar aktivering av PI3K/AKT-eNOS-signalvägen. Pharm Biol 51: 433-440, 2013.

16. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano Md, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ och Klenk dc: Mätning av protein med bicinchoninsyra. Anal Biochem 150: 76-85, 1985.

17. Gu L, Zhong X, Lian d, Zheng Y, Wang H och Liu X: Triterpenoidbiosyntes och transkriptionssvaret framkallat av kväveoxid i nedsänkt jäsande Ganoderma lucidum.Process Biochem 60: 19-26, 2017.

18. Ellingsworth dc, Sandow SL, Shukla N, Liu Y, Jeremy JY och Gutterman dd: Endothelium-derived hyperpolarization and coronary vasodilatation: diverse and integrerade rolls of epoxyeicosatrienoic acids, hydrogen peroxide and gap junctions. Mikrocirkulation 23: 15-32, 2016.

19. Freed JK och Gutterman dd: kommunikation är nyckeln: Mechanisms of intercellular signaling in vasodilation. J Cardiovasc Pharm 69: 264-272, 2017.

20. Quillon A, Från B och debatt R: Endotelmikromiljöavkänning som leder till kväveoxid-medierad vasodilatation: En översyn av nervösa och biomekaniska signaler. Nitric Oxide 45: 20-26, 2015.

21. Torres-Estay V, Carreno V, Francisco IF, Sotomayor P, Godoy AS och Smith GJ: androgenreceptor hos människaendotelceller. J Endocrinol 224: 131-137, 2015.

22. Deng Q, Zhang Z, Wu Y, Yu WY, Zhang J, Jiang ZM, Zhang Y, Liang H och Gui YT: Icke-genomisk verkan av androgener medieras av snabb fosforylering och reglering av androgenreceptorhandel. Cell Physiol Biochem 43: 223-236, 2017.

23. de Oliveira TS, de Oliveira LM, de Oliveira LP, costa RMd, Tostes Rc, Georg Rc, costa EA, Lobato NS, Filgueira FP och Ghedini Pc: Aktivering av PI3K/Akt-väg medierad av östrogenreceptorer står för östron- inducerad vaskulär aktivering av cGMP-signalering. Vascul Pharmacol 110: 42-48, 2018.

24. Li F, Yang X, Yang Y, Guo c, Zhang c, Yang Z och Li P: Antiosteoporotisk aktivitet avechinakosidhos ovarieektomerade råttor. Phytomedicine 20: 549-557, 2013.

25. Zeng KW, Liao LX, Wan YJ, Jiang Y och Tu PF: Farmakologisk målidentifiering och effektivitetsanalys av fenyletanoidglykosider frånCistancherHerba baserat på "målfiske"-strategi. chin Tradit Herbal drugs 49: 173-178, 2018.

26. Jiang Z, Zhou B, Li X, Kirby GM och Zhang X:Echinacosideökar spermiemängden hos råttor genom att rikta in sig på den hypotalamiska androgenreceptorn. Sci Rep 8: 3839-3850, 2018.

27. coffer PJ, Jin J och Woodgett JR: Proteinkinas B (c-Akt): En multifunktionell mediator av fosfatidylinositol 3-kinasaktivering. Biochem J 335, 1-13, 1998.

28. Wang S, Zheng G, Tian S, Zhang Y, Shen L, Pak Y, Shen Y och Qian J:Echinacosideförbättrar den hematopoetiska funktionen hos 5-FU-inducerade myelosuppressionsmöss. Life Sci 123: 86-92, 2015.

29. Chen M, Wang X, Hu B, Zhou J, Wang X, Wei W och Zhou H: Skyddseffekter avEchinacosidemot anoxi/reperfusionsskada i H9c2-celler via uppreglerande p-AKT och SLc8A3. Biomed Pharmacother 104: 52-59, 2018.

30. Abeyrathna P och Su Y: Akts kritiska roll i kardiovaskulär funktion. Vascul Pharmacol 74: 38-48, 2015.