Dendrimer-tesaglitazar konjugat inducerar en fenotypförskjutning av mikroglia och förstärker -amyloid fagocytos† Del 1

Att byta mikroglia från ett sjukdomsförvärrande, "pro-inflammatoriskt" tillstånd till en neuroprotektiv, "antiinflammatorisk" fenotyp är en lovande strategi för att ta itu med flera neurodegenerativa sjukdomar.

Microglia är en typ av celler i det centrala nervsystemet som primärt ansvarar för att upprätthålla neuronernas hälsa och funktion. De kan utsöndra en mängd olika tillväxtfaktorer och neurotrofiska faktorer och kan upprätthålla den normala metaboliska aktiviteten hos neuroner genom att rensa avfallsmaterial runt neuroner. Studier de senaste åren har visat att mikroglia är nära släkt med minnet. Låt oss ta en titt på det tillsammans.

För det första kan mikroglia stimulera neuroner och främja aktiveringen av neuroner, och därigenom förbättra minnet. Genom att frigöra en serie neurotransmittorer, såsom glutamat och alanin, kan mikroglia främja signalöverföring mellan neuroner och kan förbättra glial-neuronsignalresonansen mellan presynaptiska membran, vilket ytterligare främjar neuronal excitabilitet och minnesbildning.

För det andra kan mikroglia också rensa avfall runt neuroner, upprätthålla normal metabolisk aktivitet hos neuroner och minska neuronal dödlighet, och därigenom främja minnesförbättring. När för mycket skräp samlas runt neuroner, kommer det att påverka neuronernas normala metaboliska aktivitet, vilket leder till neuronal död och försvagad funktion, vilket minskar minnesprestanda. Microglia kan upprätthålla den normala metaboliska miljön hos neuroner och minska neuronal dödlighet genom att uppsluka och sönderdela omgivande avfall, och därigenom förbättra minnet.

Sammanfattningsvis är mikroglia nära besläktade med minne. Genom att främja excitationen av neuroner och rensa omgivande avfall kan mikroglia ytterligare förbättra minnet och hålla våra hjärnor friska och aktiva. Vi bör vara uppmärksamma på att skydda hälsan hos mikroglia för att uppnå bättre minne. Det kan ses att vi behöver förbättra minnet, och Cistanche kan förbättra minnet avsevärt eftersom Cistanche är ett traditionellt kinesiskt läkemedelsmaterial med många unika effekter, varav en är att förbättra minnet. Effekten av Cistanche kommer från de olika aktiva ingredienser den innehåller, inklusive garvsyra, polysackarider, flavonoidglykosider, etc. Dessa ingredienser kan främja hjärnans hälsa på en mängd olika sätt.

Klicka på vet 10 sätt att förbättra minnet

Proinflammatoriska mikroglia bidrar till sjukdomsprogression genom att frisätta neurotoxiska ämnen och påskynda patogen proteinackumulering. PPAR- och PPAR-agonister har båda visat sig skifta mikroglia från en pro-inflammatorisk ('M1-liknande') till en alternativt aktiverad ('M2-liknande') fenotyp. Sådana strategier har undersökts i kliniska prövningar för neurologiska sjukdomar, såsom Alzheimers och Parkinsons sjukdom, men har sannolikt misslyckats på grund av deras dåliga penetration av blod-hjärnbarriären (BBB).

Hydroxylterminerade polyamidoamindendrimerer (utan fästning av några målsökande ligander) har visats passera den försämrade BBB vid platsen för neuroinflammation och ackumuleras i aktiverade mikroglia.

Därför kan dendrimerkonjugering av en PPAR/dubbel agonist möjliggöra riktad fenotypbyte av aktiverad mikroglia. Här presenterar vi syntesen och karakteriseringen av ett nytt dendrimer-PPAR / dubbelagonistkonjugat (D-tesaglitazar).

In vitro inducerar D-tesaglitazar ett 'M1 till M2'-fenotypskifte, minskar utsöndringen av reaktiva syrearter, ökar uttrycket av gener för fagocytos och enzymatisk nedbrytning av patogena proteiner (t.ex. -amyloid, -synuklein) och ökar -amyloidfagocytos.

Dessa resultat stödjer ytterligare utveckling av D-tesaglitazar mot översättning för flera neurodegenerativa sjukdomar, särskilt Alzheimers och Parkinsons sjukdom.

Introduktion

Bara i USA finns det för närvarande över 5,3 miljoner människor med Alzheimers sjukdom (AD) och 1 miljon människor med Parkinsons sjukdom (PD).1 Eftersom ökad ålder är den största riskfaktorn för många neurodegenerativa sjukdomar, är prevalensen och kostnaden för behandling av dessa sjukdomar. kommer att fortsätta att öka i takt med att befolkningen blir äldre.

Dessutom har bristen på senaste framgång med att utveckla nya läkemedel för att behandla dessa sjukdomar visat på behovet av utveckling av innovativa terapier.2,3 Dessa kliniska misslyckanden belyser svårigheterna med att utveckla ett läkemedel, inklusive att leverera en tillräckligt hög koncentration av läkemedlet till hjärnan för att vara effektiv utan orsakar negativa biverkningar.

Neurodegenerativa sjukdomar som AD och PD delar tre viktiga neuropatologiska komponenter: neuroinflammation, patogen proteinackumulering och neuronal död.4–7 Sunda människor, hjärnans medfödda immuncell (themicroglia) fagocyterar ständigt de felveckade proteinerna (t.ex. -amyloid, -synuklein) ) som orsakar neuronal död när de produceras, vilket förhindrar kännetecknande aggregat från att bildas.

Men hos personer som så småningom utvecklar neurodegenerativa sjukdomar tar mikroglia inte längre bort dessa proteiner effektivt och övergår till en sjukdomsförvärrande, proinflammatorisk fenotyp (vanligen betecknad som M1).

Även om den övervägande pro-inflammatoriska/antiinflammatoriska (M1/M2) klassificeringen av mikroglialaktivering är en överförenkling av spektrumet av makrofagpolarisering, används den fortfarande som en bred nomenklatur för att beskriva den dominerande fenotypen av mikroglia i neuroinflammation och respons på terapi.

M1-liknande mikroglia frisätter reaktiva syrearter och andra inflammatoriska mediatorer som både inducerar neurondöd och förvärrar sjukdomspatologi genom att öka produktionen av patogena proteiner (t.ex. -amyloid, -synuklein).

Dessutom uttrycks de största genetiska riskfaktorerna för att utveckla AD(TREM2 och APOE) vid höga nivåer i mikroglia, och TREM2/APOE-vägen har visat sig orsaka amikroglial fenotypförskjutning i AD, amyotrofisk lateralskleros (ALS) och multipel skleros djurmodeller.8

Dessa fynd visar ytterligare mikroglias roll i patologin för flera mänskliga neurodegenerativa sjukdomar. Ett tillvägagångssätt för att manipulera fenotypen av mikroglia skulle göra det möjligt för forskare att förstå deras roll i neurodegenerativa sjukdomar, förutom att vara ett effektivt terapeutiskt medel.

Att byta mikroglia från en M1 till en antiinflammatorisk och neuroprotektiv (M2) fenotyp har föreslagits som en terapeutisk strategi för att behandla flera neurodegenerativa sjukdomar. M1 till M2 fenotypförskjutning i makrofager och mikroglia in vitro och in vivo.

9,10 PPAR-agonister har visat sig minska den LPS-inducerade utsöndringen av reaktiva syrearter genom att minska aktiviteten av NF-KB genom att inducera NF-KB-nedbrytning och export från kärnan, såväl som ligandberoende transrepression.11

Dessutom har epidemiologiska studier visat att diabetespatienter som tar rosiglitazon eller pioglitazon löper en minskad risk att utveckla AD och PD.12 Därefter undersöktes rosiglitazon och pioglitazon genom kliniska fas III-studier för AD, men misslyckades.13

En trolig förklaring till misslyckandet i de tidigare nämnda kliniska prövningarna är den dåliga transporten av dessa läkemedel över blod-hjärnbarriären (BBB), vilket begränsar antalet läkemedel som nådde hjärnan hos patienter som ingick i dessa kliniska prövningar.14

Det uppskattas faktiskt att BBB förhindrar cirka 98 % av alla småmolekylära läkemedel från att nå hjärnan, och endast en bråkdel av läkemedlet som kommer in i hjärnan når mikroglia.15

Dessutom är PPAR en annan nukleär receptor i PPAR-familjen.16 Den har en roll i lipidhomeostas och reglerar inflammation, och PPAR-agonister har också visat sig uppvisa antiinflammatoriska effekter i mikroglia.

Kliniska studier med användning av neuroimaging, vävnadsanalys efter slakt och CSF-biomarkörer har gett bevis för att theBBB är nedsatt vid AD och PD, såväl som andra neurodegenerativa sjukdomar.

17 Generation-4 hydroxylterminerade polyamidoamin (G4-PAMAM-OH) dendrimerer har visat sig förbigå den försämrade BBB och ackumuleras i aktiverade mikroglia utan behov av inriktningsligander, efter systemisk administrering i flera olika neuroinflammationssjukdomsmodeller , inklusive hos gnagare, kaniner, hundar och icke-mänskliga primater.18–28 Det är viktigt att G4-PAMAM-OH kan administreras systemiskt och passera BBB i sjukdomsmodeller med mild BBB-störning som Rett Syndrome.29

Dessutom är omfattningen av upptag av G4-PAMAM-OH i hjärnan direkt proportionell mot sjukdomens svårighetsgrad i en kaninmodell av cerebral pares.30 Hydroxylterminerade dendrimerer har fördelen att de tillförs icke-invasivt jämfört med den mycket invasiva, lokala leveransen genom skallen som krävdes i tidigare studier med andra nanopartiklar som poly-εkaprolakton och PEG, negativt laddade PAMAM-dendrimerer, kvantprickar och nanoformuleringar bestående av polyetylenimin (PEI) och dextransulfat.31–35

Dessutom är dessa hydroxyl PAMAM dendrimerer idealiskt placerade för translation på grund av deras skalbarhet och vältolererade in vivo säkerhetsprofil.36–38 På grund av positiva prekliniska effektdata, en (G4-PAMAM-OH)-N- acetyl-cysteinkonjugat utvärderas för närvarande i tidiga kliniska prövningar för cerebral adrenoleukodystrofi i barndomen (NCT03500627) och allvarlig coronavirussjukdom 2019 (COVID-19) associerad inflammation (NCT04458298).

Vi studerade ett dendrimer-läkemedelskonjugat av tesaglitazar (Tesa) kopplat till genererande -4 hydroxylterminerad PAMAMdendrimer. Tesaglitazar är en potent PPAR/dubbel agonist som kombinerar de gynnsamma effekterna av PPAR och PPAR-agonister. Den innehåller en funktionell karboxylsyragrupp för kovalent konjugering till dendrimeren och för efterföljande frisättning.

Ytterligare gitarrer har utvecklats och testats kliniskt, men Tesa valdes på grund av dess större aktivitetsförhållande mellan PPAR och PPAR, relativt enkla kemiska struktur och säkerhetsprofil.39–43

Tesa har tidigare nått kliniska fas III-studier för typ 2-diabetes i USA men misslyckades på grund av dosberoende toxicitet, som kan förhindras genom att minska den nödvändiga administreringsdosen genom den kontrollerade dendrimertillförseln.39,40,44Eftersom Tesa är en PPAR / dubbel agonist, dess riktade leverans till aktiverade mikroglia på platsen för neuroinflammation kan vara mycket fördelaktigt.

Häri demonstrerar vi syntesen och karaktäriseringen av ett dendrimer-tesaglitazar-konjugat (D-Tesa) och demonstrerar denna förenings förmåga att inducera en 'M1 tillM2'-fenotypförskjutning i mikroglia och förbättra fagocytos av fluorescensmärkt amyloid.

Material och metoder

Material

1-[3-(Dimetylamino)propyl]-3-etylkarbodiimidmetiodid(EDC), 4(dimetylamino)pyridin (DMAP), CuSO4·5H2O,natriumaskorbat, hexynsyra och bovint serumalbumin (BSA) köptes från Sigma Aldrich US och användes som mottagande (St Louis, MO).

Tesaglitazar erhölls från AstaTech Inc. (Bristol, PA). Etylendiaminkärna PAMAM-dendrimer (generation 4 med 64 hydroxyländgrupper) mottogs från Dendritech Inc. (Midland, MI) som en lösning i metanol.

Dendrimeren lagrades i metanol vid 4 grader och metanol indunstades före användning. Ett dialysmembran med en molekylviktsgräns (MWCO) på 1 kDa köptes från Spectrum Laboratories Inc. (New Brunswick, NJ).

Alla andra lösningsmedel användes som de mottogs i sina vattenfria former. Alla reaktioner, förutom koppar(I), katalyserad alkyn-azidcykloaddition (CuAAC) klickreaktioner, utfördes under vattenfria förhållanden i ett organiskt medium med ugnstorkad glasvaror under inert kväve atmosfär.

För cellodling: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), fetalt bovineserum (FBS), penicillin-streptomycin (P/S), 0.05 % trypsin-EDTA och MTT-reagens erhölls från Invitrogen (Carlsbad, CA) , USA).

Griess-reagens erhölls från Promega (Madison, WI) och TNF-ELISA erhölls från R&D Systems (Minneapolis, MN). Metanol av analytisk kvalitet köptes från Sigma-Aldrich. Trypanblått erhölls från Corning (Manassas, VA, USA).

Syntesprocedurer för D-Tesa-konjugat
Tetraetylenglykolmonoazid (2) syntetiserades med användning av ett tidigare publicerat protokoll.45

Syntes och rening av Tesa-TEG-azid (3).
Tesa (950 mg, 2,32 mmol) löstes i 10 ml dimetylformamid (DMF). Till denna omrörda lösning sattes tetrametylenglykolmonoazid (2, 662,1 mg, 3,02 mmol) i DMF (1 ml) droppvis. DMAP (255,4 mg, 2,09 mmol) och EDC (577,5 mg, 3,02 mmol) sattes sedan till reaktionsblandningen, och reaktionen omrördes under kvävespolning vid rumstemperatur under 24 timmar.

Reaktionen övervakades med användning av tunnskiktskromatografi och högpresterande vätskekromatografi (HPLC). Reaktionsblandningen späddes med 100 ml diklormetan (DCM) och den råa reaktionsblandningen flyttades in i en separertratt och det organiska skiktet tvättades därefter tre gånger med mättad natriumbikarbonatlösning, följt av mättad ammoniumkloridlösning och slutligen med saltlösning.

Det organiska skiktet torkades sedan med vattenfritt natriumsulfat. Lösningsmedlet i det organiska skiktet avlägsnades sedan med användning av en rotationsindunstare, och lösningen återupplöstes i 3 ml DCM och absorberades på silikagel för att renas med ett CombiFlash® kromatografisystem med användning av en gradientmetod med etylacetat/hexan som lösningsmedel för att producera 3 som klara -gul olja.

Den önskade, rena produkten elueras med cirka 30–40 % etylacetat. (Utb 7,08 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,73 (d, J=8,6 Hz, 2H), 4,25–4,14 (m, 2H), 4,07 (t, J {{ 33}},8 Hz, 2H), 3,94 (dd, J =7,8, 5,2 Hz, 1H), 3,67–3,47 (m, 14H), 3,30 (dd, J=8,7 , 3,8 Hz, 2H), 3,06 (s, 3H), 3,02 (t, J=6,7 Hz, 2H), 2,91–2,84 (m, 2H), 1,08 (t, J=7 0,0 Hz, 3H). ESI-MS: teoretisk C28H39N3O10S: 609,24, erhållen (M + 1):610,13.

Syntes och rening av D-YNE (5).

(480 mg, 4,22 mmol) sattes till en omrörd lösning av G4-PAMAM-OH (2,5 g, 0,176 mmol) i 20 ml vattenfri DMF. Till denna blandning tillsattes DMAP (430 mg, 3,52 mmol) och EDC (1 g, 5,28 mmol).

Reaktionsblandningen omrördes under kvävespolning i 24 timmar vid rumstemperatur. Efter fullbordande av reaktionen överfördes reaktionsblandningen till ett 1000 MWCO dialysrör DMF-dialys utfördes under 24 timmar och DMF byttes ungefär var sjätte timme.

Därefter utfördes dialys med avjoniserat (DI) vatten under 24 timmar, varvid vattnet byttes ungefär var sjätte timme. Slutligen lyofiliserades det resulterande innehållet i dialysröret i 48 timmar, vilket gav ett vitt, fluffigt pulver. (Utbyte: 61 %). dendrimeryta OH), 4,01 (t,ester –CH2), 3,32 (m, dendrimer –CH2), 3,06 (m, dendrimerandlinker –CH2), 2,85–2,58 (m, dendrimer –CH2), 2,56–1,89(m, dendrimer och linker –CH2), 1,78–1,61 (m, linker –CH2). Syntes och rening av D-Tesa (6).

Tesa-TEG-azid (3 177,8 mg, 0,3{{10}}3 mmol) sattes till en omrörd blandning av D-YNE(5, 35{{2{{27} }}} mg, 0,023 mmol) i 5 ml av en 1:1 blandning av tetrahydrofuran (THF) och vatten med 0,5 ml DMF i en mikrovågssäker 20 ml flaska. För CuAAC-klickreaktionen tillsattes kopparsulfatpentahydrat (11,6 mg, 0,0467 mmol) och (+)-natrium-laskorbat (9,3 mg, 0,0467 mmol) till reaktionsblandningen.

Flaskan förseglades och reaktionskärlet placerades sedan i en Biotage® Initiator mikrovågsreaktor och reagerades under 20 W mikrovågsstrålning under omrörning i 8 timmar vid 50 grader. Reaktionsblandningen överfördes till ett 1000 MWCO-dialysrör och DMF-dialys utfördes under 24 timmar, varvid DMF ersattes med nytt lösningsmedel ungefär var fjärde timme.

Därefter överfördes innehållet i dialysröret till afalkonrör och en ekvivalent mängd av avjoniserat vatten tillsattes. Dessutom tillsattes 200 µl etylendiamintetraättiksyradinatriumsaltlösning till innehållet i falkröret.

Denna blandning placerades sedan i ett nytt 1000 MWCO dialysrör och dialys utfördes under 12 timmar i 1000 ml DI-vatten med EDTA-lösning tillsatt följt av vattendialys under 12 timmar.

Blandningen lyofiliserades sedan i 48 timmar och resulterade i ett vitt, fluffigt pulver. (Utb (d, TesaArH), 6,76 (d, Tesa ArH), 4,37 (s, Tesa H), 4,18–4,04 (m, linkerH), 3,96 (dd, Tesa och linker H), 3,70 (m, Tesa och linker H) ,3,58–3,14 (m, dendrimer –CH2), 3,14–2.86 (m, dendrimer–CH2), 2,87–2,49 (m, dendrimer och linker –CH2), 2,25 (m, dendrimer –CH2) , 1,82-1,67 (m, länk -CH2), 0,97 (t, Tesa -CH3).

Karakteriseringstekniker

Kärnmagnetisk resonans (NMR). NMR-spektra registrerades på en Bruker 500 MHz spektrometer vid rumstemperatur. Protonkemiska skift (δ) rapporteras i ppm.

1H NMR användes för att bestämma antalet Tesa-molekyler fästa till varje molekyl av D-Tesa genom protonintegreringsmetod, genom att jämföra topparna för interna amidprotoner av dendrimer vid δ 7,6–8,2 ppm med aromatiska protoner av Tesa vid δ 7,36–6,76 ppm av metylprotoner Tesa i den alifatiska regionen.Högpresterande vätskekromatografi (HPLC).

HPLC (Waters Corporation, Milford, Massachusetts) utrustad med en 1525 binär pump, en In-Line avgasare AF, en 717 plus autosampler, en 2998 fotodiod array detektor och en 2475 multi λ fluorescensdetektor ansluten till Waters Empower mjukvara användes.

En Symmetry C18 omvänd faskolonn (Tosoh, Japan) med 5 μm partikelstorlek, 25 cm längd och 4,6 mm inre diameter användes. Föreningar övervakades vid 210 nm och 254 nm med användning av PDA-detektorer.

Lösningsmedel A tvättade vatten av HPLC-kvalitet med 0,1 % trifluorättiksyra (TFA), och lösningsmedel B var acetonitril (ACN) med 5 % vatten och 0,1 % TFA. Metoden som användes började vid 1{ {7}}0 : 0 (ACN: vatten), minskade till 10: 90 (vatten: ACN) på 5 minuter, stannade vid den polariteten i 15 minuter och återgick till 100 : 0 (ACN: vatten) på 5 minuter. Flödeshastigheten hölls vid 1 ml min−1. Massspektroskopi.

ESI-MS utfördes på BrukermicroTOF-II masspektrometer med användning av acetonitril/vatten (9:1) som lösningsmedelssystem. De molekylära jonerna som protonerade toppar [M + nH]n+ eller addukter [M + nX]n+ (X=Na, K eller NH4) användes för att bekräfta den empiriska formeln.

Dynamisk ljusspridning och ζ-potential. En Zetasizer NanoZS (Malvern Instrument Ltd, Worchester, Storbritannien) utrustad med en 50 mW He–Ne-laser (633 nm) användes för att bestämma partikelstorlek och ζ-potentialfördelning. D-Tesa löstes i DI-vatten till en koncentration av 0,2 mg ml−1 för DLS och i 10 mM natriumklorid till en koncentration av 0,1 mg ml−1 för ζ-potential.

Mätningarna gjordes vid 25 grader, med användning av en spridningsvinkel på 173 grader som tidigare beskrivits.27,46 Studie av läkemedelsfrisättning. D-Tesa löstes i en koncentration av 1 mg ml−1 i antingen fosfatbuffertlösning (pH 7,4) tomiska plasmaförhållanden eller natriumcitratlösning (pH 5,5) för att efterlikna lysosomala förhållanden.

Esteraser från svinlever (från Sigma Aldrich) sattes till natriumcitratlösningen i början av frisättningsstudien och fylldes på ungefär var tredje dag under studien.

Varje flaska innehöll 15 ml prov och de skakades kontinuerligt vid 37 grader under hela experimentet. Vid olika tidpunkter samlades duplikat av 200 µl prover från varje pH och esterasaktiviteten släcktes därefter genom tillsats av 200 µl metanol. Nolltimmars tidpunktprover fungerade som kontroll.

Proverna lagrades vid -80 grader för att ytterligare undvika hydrolys. Proverna analyserades ytterligare med HPLC och arean under kurvan (vid 210 nm) för den fria läkemedelstoppen beräknades. Arean under kurvan korrelerades till mängden läkemedel som frigjordes genom att använda en kalibreringskurva där kända koncentrationer av fri Tesa kördes på HPLC vid 210 nm.

For more information:1950477648nn@gmail.com