Dendrimer-tesaglitazar-konjugat inducerar en fenotypförskjutning av mikroglia och förstärker -amyloidfagocytos† Del 3

D-Tesa ökade uttrycket av enzymer som är ansvariga för avlägsnandet av patogena proteiner

Insulinnedbrytande enzym (Ide) och matrismetalloproteas 9(MMP9) är enzymer som utsöndras av mikroglia som bryter ner extracellulärt -amyloid och -synuklein.71,72 D-Tesa-behandling ökade signifikant uttrycket av Ide 3.1-faldigt (p < 0.001) med en trend mot ökande MMP9-uttryck (1.8-faldig ökning, p=0.057) jämfört med LPS-behandlade kontroller (Fig. 6A och B).

På senare år har allt fler studier visat att det finns ett nära samband mellan insulinnedbrytande enzymer och minne. Denna upptäckt ger oss värdefulla ledtrådar för att ytterligare utforska mekanismen för bildande och underhåll av minne.

Insulinnedbrytande enzym är ett viktigt enzym, vars huvudsakliga funktion är att bryta ner insulin för att upprätthålla blodsockerbalansen. Nya studier har dock visat att insulinnedbrytande enzym inte bara spelar en metabolisk roll, utan också direkt påverkar tillväxten och reparationen av nervceller i hjärnan, och spelar en viktig roll för att upprätthålla minnet.

Många studier har visat att ju högre nivå av insulinnedbrytande enzym, desto bättre minne. Detta beror på att insulinnedbrytande enzymer kan främja tillväxt och reparation av neuroner och därigenom förbättra hjärnans inlärnings- och minnesförmåga. Dessutom kan insulinnedbrytande enzymer också främja kopplingen mellan neuroner, och därigenom förbättra associationen och retentionen av minnet.

Den viktiga rollen för insulinnedbrytande enzymer i minnet har använts i stor utsträckning inom klinisk medicin. Forskare har funnit att genom att andas in insulinnedbrytande enzymer kan inte bara minnet förbättras, utan även kognitiva förmåga och depressiva symtom kan förbättras.

Kort sagt är kopplingen mellan insulinnedbrytande enzymer och minne ett mycket viktigt område, som ger oss värdefulla ledtrådar för att studera minnets biologiska mekanism. Framtida forskning kommer att ytterligare utforska funktionen och rollen av insulinnedbrytande enzymer, hjälpa oss att bättre förstå bildningen och lagringsmekanismen för minne och ge en bättre grund för att förbättra inlärnings- och minnesförmågan i den mänskliga hjärnan. Man kan se att vi behöver förbättra minnet, och Cistanche kan förbättra minnet avsevärt eftersom Cistanche också kan reglera balansen av signalsubstanser, som att öka nivåerna av acetylkolin och tillväxtfaktorer, som är mycket viktiga för minne och inlärning. Dessutom kan Cistanche också förbättra blodflödet och främja syretillförseln, vilket kan säkerställa att hjärnan får tillräckligt med näring och energi, och därigenom förbättra hjärnans vitalitet och uthållighet.

Klicka på vet sätt att förbättra ditt minne

Free Tesa ökade signifikant uttrycket av Ide 2-faldigt (p=0.011), och ökade MMP92--faldigt icke-signifikant (p=0.35) (fig. 6A) och B). M2 mikroglia i neurodegenerativa sjukdomar kan avlägsna -amyloid, -synuklein och andra patogena proteiner via enzymatisk nedbrytning eller fagocytos, och D-Tesa uppreglerar proteiner som är involverade i dessa processer (dvs. Ide och MMP9).71–73

Ideexpression är nedreglerad i AD- och PD-patologi och är känd för att uppregleras av PPAR-agonister, vilket överensstämmer med våra resultat.

71,72 Funktionellt har endast en 2-faldig ökning av Ide-nivåer visats minska -amyloidackumulering och neuronal död in vivo.74,75 Därför har den 3-faldiga ökningen av Ide som observerats av D-Tesa, och 2-faldig ökning av Ide av freeTesa kan vara terapeutiskt effektiv in vivo.

D-Tesa ökar fagocytos av -amyloid

CD36 är en mikroglial scavenger-receptor som underlättar fagocytos och nedbrytning av -amyloid.73 Dess nedreglering iAD resulterar i minskat avlägsnande av -amyloid, men den uppregleras av PPAR-aktivering.

Både D-Tesa och gratis Tesa ökade signifikant CD36-uttrycksnivåerna jämfört med LPS-exponerade celler (p < 0.0001 vs. p < 0,005 för D-Tesa och gratis Tesa , respektive), men D-Tesa var mycket effektivare än gratis Tesa (6-faldig ökning mot 2.8-faldig ökning för D-Tesa respektive fri Tesa, p < 0,0005) (Fig. 6C) ).

Våra resultat överensstämmer med tidigare studier med pioglitazon (en annan PPAR-agonist) som visade att ökad mikroglial fagocytos av -amyloid sker genom en PPAR- och CD36-beroende mekanism.73

För att undersöka om uppregleringen av CD36 från D-Tesatreatment korrelerade med den ökade fagocytiska förmågan hos dessa celler, utförde vi en funktionell fagocytosanalys av -amyloid. 73

Kortfattat, efter att ha behandlat cellerna som vi gjorde i de tidigare in vitro-analyserna, applicerade vi fluorescensmärkt -amyloid1-42 på cellerna i två timmar, tvättade cellerna och utförde sedan flödescytometri för att undersöka graden av cellulärt upptag av -amyloid. D-Tesa ökade både procentandelen celler som fagocyterade -amyloid och den genomsnittliga mängden -amyloid internaliserad per cell (fig. 7A och B).

I motsats till detta gav fri Tesa inga förbättringar i fagocytos av -amyloid. De överlägsna effekterna av D-Tesa jämfört med Tesa kan sannolikt tillskrivas förbättrad cellulär internalisering som möjliggörs av dendrimerkonjugering.

Detta överensstämmer med tidigare arbete som visade att över 95 % av BV2-cellerna behandlade med fluorescensmärkt G4-PAMAM-OH hade internaliserat dendrimeren inom trettio minuter och fortsatte att internalisera dendrimeren i minst 24 timmar.76

På samma sätt visade konjugering av den lilla molekylen minocyklin till fluorescensmärkt G4-PAMAM-OH att 99 % av BV2-cellerna hade internaliserat det fluorescensmärkta dendrimer-läkemedelskonjugatet inom 3 timmar.26 De visade också att konjugatet minskade kväveoxidnivåerna till det fria läkemedlet efter att ha behandlat BV2-celler med LPS, i överensstämmelse med våra resultat.

Cellerna som behandlats med D-Tesafagocyterades 1.9-faldigt mer amyloid än de LPS-behandlade kontrollcellerna (p < 0.001), vilket är jämförbart med 2.5-faldig ökning av -amyloid fagocytos av primära mikroglialceller från råtta som behandlats med pioglitazon rapporterat av Yamanaka et al.73 Den något högre graden av -amyloid fagocytos av den tidigare studien kan antingen bero på att de inte behandlade sina celler samtidigt med LPS som vi gjorde, eller för att primär mikroglia uttryckte PPAR vid en högre nivå än BV2-celler som används i denna studie.77

Som sådan kan en lägre dos av D-Tesa än den som uppskattades från in vitro-experimenten i vår studie sannolikt vara effektiv in vivo-studier och människor, eftersom BV2-celler är kända för att uttrycka PPAR vid lägre nivåer än primärmikroglia.77

Mikroglia har varit inblandad i många neurodegenerativa sjukdomar, och BBB har förhindrat många läkemedel som kan modifiera fenotypen av mikroglia från en pro-inflammatorisk, neurotoxisk M1-fenotyp till en antiinflammatorisk, neuroprotektiv M2-fenotyp från att nå terapeutiska nivåer i hjärnan.5,6, 14,15

Till exempel undersöktes två PPAR-agonister, pioglitazon och rosiglitazon, var och en genom kliniska fas III-prövningar för Alzheimers sjukdom på grund av deras förmåga att förändra fenotypen av mikroglia, men misslyckades sannolikt på grund av dålig transport över BBB.13,14 Det finns således kliniskt intresse för förändringar fenotypen av mikroglia i neurodegenerativa sjukdomar.

Ett sådant tillvägagångssätt kräver leverans av läkemedlet till mikroglia i tillräckliga nivåer för att driva ett svar. För detta ändamål har G4-OH-PAMAM-dendrimerer visat sig leverera läkemedel till mikroglia i många djurmodeller efter systemisk injektion, och som ett resultat utvärderas de för närvarande i kliniska prövningar för behandling av ccTLD (NCT03500627) och svår COVID -19 associerad inflammation (NCT04458298).18–28

För att kombinera de fördelaktiga effekterna av att förändra mikroglial fenotyp med förmågan att leverera läkemedel till mikroglia, konjugerade vi tesaglitazar (en PPAR/dubbel agonist) till en G4-OH-PAMAMdendrimer (Fig. 1–3). Vi visade att D-Tesa kan ändra fenotypen av M1 mikroglia mot en M2-fenotyp (fig. 4 och 5), vilket resulterar i en minskning av utsöndringen av skadliga reaktiva syrearter.

Vidare visade vi att mikroglia som behandlats med D-Tesa ökar deras uttryck av enzymer som bryter ned patologiska proteiner såsom -synuklein och -amyloid, samt uppreglerar fagocytosen av -amyloid i en funktionell analys (fig. 6 och 7).

Även om vi inte presenterar data som visar förmågan hos D-Tesa att kringgå BBB och ackumuleras i mikroglia, har vi tidigare visat att G4-OH-PAMAM läkemedelskonjugat med liknande läkemedelsbelastning, storlek och zetapotential kan passera genom försämrad BBB och ackumulerande inmikroglia efter intravenös administrering.26,36,52

Dessa resultat stödjer den fortsatta utvecklingen av D-Tesa för behandling av flera neurologiska sjukdomar. Medan vi fokuserar på Alzheimers och Parkinsons sjukdomar i denna artikel, har D-Tesa potential för klinisk översättning av flera neurologiska störningar. På grund av mikroglias liknande roll i patologin för multipla neurodegenerativa sjukdomar, har PPAR-agonisten pioglitazon också undersökts eller undersöks för närvarande i kliniska fas II-studier för Parkinsons sjukdom,78 ALS,79 adrenomyeloneuropati(NCT03864523), multipel skleros (NCT03864523), multipel skleros (hem092T0831) och hem092T0831 upplösning vid intracerebral blödning (NCT00827892).

Om dessa kliniska prövningar också misslyckas på grund av dålig leverans av pioglitazon över BBB, kan D-Tesa övervinna detta leveranshinder och behandla patienter med dessa sjukdomar.

Andra grupper har använt nanopartiklar för att förbättra leveransen av PPAR-agonister till makrofager, men de har inte försökt leverera dessa agonister till mikroglia. Osinski et al. demonstrerade att Tesa-laddade liposomer mestadels upptogs av makrofager i visceralt vitt fett i en manlig leptinbristmodell med fetma.80

De visade dessutom att Tesa-laddade liposomer inte förändrade uttrycket av M1-markören Mcp-1, men ökade uttrycket av M2-markören Arg1, medan behandling med fri Tesa minskade det totala antalet M1-makrofager och uttrycket av Mcp{{6 }}, och ökade inte uttrycket av Arg1.

Nakashiro et al. använde nanopartiklar av poly(mjölk-samglykolsyra) (PLGA) för att leverera pioglitazon (en PPAR-agonist) till makrofager i samband med ateroskleros.81

In vivo visade de att PLGA-pioglitazon minskade nivåerna av immunceller i blodet. Inprimära benmärgshärledda makrofager behandlade med LPS och interferon, fann de att PLGA-pioglitazon ökade IL-4 och IL-10 (M2-markörer) och inte minskade IL-6- eller TNF-nivåer.

Deras resultat liknar våra; M2-markörer ökade med nanopartikel-PPAR-agonistbehandling, medan IL--6- och TNF-nivåerna inte minskade. Di Mascolo et al. använde PLGA-polyvinylalkohol-nanopartiklar för att leverera rosiglitazon (en annan PPAR-agonist).82

In vitro visade de att deras nanopartikel-läkemedelskomplex minskade uttrycket iNOS, TNF- och IL-1 i benmärgshärledda makrofager. De förbehandlade sina celler med nanopartikelläkemedlet innan de stimulerade med LPS, medan vi förbehandlade celler med LPS innan de behandlade med D-Tesa, vilket kan vara en anledning till att vi inte observerade en minskning av TNF- och IL-1, även om vi också observerade minska i iNOS-uttryck.

Slutsats

Det finns för närvarande ingen patologiförändrande behandling för många neurodegenerativa sjukdomar, och när befolkningen fortsätter att utvecklas kommer prevalensen och kostnaderna för att behandla dessa sjukdomar att fortsätta att öka, vilket visar på det akuta behovet av att utveckla en lösning. Nyligen har pro-inflammatoriska M1 mikroglia varit avgörande i patologin för flera neurodegenerativa sjukdomar.

Att sedan kunna leverera läkemedel över blod-hjärnbarriären som kan inducera en "M1 toM2" fenotypförskjutning i mikroglia har terapeutisk potentiella flera sjukdomar, särskilt Alzheimers och Parkinsons sjukdom.

D-Tesa designades för att leverera ett "M1 till M2"-inducerande läkemedel till mikroglia efter systemisk administrering för att minska mikroglial utsöndring av neurotoxiska substanser, samtidigt som det inducerar ett antiinflammatoriskt tillstånd som ökar nedbrytning och fagocytos av patogena proteiner i hjärnan. Vi syntetiserade framgångsrikt D-Tesa med en mycket effektiv klickkemi.

Läkemedlet fästs till dendrimeren via en esterbindning som är klyvbar intracellulärt vid lysosomala förhållanden, varvid cirka 60 % av Tesa frisätts under de första 48 timmarna under lysosomala förhållanden.

D-Tesa visade sig vara överlägsen Tesa in vitro när det gäller att inducera en M1 till M2a/M2b/M2cfenotypförskjutning, vilket resulterade i minskad kväveoxidutsöndring, ökat uttryck av -synuklein och -amyloidnedbrytande enzymer och ökad fagocytos av -amyloid.

Således kombinerar D-Tesa de fördelaktiga leveransegenskaperna hos dendrimeren, med M1 till M2-omkopplingsegenskaperna hos Tesa. På grund av den gemensamma rollen för mikroglia och den gemensamma terapeutiska fördelen med att inducera ett M1 till M2 fenotypskifte, har D-Tesa potential att behandla många neurologiska störningar när det administreras i rätt stadium av sjukdomsprogression.

Författarbidrag

LD, AS, KL, RS, SK och RMK konceptualiserade experimenten. LD, AS och RS utförde syntes och karakterisering av dendrimer-läkemedelskonjugatet. LD, KL och JJ utförde cellexperimenten. LD och K. L. utförde statistiken. LD och AS skrev manuskriptet, och alla författare redigerade manuskriptet.

Intressekonflikter

RMK och SK är meduppfinnare av att använda den hydroxylterminerade dendrimeren för riktad leverans till mikroglia vid neurologiska sjukdomar, såväl som patent relaterade till dendrimerteknologin som beskrivs i denna artikel.

De är medgrundare av Ashvattha Therapeutics, Orpheris Inc. och RiniSight Inc., som är företag som leder den kliniska utvecklingen av plattformen. SK och RMK är styrelseledamöter i AshvatthaTherapeutics Inc. RS är för närvarande anställd av AshvatthaTherapeutics och äger aktier i företaget; verketR. S. uppträdde för denna tidning gjordes innan han gick med i Ashvattha. Intressekonflikten hanteras av JohnsHopkins University.

Erkännanden

Vi skulle vilja tacka Elizabeth Smith Khoury för användbara diskussioner om in vitro-experimenten. Detta projekt finansierades av Patz Distinguished Professorship Endowment från JohnsHopkins och NICHD (bidragsnummer HD076901) (RMK). Vi tackar Wilmer Core Grant för synforskning, mikroskop och kärnmodul (bidragsnummer EY001865) för tillgång till Sonys flödescytometer.

Vi tackar Servier Medical Arts för användningen av deras samling av bilder (http://smart.servier.com/) som är licensierad under en Creative Common Attribution 3.0 GenericLicense, som modifierades för att göra den grafiska abstraktionen.

Referenser

1 CL Gooch, E. Pracht och AR Borenstein, The burden of neurological disease in the United States: A summary report and call to action, Ann. Neurol., 2017, 81, 479–484.

2 JL Cummings, T. Morstorf och K. Zhong, pipeline för läkemedelsutveckling för Alzheimers sjukdom: få kandidater, frekventa misslyckanden, Alzheimers Res. Ther., 2014, 6, 37.

3 P.-P. Liu, Y. Xie, X.-Y. Meng och J.-S. Kang, Historia och framsteg av hypoteser och kliniska prövningar för Alzheimers sjukdom, Signal Transduction Targeted Ther., 2019, 4, 1–22.

4 C. Soto och S. Pritzkow, Proteinfelveckning, aggregation och konformationsstammar vid neurodegenerativa sjukdomar, Nat. Neurosci., 2018, 21, 1332–1340.

5 VH Perry och C. Holmes, Microglial priming in neurodegenerative disease, Nat. Rev. Neurol., 2014, 10, 217–224.

6 Y. Tang och W. Le, Differential Rolls of M1 and M2Microglia in Neurodegenerative Diseases, Mol. Neurobiol., 2016, 53, 1181-1194.

7 MW Salter och B. Stevens, Microglia framträder som centralspelare i hjärnsjukdom, Nat. Med., 2017, 23, 1018–1027.

8 S. Krasemann, et al., The TREM2-APOE Pathway Drives the Transcriptional Phenotype of Dysfunctional Microglia in Neurodegenerative Diseases, Immunity, 2017, 47, 566–581.e9.

9 Q. Zhao, et al., De antidepressiva effekterna av pioglitazon i en musmodell med kronisk mild stress är associerade med PPAR-medierad förändring av mikrogliala aktiveringsfenotyper, J. Neuroinflammation, 2016, 13, 259.

10 L. Wen, et al., Polarization of Microglia to the M2-fenotyp i en peroxisomproliferatoraktiverad receptor Gamma-beroende sätt dämpar axonal skada inducerad av traumatisk hjärnskada hos möss, J. Neurotrauma, 2018, 305-23230.

11 W. Cai, et al., Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR): En master gatekeeper i CNS-skada och reparation, Prog. Neurobiol., 2018, 163–164, 27–58.12 B. Brakedal, et al., Glitazonanvändning associerad med minskad risk för Parkinsons sjukdom, Mov. Disord., 2017, 32, 1594–1599.

For more information:1950477648nn@gmail.com