Dieselavgasexponering förändrar uttrycket för nätverk som är inblandade i neurodegeneration i zebrafiskhjärnor Del 1

Abstrakt

Neurodegenerativa sjukdomar är en viktig orsak till funktionshinder i världen, men deras etiologier förblir i stort sett svårfångade. Genetiska faktorer kan bara stå för en minoritet av risken för de flesta av dessa sjukdomar, vilket tyder på att miljöfaktorer spelar en betydande roll i utvecklingen av dessa sjukdomar.

Neurodegenerativa sjukdomar hänvisar till en typ av sjukdom som orsakar degenerering av hjärnceller på grund av olika orsaker. Vanliga är Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, Huntingtons sjukdom, etc. Dessa sjukdomar påverkar nervceller i hjärnan, vilket resulterar i nedsatt hjärnfunktion och symtom som minne, tänkande och beteendeförändringar.

Men vi behöver inte förlora vår positiva attityd på grund av dessa sjukdomar. Det finns många sätt att hjälpa patienter att förbättra minnet och lindra symtomen. Låt oss ta en titt på några av dessa metoder:

Först ska du träna lite. Forskning visar att fysisk aktivitet förbättrar blodcirkulationen i hjärnan och ökar frisättningen av kemikalier som dopamin och endorfiner, som hjälper till att skydda och förbättra neuronernas funktion. Samtidigt kan träning också bidra till att minska problem som ångest, depression och sömnlöshet, vilket gör patienterna mer behagliga att möta livet.

För det andra, upprätthålla sociala relationer. Det är också mycket viktigt att våra sociala nätverk är nära kopplade till relaterade delar av hjärnan, och social interaktion kan inte bara minska stress, utan också förbättra hjärnans hälsa genom att öka lyckan, bekämpa depression och mer.

Ät till sist bra och få tillräckligt med sömn. Båda dessa aspekter kan ha viktiga effekter på hjärnans hälsa. En bra kost behöver inte bara innehålla tillräckligt med näringsämnen, utan den måste också undvika att upprepade gånger konsumera för mycket socker, mättat fett och kolesterol. Dessutom kan få tillräckligt med sömn hjälpa till att bekämpa minnesproblem i olika stadier, särskilt sjukdomar som Alzheimers sjukdom.

Kort sagt innebär neurodegenerativa sjukdomar inte att ge upp förväntningarna på livet. Samtidigt som man upprätthåller en positiv attityd är det också nödvändigt att anta vetenskapliga och effektiva metoder för att förbättra livskvaliteten. Mer skratt och mer solsken hjälper dig att hålla dig frisk. Det kan ses att vi behöver förbättra minnet, och Cistanche deserticola kan förbättra minnet avsevärt eftersom Cistanche deserticola är ett traditionellt kinesiskt läkemedelsmaterial som har många unika effekter, varav en är att förbättra minnet. Effekten av Cistanche deserticola kommer från de många aktiva ingredienser den innehåller, inklusive garvsyra, polysackarider, flavonoidglykosider, etc. Dessa ingredienser kan främja hjärnans hälsa genom en mängd olika vägar.

Klicka på vet 10 sätt att förbättra minnet

Långvarig exponering för luftföroreningar har nyligen identifierats för att öka risken för Alzheimers och Parkinsons sjukdomar, men de molekylära mekanismerna som det verkar genom är inte välkända.

Zebrafiskhembryon som exponeras för dieselavgaspartikelextrakt (DEPe) leder till dysfunktionell autofagi och neuronförlust. Här exponerade vi zebrafiskembryon för DEPe och utförde proteomiska och transkriptomiska uttrycksanalyser med hög genomströmning från deras hjärnor för att identifiera patogena vägar inducerade av luftföroreningar. DEPe-behandling förändrade flera biologiska processer och signalvägar som är relevanta för neurodegenerativa processer, inklusive xenobiotisk metabolism, fagosommognad och amyloidbearbetning. Den största induktionen av genuttryckshjärnor var i Cyp1A (mer än 30-faldigt).

Relevansen av denna uttrycksförändring bekräftades genom att blockera induktion med CRISPR/Cas9, vilket resulterade i en dramatisk ökning av känsligheten för DEPe-toxicitet, vilket bekräftar att Cyp1A-induktion var en kompenserande skyddsmekanism.

Dessa studier identifierade störda molekylära vägar som kan bidra till patogenesen av neurodegenerativa störningar. I slutändan kan fastställandet av den molekylära grunden för hur luftföroreningar ökar risken för neurodegeneration bidra till utvecklingen av sjukdomsmodifierande terapier.

Nyckelord

Luftföroreningar · Demens · Parkinsons sjukdom · Alzheimers sjukdom · Transkriptomik ·Proteomik.

Introduktion

Luftföroreningar är en stor bidragande orsak till dödligheten och är förknippad med luftvägssjukdomar, hjärtsjukdomar, stroke, lungcancer och diabetes. Nya epidemiologiska bevis stöder en koppling mellan exponering för luftföroreningar och utvecklingen av neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Alzheimers och Parkinsons sjukdomar (AD och PD) (Fu et al. 2019). Det finns en brist på forskning som undersöker de mekanismer genom vilka luftföroreningar kan öka risken för AD och PD, men de få som finns stödjer ett orsakssamband (Fu et al. 2019).

Ackumuleringen av proteininneslutningar i hjärnan är ett universellt kännetecken för neurodegenerativa störningar och är sannolikt en vanlig väg som leder till neuronal dysfunktion och död. Till exempel är bildningen av amyloid-beta (A-beta) och tau-strukturer de patologiska kännetecknen för AD och -synuklein (-syn) aggregat eller Lewy Bodies i PD (Ross och Poirier 2004; Woulfe 2008).

Förändringar i proteostas verkar åtminstone delvis ligga bakom bildandet av dessa aggregat, men de exakta mekanismerna är fortfarande okända och kan variera hos individer beroende på genetiska och miljömässiga riskfaktorer. Vi vet att ökat uttryck eller minskad nedbrytning av A-betaor -syn kan leda till AD och PD (Bostancıklıoğlu2019; Johnson et al. 2019).

Andra vanliga egenskaper vid neurodegenerativa sjukdomar är inflammation och oxidativ stress. Aktiverade mikroglia, de inflammatoriska cellerna i CNS, kan lätt uppskattas vid obduktioner av AD- och PD-hjärnor och bidrar sannolikt till patogenesen av neurodegeneration (Kannarkat et al. 2013). Denna inflammation och möjligen mitokondriell dysfunktion tros leda till oxidativ stress vilket också uppskattas i obducerade hjärnor (Picca et al. 2020).

Majoriteten av mekanistiska studier om luftföroreningar och neurodegeneration hittills har fokuserat på inflammation (Jayaraj et al. 2017). Luftföroreningar verkar öka både CNS-inflammation och oxidativ stress i djurs och mänskliga hjärnor (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2007, 2008a,b och c; Levesque et al. 2011a, b, 2013; Moultonand Yang et al. 2012; 2017; Yokota et al.2013a, b).

Av särskilt intresse är fynden att luftföroreningar ökar uttrycket av vissa inflammatoriska gener i olfactory bulb (OB) hos möss, en hjärnregion där PD-patologi ses mycket tidigt i sjukdomen (Levesque et al. 2011a, b; Yokota et al. 2013a) . Inflammation sågs också hos hundar som bodde i stadsområden jämfört med de som bor på landsbygden, och författarna spekulerade i att dessa förändringar berodde på höga nivåer av luftföroreningar (Calderón-Garcidueñas et al. 2003).

Samma författare föreslog också att -syn ackumulerades i hjärnan hos människor som bor i städer på grund av luftföroreningar (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2008a,b). I en nyligen genomförd studie i en zebrafiskmodell rapporterades exponering för DEPe orsaka neurotoxicitet och en betydande minskning av neuronantal genom att störa autofagi (Barnhill et al. 2020).

DEPe innehåller många av de giftiga komponenterna i luftföroreningar och används vanligtvis för att modellera exponering i cellkultursystem (Costa et al. 2014; Hesterberg et al. 2010; Levesque et al. 2011b). Autofagi är en väsentlig intracellulär mekanism för att avlägsna och utrota felveckade proteiner och skadade organeller.

I själva verket är exakt autofagisk aktivitet nödvändig för cellulär homeostas, och dysfunktionell autofagi i neuroner leder till förändrad överlevnad och neurodegeneration (Kesidou et al. 2013). Det finns tydliga begränsningar i många av dessa studier, men de tyder alla på att exponering för luftföroreningar ökar risken för AD och PD. Vår förståelse för de mekanismer genom vilka föroreningar ökar denna risk är begränsad, men ultrafina partiklar och flera komponenter av luftföroreningar kan komma in i hjärnan antingen direkt genom luktbulan genom lungorna via blodomloppet (Kilian och Kitazawa 2018).

Dessa partiklar är sammansatta av kolkärna och adsorberade föreningar såsom polycykliska aromatiska kolväten, metaller, nitrat, sulfat och andra grundämnen och utgör en betydande andel av luftföroreningarna, särskilt i stadsområden. Många av dessa föreningar har varit inblandade inoxidativ stress och cellulär stress. toxicitet som ger rimlighet till ett orsakssamband mellan luftföroreningar och neurodegeneration.

Detaljerade multidisciplinära undersökningar, inklusive cellulära och djurmodeller, kan ge insikter i orsakerna till sjukdomar och direkta framtida terapeutiska tillvägagångssätt (Cannon och Greenamyre 2011). Bland de modellorganismer som används för in vivo-studier är Danio rerio (zebrafisk) en kraftfull modell för att studera toxikologi, molekylär genetik, toxikogenomik och läkemedelsupptäckt.

De flesta biologiska vägar är mycket konserverade hos ryggradsdjur, och majoriteten av funktionella mänskliga gener har homologer i zebrafisk (Vaz et al.2018). Dessutom utvecklas embryon från zebrafisk snabbt och oberoende, vilket möjliggör analys i alla önskade utvecklingsstadier. Dessa egenskaper, tillsammans med snabb reproduktion och låga kostnader för odling, gör zebrafisk till en gynnsam modell för att studera de toxiska effekterna av miljöexponeringar.

För att bättre förstå de molekylära mekanismerna bakom sjukdomens patogenes har ett brett spektrum av profileringsmetoder för genuttryck med hög genomströmning utvecklats. Masspektrometri-baserad proteomik och RNA-sekvensering med hög genomströmning är särskilt lovande när det gäller att identifiera biologiska vägar av intresse. Dessa tekniker har använts i stor utsträckning för att förstå hur cellulära och djurmodeller svarar på miljöstimuli (Duan et al. 2017; García-Estrada et al. 2013; Jamiet al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al. 2012).

I denna studie har vi eftersträvat uttrycksanalyser av effekterna av DEPe-behandling på både proteom- och transkriptomprofilerna i huvudet på zebrafiskhembryon. Isolering av prover från huvudet som huvudsakligen består av hjärnvävnaden gjorde det möjligt att erhålla mer vävnadsspecifika profiler och minimerade effekter som härrör från andra vävnader. Vi beskriver här förändrat genuttryck och proteinprofiler i flera vägar involverade i neurodegeneration i huvudena på DEPe-exponerade zebrafiskar. Dessa resultat ger nya insikter om de möjliga mekanismerna genom vilka luftföroreningar ökar risken för AD och PD.

Material och metoder

Fiskbehandling och CRISPR/Cas9-förmedlad gennedbrytning

Alla studier godkändes av UCLA AnimalRights Committee. Zebrafisk (AB) föds upp genom ljusstimulering under 1 timme, och ett totalt antal av 200 ägg inkuberades i 24 timmar vid 28 grader. De resulterande embryona dekorionerades i pronas (2 mg/ml) och behandlades med antingen DEPe (Standard Reference Materials, NIST, Gaithersburg, MD) vid en slutkoncentration av 20 ug/ml eller vehikel fram till 5 dagar efter befruktning (DPF).

Denna koncentration valdes eftersom den resulterade i neuronförlust som tidigare rapporterats men utan signifikant dödlighet (Barnhillet al. 2020). Cyp1A knockdown fisk bereddes enligt följande. Med hjälp av verktyg tillgängliga på http://crispr.mit.edu, theCRISPR RNA (Cyp1A-crRNA) ) designades baserat på placeringen av lämpliga PAM-ställen i den första exonen av Cyp1A-genen.

Den bästa designen köptes från IDT DNA (www.idtdna.com) tillsammans med standard CRISPR-Cas9 tracrRNA. CrRNA för Cyp1Agene och tracrRNA återsuspenderades separat i 10 mM Tris-EDTA för att ge en slutlig koncentration på 100 μM. Sedan kombinerades tracrRNA med crRNAin 1 × duplexbuffert (100 mM kaliumacetat; 30 mM HEPES, pH 7,5; IDT DNA) för att ge en slutlig koncentration på 10 μM. Blandningen värmdes till 95 grader i 5 minuter i ett kokande vattenbad och kyldes långsamt till rumstemperatur för att möjliggöra hybridisering av de komplementära nukleotidsekvenserna incrRNA och tracrRNA och bildning av funktionellt guide-RNA (gRNA).

En volym på 3 μL annealedgRNA kombinerades sedan med samma volym av en donator enkelsträngat DNA (ssDNA; 200 μM) som mallsekvensen för mutant Cyp1A. En mängd av 3 ug Cas9 Nukleas (IDT) i 1 x injektionsbuffert (5 mM KCl; 0,1 M natriumfosfat, pH 6,8) sattes till blandningen för att bilda de slutliga CRISPR/Cas9ribonukleoproteinkomplexen (Cyp1A-RNP).

För framställningen av Scramble RNP (SC-RNP) ersattes det specifika Cyp1A-crRNA:t med ett kommersiellt Scramble-crRNA utan mål på genomet. Denna sekvens av alla oligonukleotider som används i detta arbete är listade i tilläggstabell 1. Ägg injicerades under ett stereomikroskop med cirka 3 nL RNP-injektionsblandning.

Fem biologiska replikatinjektioner (varje replikat inkluderade 400–600 ägg injicerade med Cyp1A-RNP och 100–200 injicerade med SC-RNP) utfördes och alla mikroinjektioner genomfördes inom 60 minuter. Ägg placerades i 100 mm petriskålar av plast och inkuberades vid 28 grader i äggvatten. Överlevnadshastigheten för embryon övervakades i upp till 7 dagar.

Bilder av överlevande fiskar granskades för att bedöma missbildningar. Varje larv poängsattes på ett förblindat sätt för närvaron av 4 utvecklingsmissbildningar inklusive huvudmissbildning, svansmissbildning, hjärtödem och äggulaödem. Larver med alla 4 missbildningar skulle få 4 poäng, medan normalt utvecklande larver skulle få 0. Det statistiska T-testet användes för att utvärdera de signifikanta skillnaderna.

For more information:1950477648nn@gmail.com