Dietkakaoflavanoler förbättrar mitokondriell funktion i skelettmuskler och modifierar hela kroppens metabolism hos friska möss

för mer information kontakta:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt: Mitokondriell dysfunktion är allmänt rapporterad vid olika sjukdomar och bidrar till deras patogenes. Vi bedömde effekten avkakaoflavanolerkosttillskott på mitokondriell funktion och hela ämnesomsättningen, och vi undersökte om det mitokondriella deacetylaset sirtuin-3 (Sirt3) är inblandat eller inte. Vi undersökte effekterna av 15 dagars CF-tillskott i vildtyp och Sirt3-/möss. Helkroppsmetabolism utvärderades med indirekt kalorimetri och ett oralt glukostoleranstest utfördes för att bedömaglukosmetabolism. Mitokondriell andningsfunktion utvärderades i permeabiliserade fibrer och pyridinnukleotidinnehållet (NAD plus och NADH) kvantifierades. I den vilda typen modifierade CF-tillskott avsevärt hela kroppens metabolism genom att främja kolhydratanvändning och förbättrad glukostolerans. CF-tillskott inducerade en signifikant ökning av mitokondriell massa, medan betydande kvalitativ anpassning inträffade för att upprätthålla H2O2-produktion och cellulär oxidativ stress. CF-tillskott inducerade en signifikant ökning av NAD plus och NADH innehåll. Alla effekter som nämns ovan var trubbiga i Sirt3-7möss. Sammantaget stärkte CF-tillskott NAD-metabolismen som stimulerar sirtuins metabolism och förbättrad mitokondriell funktion, vilket sannolikt bidrog till den observerade metabolismens anpassning i hela kroppen, med en större förmåga att använda kolhydrater, åtminstone delvis genom Sirt3.

Nyckelord: kakaoflavanoler; NAD-metabolism; mitokondriell massa; glukosmetabolism; skelettmuskel

klicka för att få mer information

1. Introduktion

Mitokondrier är subcellulära organeller som är involverade i flera cellulära funktioner, såsom energitransduktion genom mitokondriell oxidativ fosforylering och i mitokondriell väteperoxidproduktion eller mitokondriemedierad celldödsaktivering [1-3]. Nya bevis tyder på att mitokondriell dysfunktion är involverad i många patologier och spelar en central roll i deras patogenes [4]. Vår grupp rapporterade mitokondriell försämring hos patienter med typ 1-diabetes långt före kliniska komplikationer [5]. Dessutom inträffar en minskning av mitokondriell oxidativ kapacitet med åldrande även hos friska människor [6]. Därför är identifiering av strategier för att mildra dessa dysfunktioner eller förbättra mitokondriell massa möjligheter att förhindra, eller åtminstone att minska, förekomsten av många störningar eller öka den aeroba kapaciteten hos friska försökspersoner.

I detta sammanhang är identifieringen av säkra och naturliga föreningar som förbättrar mitokondriell funktion och hela kroppens metabolism med eller utan begränsade biverkningar av intresse. Bland naturliga föreningar,kakaoflavanoler(CF) anses vara lovande molekyler eftersom deras konsumtion har visat sig positivt påverka kardiovaskulär hälsa, insulinresistens eller immunfunktion [7]. CF visade sig faktiskt förbättra glukosmetabolismen, och en kortvarig administrering av CF följs av en ökning av insulinkänsligheten, även hos glukosintoleranta hypertonipatienter [8,9].

Bland flavanolerna är (-)-epicatechin (EPI) den vanligaste monomeren i CF, och EPI anses vara den viktigaste biotillgängliga och bioaktiva molekylen av CF [10]. En konsekvent mängd bevis indikerar att EPI-tillskott förbättrar mitokondriell funktion och/eller innehåll i skelettmuskulaturen [11]. EPI-tillskott stimulerar flera vägar som konvergerar på peroxisomproliferatoraktiverad receptor-gamma-koaktivator 1-alfa(PGCl ) och viktiga nukleära transkriptionskomplex. EPI förbättrar direkt generering av kväveoxid, vilket stimulerar mitokondriell biogenes [11]. Samtidigt stimuleras sirtuinerna 1 och 3 också av EPI-tillskott [11]. Användningen av proantocyanidiner, oligomeraflavonoidersom innehåller EPI, visades öka de intracellulära nikotinamidadenindinukleotidnivåerna (NAD plus ) genom ökningen av flera prekursorer för NAD-biosyntes och uppreglera sirtuin-1 mRNA-nivåer i råttlever [12]. Sirtuinfamiljen (Sirt), ett NAD-beroende deacetylas, består av sju medlemmar som skiljer sig åt genom deras subcellulära distribution, substratspecificitet och cellulära funktioner [13]. Sirt1, en omfattande studerad medlem av denna familj, stimulerar mitokondriell biogenes genom att främja deacetylering av PGCl, och därigenom förbättra dess transkriptionella aktivitet [14]. Sirte, en viktig metabolisk sensor, stimulerades efter EPI-administrering [12,15-17]. EPI:s inverkan på andra sirtuiner har dock inte undersökts. Bedömningen av EPI-effekten kommer att vara särskilt intressant på sirtuiner belägna inom mitokondrierna (Sirt3, Sirt 4 och Sirt5), som är kända för att modulera aktiviteten hos Krebs-cykeln och enzymer i andningskedjan [18]. Sirt3, som uttrycks starkt i vävnader med hög metabolisk omsättning och mitokondrieinnehåll, är av särskilt intresse när det gäller dess avgörande roll för att upprätthålla normal mitokondriefunktion genom reversibel proteinlysindeacetylering [19-21]Dessutom spelar Sirt3 en viktig roll i reglering av hela kroppens metabolism [20. Sirt3 visades vara förändrad i skelettmuskulaturen i modeller av typ 1 och typ 2 diabetes och hjärt-kärlsjukdomar [22,23]. Dessutom föreslogs att aktivering av Sirt3 kan representera en lovande terapeutisk strategi för att förbättra mitokondriell funktion och metabolism [23,24]. Därför är det intressant att avgöra om Sirt3 ligger bakom en del av de fördelaktiga effekterna av CF-tillskott på hela kroppens metabolism och mitokondriell funktion.

I den här studien använde vi ett integrerat tillvägagångssätt för att undersöka effekten av ett 15-dagars CF-tillskott hos möss. Vi antog att CF-tillskottet skulle:(i) modifiera hela kroppens metabolism ochglukosmetabolism, (ii) öka mitokondriell funktion i oxidativ och glykolytisk muskel i permeabiliserade fibrer, och (ii) öka NAD-metabolism. Vi undersökte också den förmodade involveringen av Sirt3 i CF-inducerad mitokondriell biogenes och hela kroppens metabolism. Våra hypoteser var att CF:s effekter på hela kroppens metabolism och mitokondriell massa skulle bli trubbiga i Sirt3-7möss.

2. Metoder

2.1. Djur och kost

För denna studie köptes 129S1/SvlmJ 10-veckogamla möss av hankön från Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA). För att avgöra om sirtuiner är involverade i CF-administration-inducerad mitokondriell massa och funktionsanpassning, använde vi också 10-veckagamla Sirt3-hanmöss med knock-out av hela kroppen på samma stam som vildtyp [25]. Sirt3/mössen användes för att utforska involveringen av Sirt3 i CF-inducerad mitokondriell biogenes och hela kroppens metabolismanpassningar. Mössen hölls i ett rum vid en reglerad temperatur på 23-25 grader och kontrollerad belysning (12-h ljusa och mörka cykler). Djuren hade tillgång till gnagarfoder och kranvatten ad libitum.

Efter minst en veckas tillvänjning i djuranläggningen fick försöksdjur CF-tillskott genom oral sondmatning av ett naturligt extrakt (302,1 mg/kg kroppsvikt två gånger om dagen i 15 dagar) återsuspenderat i en karboximetylcellulosa (Sigma-Aldrich, St. Louis) , Mo, USA). Sammansättningen av kakaopulvret beskrivs i tabell 1 och har erhållits från Naturex (Quart de Poblet, Spanien). Sammansättningen har fastställts med högpresterande vätskekromatografimetoden och 100 mg av extraktet motsvarar i genomsnitt 475 mg torra kakaofrön. Kontrollmössen fick en bärare sammansatt av liknande innehåll av teobromin och koffein löst i karboximetylcellulosa genom oral sondmatning. Den dagliga dosen bestämdes enligt industrins vägledning som omvandlar humandosen till djurekvivalenta doser baserat på kroppsyta, och vi multiplicerade humandosen med 12,3 [26]. Den orala sondmatningen utfördes av en erfaren tekniker.

2.2. Vävnadssamling 1

Tjugofyra timmar efter den sista orala sondmatningen bedövades djur som inte hade fastat med användning av ketamin och xylazin (100 respektive 10 mg/kg). Insamling av vävnader utfördes omedelbart efter att anestesi uppnåtts. Soleus och den vita delen av gastrocnemius skars ut. Prover frystes antingen omedelbart i flytande kväve och lagrades i -80-grad för efterföljande analys eller användes för att förbereda hudmuskelfibrer.

2.3. Metabolisk och fysisk aktivitetsbedömning

Indirekt kalorimetri och spontan fysisk aktivitet mättes med hjälp av Comprehensive Laboratory Animal Monitoring System (CLAMS; Columbus Instruments, Columbus, OH, USA). Möss hölls individuellt i kamrarna vid 28 grader, med ljus från 07h00 till 19h00 och ad libitum tillgång till gnagarmat och kranvatten. Möss acklimatiserades till de metaboliska burarna i tre dagar före dag ett av datainsamlingen. Datainsamlingen utfördes på den femtonde dagen av kompletteringen. Syreförbrukning (VO2), koldioxidproduktion (VCO2) och respiratoriskt utbytesförhållande (RER) mättes med ett luftflöde på 0,5 L/min och en provluft på 0,4 L/ min. Procent relativ kumulativ frekvens (PCRF) av RER bestämdes över en 24-h period som tidigare beskrivits av Riachi et al. (2004). Kortfattat bestämdes PCRF genom tillägg av frekvensen för varje datapunkt till den föregående inkrementsekvensen (från 0,65 till 1,20 med ett inkrement på 0,01)[27]. Den metaboliska flexibiliteten bestämdes av Hill-lutningen (H-värdet) och den 50:e percentilen (EC50) av PRCF-kurvan och genom att mäta RER-amplituden över 24 timmar (Riachi et al.2004). Allmän fysisk aktivitet övervakades med hjälp av ett infraröd strålstyrt sensorsystem som detekterade x- och z-axelaktivitet. Både totala räkningar (varje gång en stråle bryts) och ambulatoriska räkningar (varje gång en ny stråle bryts) bedömdes. En X-total (X-TOT)-räkning registreras när djuret rör sig horisontellt mer än 0,5 tum och är representativt för småskaliga, repetitiva aktiviteter, såsom att klia och sköta. X-ambulatorisk räkning (X-AMB) mäter faktisk rörelse genom att registrera en räkning endast när djuret bryter en ny stråle. En Z-total (Z-TOT) räkning registreras när 1,5 tums vertikal rörelse inträffar, dvs. uppfödning (Abreu-Vieira 2016). För att uppskatta kolhydrater och fettoxidationfrån VO2 och VCO2 använde vi icke-protein respiratorisk kvottabell från Péronnet och Massicotte som tidigare använts i möss [28,29].

2.4. Total kropps- och fettmassa

Total fettmassa och total mager massa bestämdes i icke-bedövade möss genom kvantitativ resonansinterferensanalys med användning av EchoMRI-helkroppsmagnetresonansanalysatorn (Echo Medical System, Houston, TX, USA). Den totala fettmassan representerade summan av allt fett i kroppen. Total mager massa inkluderade främst muskler och inre organ. Det är känt att skelettmuskelmassa står för den största delen av den totala magra massan.

2.5. Oralt glukostoleranstest (OGTT)

Glykemi mättes med hjälp av en droppe blod som samlats upp från svansen med en glukometer (Accu-Chek Performa, Roche, Argentina). OGTT utfördes på möss som fastade i 5 till 6 timmar. Mätningen utfördes den sista dagen av CF-tillskott. Efter mätning av basal glykemi (tid O), injicerades mössen per os med en lösning av 20 procent glukos i sterilt vatten i en dos av 1,5 g glukos·kg kroppsvikt-1. Glykemi mättes vid 15, 30, 60, 90 och 120 minuter efter injektion av glukoslösningen. Den inkrementella arean av glukoskurvan beräknades sedan som ett mått på glukostolerans.

2.6.qRT-PCR-analys

The forward (F) and reverse (R) primers of the selected genes used in this study are presented in Table 2. Total RNA was obtained from pulverized frozen white gastrocnemius muscle using Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA). The purity, integrity, and quantity of RNA were evaluated using a microplate reader (Synergy H1(Biotek Instruments, Winooski, Vermont). The sample was considered pure when the ratio OD260/OD280 was>1.8. cDNA syntetiserades från totalt RNA (2 μL) med hjälp av iScript omvänd transkriptionssupermix för RT-qPCR (Biorad, Hercules, CA, USA). Totala RT-produkter analyserades genom kvantitativ polymeraskedjereaktion (PCR) med användning av 2x Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG enligt tillverkarens specifikationer (Invitrogen Lige Technologies, Burlington, Kanada). Cykling uppnåddes i en CFX96 cykler (Biorad, Hercules, Kalifornien; förhållanden: 95 grader C i 10 minuter och 40 cykler av 95 grader i 30 sekunder, 55 grader i 45 sekunder och 72 grader i 45 sekunder). I slutet av varje körning bekräftades frånvaron av primer-dimer-bildning och närvaron av ett unikt amplikon med användning av smältkurvan. Tröskelcykelvärdena (Ct) användes enligt 2-A△Ct-metoden för att analysera qPCR-data, med antingen ß-Actin eller HPRT1 som hushållsgen【30】. Kvantitativa RT-PCR-värden var relaterade till kontrollgruppens värden, som sattes till 1.

2.7. Enzymaktiviteter

Mätningen av den specifika aktiviteten hos elektrontransportkedjekomplex och citratsyntas utfördes spektrofotometriskt som tidigare beskrivits [31]. Pulveriserade frusna vita gastrocnemius-muskler (~30 mg) homogeniserades med en vibrerande mikropärlhomogenisator i 500 ul homogeniseringsbuffert (120 mM KCl, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA och 5 mg·mL-I av BSA , pH 7,4) följt av tillsats av 500 μL hypotont medium (25 mM kaliumfosfat och 5 mM MgCl, pH 7,2). Proverna underkastades sedan tre omgångar av frys-upptiningscyklerna i flytande kväve. Proverna centrifugerades under 10 minuter vid 600 x g vid 4 grader och supernatanten hölls på is tills analysen. Proteininnehållet bestämdes i supernatanten i tre exemplar med användning av ett Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Aktiviteten av citratsyntas (CS) bestämdes spektrofotometriskt vid 412 nm efter reduktionen av 2 mM 5,5'-ditio-bis(2-nitrobensoesyra) i närvaro av 0,1 mM acetyl -CoA och 12 mM oxaloättiksyra i 200 mM Tris-buffert (pH 7,4). Den rotenonkänsliga NADH-decylubikinonoxidoreduktas(komplex I)-analysen utfördes vid 340 nm med användning av acceptorn 2,3-dimetoxi-5-metyl-6-n-decyl-14-bensokinon （ 80 μM) och NADH som elektrondonator （200 μM） i 10 mM Tris-buffert (pH 8,0). Tillsatsen av 4μM rotenon användes för att kvantifiera den rotenonkänsliga aktiviteten. Aktiviteten hos cytokromoxidaset (komplex IV) utfördes vid 550 nm med användning av 10μM reducerat cytokrom c som donator och 2,5 mM n-dodecyl-ß-maltosid för att permeabilisera båda mitokondriella membranen i 100 mM kaliumfosfatbuffert.0pH.

Alla enzymanalyser bestämdes i tre exemplar, och resultaten var relaterade till kontrollgruppens resultat, som sattes till 100.

2.8. Mitokondriell bedömning

Mitokondriell andning och mitokondriell H2O2-produktion studerades in situ i saponinpermeabiliserade fibrer med hjälp av vita gastrocnemius- och soleusmuskler|1]. Kortfattat separerades fibrerna under binokulärt mikroskop i lösning A vid 4 grader (i mM:2,77 CaK2 EGTA,7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl2, 20 tauriner,0,5 DTT,5{ {50}} K-metansulfonater, 20 imidazoler, 5,7 Na2 ATP och 15 kreatinfosfat, pH 7,1) och permeabiliserades i lösning A med 50 ug·mL-I saponin i 30 minuter vid 4 grader. Mitokondriell andningsfunktion bestämdes i en oximeter utrustad med en elektrod av Clark-typ (Oxygraph, Hansatech Instruments, Glasgow). Kammaren fylldes med 1 ml lösning B (i mM:2,77 CaK, EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl,, 20 taurin, 0,5 DTT, 50 K-metansulfonater och 20 imidazoler, pH 7,1) och efter registrering baseline syrehalt i kammaren, ett knippe av 1-2 mg torrvikt av permeabiliserade myofibrer placerades i kammaren, som sedan förseglades. Efter baslinjeavläsningar gjordes följande tillägg sekventiellt: palmitoylkarnitin och malat (160 μM∶5 mM), glutamat (10 mM), succinat (25 mM), rotenon (0,5 μM） CC), antikopplaren (Cin) -A (8 uM) och N, N', N'-tetrametyl-p-fenylendiamin-dihydroklorid och askorbat (0,9:9 mM). Andningen mättes vid 23 grader under kontinuerlig omrörning. I slutet av varje test avlägsnades fibrerna försiktigt från den xylografiska cellen, blottades och torkades i minst 24 timmar vid ~80C för bestämning av fibervikten. O2-förbrukningshastigheter (JO2) uttrycktes i nmol O2 min-1.(mg torrvikt)-I. Alla mätningar utfördes åtminstone i duplikat.

Netto H2O2-frisättning av respirerande mitokondrier mättes i permeabiliserade fiberknippen med den fluorescerande sonden Amplex Red (20 μM∶excitation-emission∶563-587 nm), som beskrivits tidigare [32]. Efter beredning av permeabiliserade fibrer, prover

avsedda för H2O2-mätningar sköljdes tre gånger i buffert Z(i mM:110 K-Mes, 35 KCl,1 EGTA,5 K2HPO4, 3MgCl,6H2O och 0,5 mg:mL{ {14}} BSA, pH7,3 vid 4 grader). Fiberbuntar ({{20}}.3-1,0 mg torrvikt) inkuberades vid 37 grader i en kvartsmikrokyvett med kontinuerlig magnetisk omrörning i 600 uL buffert Z (pH 7,3 vid 37C) kompletterat med 1,2 U·mL-I pepparrotsperoxidas. Baslinjefluorescensavläsningar gjordes i frånvaro av några exogena respiratoriska substrat. Följande tillsatser gjordes sedan sekventiellt: glutamat (5 mM), succinat (5 mM), rotenon (0,5 uM), ADP (10 mM) och antimycin-A (8 μM). Vid slutet av varje test var fibrerna avlägsnades försiktigt från kyvetten, torkades och torkades för att bestämma fibervikten. Hastigheter för H2O2-produktion uttrycktes i AU·min-1.(mg torrvikt)-I och per oxphos-kapacitet, vilket motsvarade den maximala mitokondriella andningen under fosforyleringstillstånd. Alla mätningar utfördes åtminstone i duplikat.

Mitokondriell kalciumretentionskapacitet (CRC) bedömdes i vita gastrocnemius muskelspökfibrer som tidigare beskrivits [33]. Kortfattat inkuberades fibrer i en kvartsmikrokyvett under kontinuerlig omrörning i 6 00 μL CRC-buffert (i mM∶250 sackaros, 10 MOPS, 0,005 EGTA och 10P;-Tris, pH7,3). Fibrer exponerades sedan för en enda puls på 20 nM Ca2 plus. Förändringar i extramitokondriell kalciumkoncentration övervakades fluorometriskt med användning av kalciumgrönt 5N (1 mM: excitation-emission: 505-535 nm). Permeability transition pore susceptibility (PTP) bedömdes genom att mäta den tid som krävs för PTP-öppning, och CRC togs som den totala mängden Ca' som ackumulerats av mitokondrier innan dess frisättning. Vid slutet av varje test avlägsnades fibrerna försiktigt från kyvetten, blottades och torkades för att bestämma fibervikten. CRC-värden uttrycktes i nM Ca2 plus per mg torrvikt.

2.9. Western blot-analys

Proteiner från vita gastrocnemius- och soleus-muskler späddes i Laemmli-buffert och separerades på Mini-PROTEAN TGX fläckfria 10 procent prefabricerade polyakrylamidgeler (Biorad); en intern standard laddades på varje gel. Elektroforetisk separation gjordes vid 200 V under 35 minuter i migreringsbuffert (25 mM TrisBase, 0.2 M glycin och 1 procent SDS (p/v)). Fläckfri (SF)-teknologi innehåller en egenutvecklad tri haloförening som reagerar med proteiner, vilket gör dem detekterbara genom UV-exponering. SF-avbildning utfördes med ChemiDoc MP Imager och Image Lab4.0.1-programvara (Biorad, Hercules, Kalifornien, USA) med en 5-minst färgaktiveringstid, och totala proteinmönster visualiserades därför. Proteiner överfördes sedan på ett 0,2 um nitrocellulosaark med användning av Trans-Blot Turbo Transfer System (Biorad). Kvaliteten på överföringen kontrollerades genom avbildningsmembran med användning av SF-teknik. Efter överföringssteget derivatiserades karbonylproteinerna med dinitrofenylhydrazin utspädd i 2N HCL och tvättades slutligen noggrant med metanol. Membranen blockerades med 5 procent fettfri torrmjölk i Tris-buffrad koksaltlösning innehållande Tween-20 (TBST:15 mM Tris/HCl, pH7,6,140 mM NaCl och 0,05 procent Tween-20) för 1 h vid rumstemperatur. Membran inkuberades sedan vid 4 grader över natten eller 2 timmar vid rumstemperatur med följande primära antikroppar: primära proteinkarbonylantikroppar (Anti-DNP;#STA-308, Cell Biolabs) och SOD2 (#Ab13533, Abcam). Efter tre 10 minuters tvättar i TBST undersöktes membranen med sekundära antikroppar för proteinkarbonyl (HRP-konjugat; #STA-308, Cell Biolabs) och SOD2 (anti-kanin IgG-HRP länkad; #7074, cellsignalering) i blockeringslösning i 2 timmar vid rumstemperatur och tvättades slutligen noggrant med TBST. Spädningen av primära och sekundära antikroppar optimerades för varje antikropp. Kemiluminescensdetektion utfördes med ECL Clarity (Biorad), och bildfångst gjordes med ChemiDocMP. Alla bilder analyserades med hjälp av programvaran Image Lab 4.0.1. Normalisering av proteinsignalintensiteter utfördes efter kvantifiering av respektive totala proteinnivåer på SF-bilder, provkontroll och interna standarder.

2.10. NAD-mätning

Totala NAD- och NADH-nivåer mättes i homogeniserad vit gastrocnemius med hjälp av ett kommersiellt kit (#K337-100, Biovision, USA) och enligt tillverkarens instruktioner. Kortfattat, den totala poolen av NAD (NADt= NADt och NADH) extraherades. För vart och ett av de extraherade proverna värmdes hälften av provet till 60 grader i 30 minuter för att sönderdela NADt samtidigt som NADH hölls intakt. Både NADt- och NADH-prover blandades med NAD-cykelenzym och absorbansen mättes vid 450 nm. NADt och NADH kvantifierades genom att jämföra med NADH-standardkurvan och normalisera till mg protein. Slutligen beräknades förhållandet mellan NAD plus (NADt-NADH) och NADH. Alla analyser utfördes i triplikat.

2.11. Statistik

Data rapporteras som medelvärde ± standardavvikelse (SD). Datanormalitet bedömdes med användning av D'Agostino-Pearsons normalitetsteste. Dataanalys utfördes med hjälp av Students t-test och tvåvägs ANOVA (grupp och tid) för upprepade mätningar följt av Bonferronis post hoc-test med Prism8.4.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). En dubbelsidig nivå på 5 procent för typ I-fel tillämpades.

3. Resultat

3.1. Kroppssammansättning och metabolism i hela kroppen

Femton dagars CF-tillskott, i vildtyp(WT)möss, ändrade inte kroppsvikten(p=0.091), mager massa(p=0.{{24} }73) och fettmassa bedömd med EchoMRI (p=0.89;Figur 1A). O2-konsumtionen uttryckt per mager massa var signifikant högre i den mörka cykeln (8±8 procent , p=0.042), medan den förblev liknande i den ljusa cykeln (p =0 .392; Figur IB.). Det fanns inga förändringar i rörelseaktiviteten (data visas inte). CF-möss visade en signifikant ökning av hela kroppens energiförbrukning med 15±15 procent (p =0.042;Figur 1C)och i födointag (0,08±0,01 vs.0,11±0,01 g per mager kroppsvikt, respektive CF-grupp och WT, p=0.013, figur 1D).

CF-tillskott modifierade avsevärt hela kroppens metabolism: den huvudsakliga effekten av högre RER i CF-gruppen observerades under 24 timmar(p=0.023, figur 2A) och genomsnittlig RER över 12 timmar var högre i CF-gruppen i ljusa och mörka cykler( plus 5±3 procent ,p=0.035 respektive plus 9±4 procent , p=0.026). Dessutom främjade CF-tillskott användning av kolhydrater (CHO) (51± 13 procent av energiförbrukningen berodde på CHO-oxidation i CF-gruppen mot 37 ±12 procent i kontrollgruppen under ljuscykeln, p=0.108 och 71±21 procent i CF-gruppen mot 47±24 procent i kontrollgruppen under den mörka cykeln, p=0.004; Figur 2B.). Men när uttryckt i kJ fanns det ingen skillnad i CHO-oxidation eller fettsyraoxidation (CHO-oxidation: 3,7±1,4 kcal·d-1 i kontroll vs.4,4±1,7 kcal.mager kroppsmassa-1. d-1 i CF,p=0.33 och fettsyraoxidation: 2.3± 1.0 kcal·d-Iin kontroll vs.2.6±0.87 kcal.mager kroppsmassa-1.d{{ 50}}i CF,p=0.608). Analys av PRCF av RER visade en ökning av EC50-värden i CF-gruppen (p=0,009; figur 2D) vilket betyder att CF inducerar en förändring mot ökad användning av kolhydrater. En minskning av Hill-lutningen observerades i CF-gruppen (H-värden: 25,16±4,44 hos kontroller vs. 12,79±3,96 i CF-gruppen, p<0.001). moreover,="" the="" rer="" amplitude="" over="" 24h="" was="" increased="" by="" 31±="" 31%="" in="" the="" cf="" group="" (p="0.035)." cf="" supplementation="" improved="" glucose="" tolerance="" following="" oral="" glucose="" administration="" from="" unchanged="" baseline="" blood="" glucose="" levels="" after="" an="" overnight="" fast="" (figure="" 2e,p="0.003)." the="" area="" under="" the="" capillary="" blood="" glucose="" curve="" was="" lower="" in="" the="" cf="" group(1018±135="" vs.="" 1181±="" 170="" mm·120="" min,="" p="0.005;" figure="">

3.2. Mitokondriell bioenergetik

Vi testade effekten av CF-tillskott på energin hos mitokondrier i den vita gastrocnemius- och soleusmuskeln i WT-möss. Högre mitokondriell andning med hjälp av komplexa IV-substrat i de vita gastrocnemius- och soleusmusklerna observerades (p=0.004 respektive p=0.028; figur 3A, B). Ingen modifiering av CII/CI- och CIV/CI-respirationsförhållandena observerades (p =0.899 och p =0.701 för den vita gastrocnemius och p=0.693 och p{{ 11}}.912 för soleusmusklerna, data visas inte). Dessutom ökade komplex-, I-, IV- och citratsyntasaktiviteter signifikant i den vita gastrocnemius-muskeln (respektive: plus 31 ± 27 procent ,p=0.004; plus 28 ± 38 procent ,p=0 .027; plus 35±38 procent ,p= 0.009; plus 14±13 procent ,p=0.040;Figur 3C). Mitokondriernas förmåga att oxidera palmitoylkarnitin tenderar att öka i den vita gastrocnemius (plus 24±12 procent ,p =0.096; figur 3D), medan ingen skillnad observerades i soleus (p =0.363). De relativa frekvenserna av palmitoyl-karnitin-stimulerad andning var oförändrade när den uttrycktes som funktion av komplex I-andning (62±11 i kontrollgruppen mot 64±20 i CF-gruppen i den vita gastrocnemius och 70 ± 18 vs. 72± 16 i soleus). Därefter undersökte vi känsligheten för Ca plus-inducerad PTP-öppning i den vita gastrocnemius. Som visas i figur 3E modifierades varken tiden till PTP-öppning eller Ca²-retentionskapaciteten efter CF-tillskott (p=0.608 respektive p=0.943).

mRNA-bedömning av gener involverade i mitokondriell biogenes visade en 70-procentig uppreglering av NRF1-mRNA, medan ingen skillnad rapporterades för PGCl , Tfam, CS, ND1, ND2, SDHa och Cox2 (tabell 3). Vi undersökte, på några prover, effekten av CF-tillskott på mitokondriella superkomplex (Figur S1, kompletterande material). Den densitometriska analysen tyder på att CF-tillskott ökade det totala innehållet av superkomplex utan kvalitativ anpassning eller omarrangemang. Faktum är att andningsdensiteten förbättrades med 58 procent med användning av komplex I- och komplexⅡ-prober och med 93 procent med användning av komplex I-prob. På liknande sätt var komplex I- och komplex III-innehåll inbäddade i superkomplex högre i CF-gruppen.

CF-tillskott sänker mitokondriell ROS-emission. Medan H2O2-emissionen förblev oförändrad både i den vita gastrocnemius och soleus när den uttrycks per torrvikt (Figur 4A, B, respektive), minskade hastigheterna när de uttrycks per mitokondrieinnehåll (Figur 4C). En huvudsaklig positiv effekt av CF-tillskott observerades under olika tillstånd i den vita gastrocnemius (s<0.048; figure="" 4c).="" the="" mitochondrial="" h2o2="" emission="" was="" also="" significantly="" reduced="" when="" expressed="" peroxidative="" phosphorylation="" capacity="" assessed="" by="" state="" 4="" respiration="" using="" complex="" i+ii="" substrates="" by="" 26±13%="" in="" the="" white="" gastrocnemius="" (p="0.044)and" by="" 29±12%="" in="" the="" soleus(p="0.024;" figure="">

3.3. Oxidativa stressmarkörer i skelettmuskulaturen

Den cellulära proteinoxidativa stressnivån i WT-möss påverkades inte av CF-tillskott eftersom det cellulära innehållet av SOD2 var liknande i experiment- och kontrollgrupperna i den vita gastrocnemius och soleus (Figur 4E). Dessutom observerades ingen skillnad i proteinkarbonylering i den vita gastrocnemius och soleus (Figur 4F). Dessutom observerades ingen skillnad i katalas- och MnSod-mRNA-uttryck efter CF-tillskott (tabell 3).

3.4.NAD Metabolism

Den totala poolen av pyridinnukleotider ökade efter CF-tillskott med 36±33 procent (p=0.012). Närmare bestämt ökade NAD- och NADH-innehållet i den vita gastrocnemius (med 69±60 procent respektive ,p{{6 }}.026 och 29± 42 procent ,p=0.017;Figur 5A,B)och NAD plus/NADH-förhållandet tenderade att öka i CF-gruppen (p =0.084).Nej signifikant effekt observerades för Sirt3-mRNA (p=0.096), NMNAT-mRNA (p=0.094) och Sirt1-mRNA(p =0.869; Tabell 3 ).

3.5. Helkropps- och cellmetabolismsvar efter CF-tillskott i Sirt3-/möss

Vi undersökte effekten av CF-tillskott hos Sirt{{0}}möss. Kroppssammansättning som vikt, mager massa och fettmassa skilde sig inte mellan CF- och kontrollgrupperna (p= 0.52,p=0.66,p=0.45, respektive; Figur 6A). På liknande sätt påverkades den dagliga energiförbrukningen opåverkad av CF-tillskott ({{10}}.38±0.{{40}}1 Kcal.mager kropp massa-1.dag-1 i kontrollerna kontra 0.39 ± 0.01 Kcal·lean body mass-1.day-1 i CF, p=0.502; Figur 6B). RER var likartad mellan båda grupperna i ljus- och mörkercyklerna (p=0.301; Figur 6C), och substratoxidation påverkades inte av CF-tillskott (44 ± 17 procent av energiförbrukningen berodde på CHO-oxidation i kontrollgrupp kontra 50 ± 11 procent i CF-gruppen under den ljusa fasen, p=0.209 och 65±19 procent i kontrollgruppen vs. 77±21 procent i CF-gruppen under den mörka fasen, p=0.395; Figur 6D). Den metaboliska flexibiliteten bedömd med RER-amplitud under 24 timmar förblev likartad mellan de två grupperna (0,19± 0,05 i kontroll vs.0,20±0,03 i CF,p=0.604), medan PRCF-lutningen minskade i CF-gruppen (H-värden:17,77±4,38 i kontroll vs.12,79±3,93 i CF,p=0.039).

Därefter jämförde vi effekten av CF-tillskott på mitokondriella enzymaktiviteter. CF-tillskott misslyckades med att öka enzymaktiviteten hos komplex I,I,IV och CS i Sirt3-/möss som tidigare observerats i WT (respektive: p=0.623,p=0 .629,p=0.283 och p=0.791, figur 6E). Större enzymaktivitet av komplex och IV observerades i WT jämfört med Sirt3-7möss efter CF-tillskott ( respektive:p=0.027 och P=0.045)

4. Diskussion

I denna studie ger vi en integrerad analys av effekten av CF-intag. Vi observerade att kronisk CF-intag förbättrade mitokondriell andning och minskade H2O2-produktion, bedömd i deras myofibermiljö, medan känsligheten för PTP-öppning var oförändrad. CF-intag förbättrade NADmetabolism, vilket stödde involveringen av sirtuin-vägar på de observerade mitokondriella anpassningarna. Vi observerade också förändringar i hela kroppens metabolism mot en större förmåga att använda kolhydrater som huvudsubstrat, vilket tyder på att mitokondriella anpassningar sannolikt bidrog till den observerade anpassningen av hela kroppens metabolism.

4.1.Metabolism

Dietadministrering av kakaoflavanoler har identifierats som en effektiv strategi för att lindra glukosintolerans, vilket ger möjligheter att lindra metabola sjukdomar [34]. Våra resultat är i enlighet med tidigare studier som rapporterade en ökad glukostolerans efter flavanolintag [35,36]. De mekanismer som föreslås för denna effekt involverar en ökning av translokationen av GLUT4 mot cellmembranet, en ökning av fosforyleringen av AMPK och uppregleringen av UCP-2-genuttrycket i skelettmuskeln [8,37] . Dessutom var CF-intag associerat med insulinkänslighetsförbättring hos människor[8]. Efter 15 dagars konsumtion av mörk choklad observerades en minskning av homeostasmodellens bedömning av insulinresistensindex hos friska försökspersoner samtidigt med en ökning av det kvantitativa kontrollindexet för insulinkänslighet och insulinkänslighetsindexet [8]. Vi observerade också en åtföljande ökning av glukostolerans och metabolisk flexibilitet hos WT-möss, vilket hänvisar till en organisms förmåga att anpassa bränsleoxidation till bränsletillgänglighet [38]. Intressant nog, medan försämrad mitokondriell oxidativ kapacitet och relaterade substratoxidation var associerade med insulinresistens 39, ökade uthållighetsträning mitokondriellt innehåll, insulinkänslighet och metabolisk flexibilitet [38]. Därför är föreliggande resultat specifika för CF-tillskott och påverkas inte av spontan aktivitet.

Den positiva effekten av CF på metabolisk flexibilitet, såväl som ökningen av mitokondriella komplexaktivitet, avtrubbades i Sirt3-7möss, vilket indikerar att de positiva effekterna av CF inträffar åtminstone delvis genom Sirt3. Dessa resultat stöder tidigare fynd och Sirt3s centrala roll för reglering av metabol flexibilitet [24]. Våra resultat tyder på att en ökning av mitokondriell funktion kan förbättra metabolisk flexibilitet. Men förutom mitokondriell funktion identifierades också den basala andningskvoten, glukosavfallshastigheten, fettvävnadslipidlagringskapaciteten och plasmakoncentrationen av fria fettsyror som avgörande faktorer för metabol flexibilitet och bör övervägas [40]. Framtida studier bör bedöma de cellulära bestämningsfaktorerna för metabol flexibilitet djupare för att fördjupa vår förståelse av de underliggande orsakerna till förbättring av metabol flexibilitet efter CF-tillskott.

Helkroppsmetabolismens bedömning avslöjade en ökning av den relativa CHO-oxidationen efter CF-tillskott. Detta resultat står i kontrast till en tidigare studie som rapporterade en ökning av lipolys efter ett akut intag av flavanoler eller två veckors tillskott med flavan-3-oler hos möss [36]. Förutom skillnaderna i extraktsammansättningen kan dessa motsägelsefulla fynd vara resultatet av de pleiotropa effekterna av NO. Det är väl accepterat att CF-intag stimulerar produktionen eller biotillgängligheten av NO-metabolism [7]. Å ena sidan stimulerar NO glukostransport och upptag i skelettmuskulaturen. Stimulering av NO-produktion i cellinjehärledda myotuber av insulin eller väteperoxid resulterade i en ökning av GLUT4-translokation, som reducerades med nNOS-hämning [41]. Dessutom kan NO öka glukostransporten i en insulinoberoende väg som leder till en ökning av nivåerna av cyklisk GMP och AMPK [42], vilket främjar glukosoxidation i råttans skelettmuskel oberoende av fettsyratillgänglighet och oxidation [43]. Å andra sidan främjar NO fettsyraoxidation genom att minska nivån av malonyl-CoA via hämning av acetyl-CoA-karboxylas och aktivering av malonyl-CoA-dekarboxylas i skelettmuskulaturen[44]. Medan vi observerade en förskjutning mot en lägre relativ andel för att använda fettsyra som substrat med CF, fanns det ingen skillnad vad gäller de absoluta värdena uttryckta i kJ. Detta tyder på att ökningen i energiförbrukning som observeras med CF-tillskott beror på en ökning av glukosoxidation. Därför stödjer dessa resultat idén att CF-konsumtion ökar insulinkänsligheten och främjar glukosoxidation utan att samtidigt påverka fettsyraoxidationskapaciteten. Dessa resultat väcker frågan om relevansen av att använda kakaoflavanoler i samband med en diet med hög fetthalt. Framtida studier bör utvärdera en möjlig skadlig effekt av ett samband mellan CF-tillskott och en fettrik kost.

4.2.Mitokondriell funktion

Dietadministrering av kakaoflavanoler har visat sig förbättra mitokondriell funktion, inklusive (i) mitokondriell andning och enzymaktiviteter i elektrontransportkedjan; (i) mitokondriell H2O2-frisättning, vilket återspeglar produktionen av mitokondriellt reaktiva syrearter (ROS); och (i)mitokondriell kalciumretentionskapacitet som återspeglar känsligheten för mitokondriell permeabilitetsövergångspor (mPTP) öppning (för granskning se [11]. Våra resultat är i överensstämmelse med tidigare studier, men vår studie var dock den första som utvärderade effekten av CF-tillskott på mitokondriell funktion bedömd in situ i permeabiliserade fibrer och i olika muskeltyper Till skillnad från tidigare studier på isolerade mitokondrier, bevarar bedömningen av mitokondriell funktion i permeabiliserade fibrer mitokondriell morfologi, funktionella interaktioner med andra intracellulära komponenter [1] och undviker mitokondriell struktur störningar under den mitokondriella isoleringsprocessen [32] Därför är det viktigt att studera mitokondriell funktion i vävnadspreparat där mitokondriella strukturen bevaras och hela mitokondriella poolen är representerad för att bättre utvärdera svaret på behandlingen.

Tidigare studier utförda i cellodling eller in vivo på möss har visat att tillskott med EPI, som anses vara den huvudsakliga bioaktiva molekylen i CF, ökar maximal ADP-stimulerad andning (t.ex. tillstånd 3-andning) när mitokondrier får energi med en kombination av energi substrat som matar olika platser längs andningskedjan [45-49]. I enlighet med dessa resultat observerade vi en huvudeffekt av CF-tillskott på mitokondriell andning i oxidativa och glykolytiska muskler. För att avgöra om denna ökning är relaterad till en mitokondriell massökning eller ombyggnad av mitokondriella andningskomplex, bedömde vi mitokondriella superkomplex från quadricepsmuskeln. Dessa supramolekylära strukturer tros minska ROS-produktion, stabilisera eller hjälpa till vid sammansättningen av individuella komplex, reglera aktiviteten i andningskedjan och förhindra proteinaggregation i det proteinrika inre mitokondriella membranet [50-52]. Trots ett begränsat antal åtgärder tyder den visuella analysen av resultaten (Supplementary Materials) på att CF-tillskott inducerar en ökning av mitokondriell massa, vilket återspeglas av en ökning av alla superkomplexa arter, snarare än specifika andningskedjans komplexa omorganisationer. Sammantaget tyder dessa resultat på att CF främjar en mitokondriell massökning utan kvalitativ anpassning av andningskedjans komplexa arrangemang.

Under mitokondriell andning bildas varierande mängder superoxid och kan metaboliseras för att bilda andra typer av ROS [53]. Även om överdriven ROS-produktion från mitokondrier är involverad i ett brett spektrum av patologier, kan låga fysiologiska koncentrationer av ROS ha fördelaktiga effekter, såsom att skydda mot smittämnen och delta i cellulär signalering [2,54]. Tidigare studier utförda in vivo på gnagare och människor och cellodlingsmodeller rapporterade fördelaktiga CF-tillskottseffekter på ROS-produktion och olika antioxidantsystem [11]. Till exempel ökar oral sondmatning med EPI under 15 dagar SOD2 och katalasaktivitet i mus quadricepsmuskler [17]. Även om mitokondriell ROS-produktion inte har utvärderats allmänt, observerade vi att ROS-produktionsnivåer var liknande när värden uttrycktes per muskelvikt, medan produktionen sänktes när den uttrycktes per mitokondriell massa, vilket tyder på att kvalitativa anpassningar inträffar för att upprätthålla de fysiologiska koncentrationerna av ROS. Dessutom observerade vi ingen effekt av CF på SOD2 eller ROS-inducerade skador bedömda genom proteinkarbonylering. Även om CF förbättrar antioxidantproteinpooler, inklusive allmänt rapporterade SOD2- och katalasnivåer [16,17,55], var denna anpassning inte alltid associerad med en minskning av ROS-inducerade skador [56-59]. Dessa data stöder teorin att låga nivåer av ROS-produktion krävs för normal cellhomeostas [2]. Sammantaget tyder dessa resultat på att, samtidigt med en ökning av mitokondriell massa, främjar CF kvalitativa mitokondriella anpassningar för att förbättra dess antioxidantkapacitet och bibehålla låga nivåer av ROS-produktion.

4.3.Mitokondriell biogenes

Mitokondriell massa är resultatet av samspelet mellan mitokondriell biogenes och mitofagi. Vår studie fokuserade på mitokondriell biogenes aktiverad av polyfenolkonsumtion [60]. Mitokondriell biogenes är den cellulära process som förbättrar mitokondriell massa. Denna komplexa och mycket reglerade process involverar flera transkriptionsfaktorer, nukleära hormonreceptorer och transkriptionskoaktivatorer som verkar kollektivt för att koordinera förändringar i uttrycket av nukleära och mitokondriella DNA-kodade gener [61]. Tidigare studier har försökt identifiera vilka vägar som kan ligga bakom CF-tillskottsinducerad mitokondriell biogenes. Stimulering av NO-beroende signalering har dykt upp som en central väg involverad i mitokondriell biogenes. CF-tillskott ökar genereringen av NO genom att hämma det argininnedbrytande enzymet arginas, vilket ökar tillgängligheten av L-arginin för NO-biosyntes [62,63]. Dessutom, med hjälp av en eNOS-hämmare, var den stimulerande effekten av epikatekin på mitokondriell biogenes delvis trubbig [17]. Dessa resultat tyder på involvering av andra signalvägar för att stimulera mitokondriell biogenes.

Nyligen har Aragones et al. (2016) rapporterade att dietära proantocyanidiner, medlemmar av polyfenolfamiljen, ökar leverns NAD plus metabolism genom att förbättra de now o NAD plus biosyntesvägen och Sirte-aktiviteten på ett dosberoende sätt hos råttor[12]. Vidare exporterar levern NADt-prekursorer till andra organ, såsom skelettmuskulatur, som har en lägre kapacitet att syntetisera NAD, vilket ökar möjligheten att utöka de effekter som observeras i levern till hela organismen [64]. Medan vissa studier rapporterade en effekt av CF-tillskott på Sirt1-proteininnehåll, aktivitet eller mRNA [12,15-17,65,66], involverade NAD-metabolism i mitokondriell biogenes efter CF-tillskott med förlust eller ökning av Funktionen har aldrig testats. Medan en muskelspecifik knock-out skulle ha varit att föredra framför Sirt3 KO-mössen för hela kroppen som användes i vår studie, tyder våra resultat på att CF förbättrar NAD-metabolismen, och Sirt3 är involverad i denna tillskottsinducerade mitokondriella elektrontransportkedjans aktivitetsförbättring. De positiva effekterna som observerades på mitokondriella komplexaktivitet efter CF-supplementering observerades inte med Sirt3-7möss och en större aktivitet av komplex I- och IV-aktiviteter observerades efter CF-tillskott endast i WT. Dessa observationer utökar tidigare arbeten som visar att Sirt3 spelar en central roll i mitokondriell funktion ]67. Sammantaget tyder dessa fynd på att sirtuiner, genom modulering av NAD-metabolism, är involverade i förbättring av mitokondriell massa som observerats efter CF-tillskott. 4.4.Begränsningar

Kakaobönor är sammansatta av en blandning av monomera, oligomera och polymera flavanoler. Bland flavanolerna verkar EPI vara den vanligaste polyfenolmonomeren som finns i kakaoprodukter, som representerar upp till 35 procent av polyfenolhalten [68]. EPI etablerades som den huvudsakliga bioaktiva molekylens underliggande fördelar förknippade med kakao- och chokladtillskott [47,69]. Emellertid kan EPI-metaboliter (EPIm) vara involverade i de EPI-inducerade biologiska effekter som observerats in vivo-studier. EPIm kan nå högre plasmakoncentrationer än EPI[70]. Dessutom observerades stora skillnader i EPIm mellan arter. Faktum är att 80 procent av EPIm som finns hos människor detekterades inte hos råttor, medan likheten mellan möss och människor visade sig vara något mer gynnsam eftersom de två stora mänskliga metaboliterna upptäcktes [70]. Vi använde berikat CF-extrakt innehållande upp till fem gånger mer EPI än ojästa kakaobönor[71]. Dessutom minskade EPI-halten med 10-20 procent genom jäsning och minskade på ett temperaturberoende sätt under rostning [71,72]. Sammantaget tyder dessa data på att uppmärksamhet endast bör ägnas åt EPI-innehållet när man bedömer fördelarna med EPI-tillskott på människors hälsa, och de nuvarande resultaten bör övervägas med försiktighet innan man extrapolerar de observerade underliggande mekanismerna hos människor.

5. Slutsatser

Dagligt CF-tillskott under 15 dagar leder till förbättringar av mitokondriernas funktion i oxidativa och glykolytiska muskler. De nuvarande resultaten tyder på att den ökade mitokondriella andningen resulterar i en ökning av mitokondriell massa medan den cellulära nivån av ROS-produktion bibehölls, vilket tyder på kvalitativa anpassningar inom mitokondrierna. Samtidigt med den cellulära effekten på NO-metabolism som tidigare beskrivits [73], modulerar CF NAD-metabolism, vilket stimulerar sirtuins aktivitet. Sirt3 spelar en central roll i mitokondriella anpassningar och metabolisk flexibilitet efter CF-tillskott. Eftersom sirtuiner är nya mål i olika sjukdomspatogeneser, såsom diabetes eller astma [74,75l, kommer ytterligare studier att utforska det potentiella intresset av att använda CF som en naturlig aktivator av sirtuiner.

Referenser

1. Kuznetsov, AV; Veksler, V.; Gellerich, FN; Saks, V.; Margreiter, R.; Kunz, WS Analys av mitokondriell funktion in situ i permeabiliserade muskelfibrer, vävnader och celler. Nat. Protoc. 2008, 3, 965–976. [CrossRef]

2. Sena, LA; Chandel, NS Fysiologiska roller för mitokondriella reaktiva syrearter. Mol. Cell 2012, 48, 158–167. [CrossRef]

3. Wacquier, B.; Combettes, L.; Van Nhieu, GT; Dupont, G. Interplay Between Intracellular Ca2 plus Oscillations och Ca2 plus -stimulerad mitokondriell metabolism. Sci. Rep. 2016, 6, srep 19316. [CrossRef]

4. Suomalainen-Wartiovaara, A.; Battersby, BJ Mitokondriella sjukdomar: Bidraget från organellstresssvar till patologi. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2018, 19, 77–92. [CrossRef]

5. Heyman, E.; Daussin, F.; Wieczorek, V.; Caiazzo, R.; Matran, R.; Berthon, P.; Aucouturier, J.; Berthoin, S.; Descatoire, A.; LeClair, E.; et al. Syretillförsel och användning av muskler vid typ 1-diabetes, från omgivande luft till mitokondriella andningskedjan: Finns det ett begränsande steg? Diabetesvård 2020, 43, 209–218. [CrossRef]

6. Daussin, FN; Boulanger, E.; Lancel, S. Från mitokondrier till sarkopeni: roll för inflammation och RAGE-ligandaxelimplikation. Exp. Gerontol. 2021, 146, 111247. [CrossRef] [PubMed]

7. Katz, DL; Doughty, K.; Ali, A. Kakao och choklad i människors hälsa och sjukdomar. Antioxid. Redoxsignal. 2011, 15, 2779–2811. [CrossRef] 8. Grassi, D.; Lippi, C.; Necozione, S.; Desideri, G.; Ferri, C. Kortvarig administrering av mörk choklad följs av en signifikant ökning av insulinkänsligheten och en minskning av blodtrycket hos friska personer. Am. J. Clin. Nutr. 2005, 81, 611–614. [CrossRef] [PubMed]

9. Grassi, D.; Desideri, G.; Necozione, S.; Lippi, C.; Casale, R.; Properzi, G.; Blumberg, JB; Ferri, C. Blodtrycket är sänkt och insulinkänsligheten ökad hos glukosintoleranta, hypertensiva patienter efter 15 dagars intag av mörk choklad med hög polyfenol. J. Nutr. 2008, 138, 1671–1676. [CrossRef]

10. Ottaviani, JI; Mamma, TY; Heiss, C.; Kwik-Uribe, C.; Schroeter, H.; Keen, CL Den stereokemiska konfigurationen av flavanoler påverkar nivån och metabolismen av flavanoler hos människor och deras biologiska aktivitet in vivo. Fri radikal. Biol. Med. 2011, 50, 237–244. [CrossRef] [PubMed]