Upptäckten av nya STING-hämmare baserade på strukturen hos musen STING-agonist DMXAA

Abstrakt:

Stimulator-of-interferon-genen (STING)-proteinet är involverat i medfödd immunitet. Läkemedlet DMXAA (5,6-dimetylxantenon-4-ättiksyra) visade sig vara en potent murin-STING (mSTING)-agonist men hade liten effekt på human-STING (hSTING). I detta dokument bygger vi på jämförelsen av olika kristallstrukturer och analys av protein-ligandinteraktionsrelationer för att våga hypotesen att läkemedelsdesignen av DMXAA-varianter har potentialen att omvandla STING-agonister till inhibitorer. Baserat på vår tidigare upptäckt av två DMXAA-analoger, 3 och 4 (båda kunde binda till STING), optimerade vi dem strukturellt och syntetiserade nya derivat. I bindningsanalyser fann vi att föreningarna 11 och 27 representerade STING-bindare som var överlägsna de ursprungliga strukturerna och diskuterade struktur-aktivitetsförhållandena. Alla målföreningar var inaktiva i cellulära analyser för screening av STING-agonistisk aktivitet. Glädjande nog identifierade vi 11 och 27 som STING-hämmare med mikromolär aktivitet i både hSTING- och mSTING-vägar. Dessutom hämmade 11 och 27 induktionen av interferon och inflammatoriska cytokiner aktiverade av 20 3 0 -cGAMP utan uppenbar cytotoxicitet. Dessa fynd bryter det stela tänkandet att DMXAA tillhandahåller den strukturella basen specifikt för STING-agonister och öppnar för fler möjligheter för att utveckla nya STING-agonister eller -inhibitorer.

cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret

Nyckelord:

STING; DMXAA; artselektivitet; STING-agonist; STING-hämmare

1. Introduktion

Stimulatorn-av-interferon-genen (STING) är en viktig signalmolekyl för inneboende immunitet, främst förmedlar cytoplasmatiska DNA-inducerade naturliga immunsvar [1]. När DNA-receptorns cykliska guanosin-adenosinfosfatsyntas (cGAS) detekterar intracellulärt dubbelsträngat DNA, katalyserar cGAS syntesen av 2 0,30 -cGAMP (Figur 1), en cyklisk dinukleotid (CDN) kapabel av att direkt binda till och aktivera STING på det endoplasmatiska retikulumet [2–4]. Vid aktivering bildar STING aggregat som rekryteras nedströms till TANK-bindande kinas 1 (TBK1) och binder interferon regulatorisk faktor 3 (IRF3), som fosforylerar IRF3, aktiverar IRF3-dimerer in i kärnan, inducerar typ I-interferon (IFN) uttryck och initierar ett interferonimmunsvar [1]. Många studier har visat att STING är involverat i patogenesen av flera sjukdomar och att stimulering av STING inducerar effektiva immunsvar mot patogena infektioner och cancer; Men misslyckande med att modulera kronisk inflammatorisk signalering leder till autoimmuna och inflammatoriska sjukdomar [5-8]. På grund av STINGs grundläggande roll i regleringen av medfödd immunitet har ett stort antal team börjat utveckla STING-agonister eller -hämmare.

Figur 1. Representativa STING-modulatorer

Forskning på första generationens STING-agonister fokuserade på strukturell modifiering av CDN-analoger för att kringgå vissa begränsningar av endogena CDN, såsom dålig membranpermeabilitet och känslighet för hydrolys av fosfataser [9,10]. Den lilla molekylen STING-agonist 5,6-dimetylxanthenon-4-ättiksyra (DMXAA), som har visat terapeutiskt lovande mot solida tumörer i musmodeller, skulle kunna motverka nackdelarna med CDN-derivat [11]. Men läkemedlet misslyckades i humana kliniska prövningar [12]. Det bekräftas vidare att DMXAA selektivt binder till murin STING (mSTING) snarare än till human STING (hSTING) [13,14], vilket hämmar den terapeutiska potentialen hos DMXAA hos människor. 10-Karboximetyl-9-akridinon (CMA) är en annan representativ murinspecifik STING-agonist som användes som en potent typ I IFN-inducerare för antiviral terapi i början av 1970-talet [15]. Därför är artselektivitet en viktig faktor i utvecklingen av STING-agonister med små molekyler. Betydande nya skelett-hSTING-agonister har tagits fram av forskares outtröttliga ansträngningar, inklusive diABZI, SR717, MSA02 och andra [16–19].

cistanche fördelar för män stärker immunförsvaret

Allt fler bevis visar att STING-hyperaktivering är associerad med autoinflammatoriska och autoimmuna sjukdomar. Det är nödvändigt att begränsa den överdrivna aktiveringen av STING-signalvägen, vilket framhäver det potentiella värdet av STING-hämmare. Till skillnad från STING-agonister är utvecklingen av STING-hämmare fortfarande i sin linda, och inga läkemedelskandidater har ännu gått in i kliniska studier. De kända STING-hämmarna inkluderar två typer av föreningar: kompetitiva antagonister (SN-011 och Merck-18) och kovalenta inhibitorer (H151) [20–22]. De tidigare identifierade kovalenta STING-hämmarna interagerar med Cys88/91 eller Cys91 som är belägen i den N-terminala transmembrandomänen av STING utanför den CDN-bindande fickan [22]. Nyligen har två team successivt rapporterat två strukturella typer av STING-antagonister som ockuperar 20 3 0 -cGAMP-bindningsfickan för att hämma aktiveringen av 20 3 0 -cGAMP, vilket tyder på en tvåeggad effekt i CDN-bindningsfickan [20 ,21].

Här ger vi ett nytt perspektiv. Vi föreslår att bottenfickan där DMXAA och CMA är belägna underlättar utvecklingen av STING-hämmare baserat på vår djupa datautvinning och jämförelse av samkristallstrukturinformationen för de identifierade STING-proteinerna. Vår tidigare studie rapporterade en serie CMA- och DMXAA-analoger och identifierade föreningar 3 och 4 som binder till hSTING men med svag cellulär styrka [23] (Figur 2).

Figur 2. Kemiska strukturer av föreningarna 3 och 4 med data om deras biologiska aktiviteter. EC50-värdena för föreningarna 1–4 mättes av STING-reporterceller, och de bindande IC50-värdena mättes med STING-konkurrensbindande kit.

I denna artikel, angående designen av STING-hämmare för att upptäcka mer potenta bindemedel med fler kontakter i bottenfickan, utförde vi strukturella optimeringar för 3 respektive 4. Därefter genomförde vi en SAR-studie baserad på konkurrensbindande analyser. Vid bioaktivitetsutvärdering fungerade föreningarna 11 och 27 som bredspektrumbindare och uppvisade mikromolära nivåer av STING-hämmande aktivitet i flera rapporterade celler. När det gäller dockningsstruktur, håller två förening 11-molekyler hSTING i en inaktiv "öppen" konformation, vilket kompetitivt hämmar endogen 20 3 0 -cGAMP-bindning, som liknar kristallstrukturen hos Merck-18 och dockningsstrukturen av SN-011 [20,21].

2. Resultat

2.1. Designstrategi för DMXAA-derivat som STING-hämmare

2.1.1. Identifiering av designplatser för STING-hämmare genom att jämföra olika kristallstrukturer

Apo-proteinet från STING-ligandbindande domän (LBD) kristalliserade som en symmetrisk dimer i icke-liganden, vilket visade sig inte orsakas av gelfiltrering och analytisk ultracentrifugeringsanalys [24-26]. STING-dimeren antar en fjärilsliknande konformation med ligandbindningsstället placerat vid gränsytan mellan de två monomererna. För det första undersöker detta dokument de infrastrukturella och aktiveringsmekanismerna för hSTING- och mSTING-proteiner, jämför skillnaderna mellan dem, samt avslöjar några spännande insikter. För apo-strukturen visar den naturliga konformationen av båda proteinerna att mSTING är mer koncentrerad än hSTING (Figur 3). Shih et al. använde simuleringar av molekylär dynamik (MD) för att studera skillnaderna mellan hSTING och mSTING, vilket visar att hSTING föredrar en öppen-inaktiv konformation och mSTING föredrar en stängd aktiv konformation även utan en ligand bunden [27].

När den är bunden till 20,30 -cGAMP, är den konformationella övergången av hSTING från öppen (apo-protein, lateralt avstånd ~57 Å) till stängt (cGAMP-bundet protein, lateralt avstånd ~40 Å), medan det motsatta är sant för mSTING (29 Å till 40 Å). Strukturen för apo-hSTING skiljer sig dramatiskt från den för apo-mSTING, men strukturerna för STING komplexbunden med 20,30 -cGAMP överlappar varandra. DMXAA, CMA och cGAMP är STING-agonister med olika strukturella byggnadsställningar, men deras aktiveringskonformationer vid bindning till mSTING-proteiner är också väsentligen desamma (Figur 3). Scenarierna som beskrivs ovan vittnar om att stimuleringsmekanismerna för hSTING och mSTING är slående olika; de konformationer som aktiveras av STING är dock relativt konstanta, oberoende av artselektivitet och agonistryggradstyp (medan de är begränsade till STING-agonister som åstadkommer konformationsförändringar). De bindande fickvolymerna för de olika kristallkomplexen är i allmänhet konvergenta (~ 300 Å3, tabell S1), vilket är ytterligare bevis på stabiliteten hos STING-proteinaktiveringskonformationen.

Figur 3. Jämförelse av apo- och föreningsbundna STING-kristallstrukturer. mSTING-proteinet är vete (avstånd testat med röd linje), PDB-kod:4KC0 (apo), 4LOJ (bundet-cGAMP), 4LOL (bundet-DMXAA) och 4JC5 (bundet-CMA)

För det andra, baserat på ovanstående fynd av aktiveringskonformationsstabilitet, överlagrade vi samkristallstrukturer av cGAMP, DMXAA, CMA, SR717 och MSA02, som är STING-agonister med sluten konformation, för att utforska positionen för de olika strukturella agonisterna i STING-proteinbindningsställen. Proteinfickan kan delas upp i två regioner: bottenfickan och toppfickan, efter fördelningen av STING-agonister i proteinfickan (Figur 4a). Förutom att mSTING-agonister DMXAA och CMA är helt i bottenfickan, kan de andra agonisterna aktivera hSTING-vägen och ligga i den övre regionen. Vi kartlade sedan interaktionerna mellan de fem STING-agonisterna med aminosyrarester bundna till STING-proteinet (inom 5 Å från liganden; figur S1), och visade att de primära aminosyrorna inkluderade R238, Y167, R232, S162, T263 och T267 (mSTING motsvarande restsekvensnummer minus ett). Att matcha resterna sekventiellt med fickorna visade att T267, T263 och S162 ligger i bottenfickan; den övre fickan innehåller R238, R232 och Y167 (Figur 4b). Som rapporterats är R238, Y167 och R232 väsentliga för agonistbindning till STING, speciellt R238 (mSTING-proteinet motsvarar R237), vars mutation skulle resultera i en fullständig förlust av stabilisering (ligandbindning) [28-30]. Che et al. avslöjade också att nyckelresten R238 dominerar bindningen av DMXAA, och punktmutationerna (S162A/E260I) kan förbättra interaktionen mellan R238 och DMXAA genom MD-simuleringar [31].

cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret

Klicka här för att se produkter från Cistanche Enhance Immunity

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

För att ockupera mSTING-proteinfickan antog DMXAA eller CMA ett unikt bindningsläge där två småmolekylära agonister binder till en enda mSTING-homodimer. DMXAA:erna är stadigt monterade i bottenfickan med vätebindningar mellan ketogruppen och T266-sidokedjan (hSTING motsvarar 267), medan karboxylatgruppen interagerar med R237- och T262-sidokedjorna (Figur 5a). Interaktionen mellan DMXAA och R237 (den enda nyckelaminosyran i den övre fickan) är avgörande för mSTING-aktivitet. En ofta förbisedd detalj är att DMXAA endast kan verka på R237 av symmetriska monomera proteiner, till exempel DMXAA (molekyl A) som påverkar R237B (Figur 5a). Eftersom DMXAA sitter i botten är avståndet mellan molekyl A och R237B 3,06 Å, medan avståndet till R237A är större än 5 Å (Figur 5b). Genom att dra nytta av den mer kompakta fickan av mSTING-proteinet interagerar DMXAA utan ansträngning med R237 av den symmetriska mSTING-monomeren men det finns inget sätt för DMXAA att associera med någon av R238 i det konformationsmässigt öppna apo-hSTING-proteinet (Figur 3). Därför försämrar fickpositionen för DMXAA stimuleringen av hSTING-vägen. Nyligen har Merck, inspirerad av 2:1 bindningsförhållandet för DMXAA, upptäckt STING-antagonister som kan ockupera bindningsfickan [21]. Kristallkomplexet av Merck 18 och hSTING-protein visar att föreningen huvudsakligen är belägen under proteinfickan och interagerar med S162, T263 och T267, som alla matchar egenskaperna hos DMXAA (Figur 5c). Ur detta genererades hypoteser: den övre fickan är en utmärkt hålighet för att designa STING-agonister; bottenfickan är ett mer lämpligt bo för inhibitorer, och strukturen hos DMXAA eller CMA är optimerad för att ha potential att bli en STING-antagonist.

Figur 4. Underindelning av STING-bindningsställena och distribution med nyckelaminosyror. (a) Placering av två regioner i STING-monomer. Den nedre fickan är färgad magenta och den övre fickan är grön. PDB-koderna för de överlappande kristallkomplexen är följande: 4LOH (cGAMP, grön), 6UKV (MSA-02, gul), 6XNP (SR717, orange), 4LOL (DMXAA, magenta) och 4JC5 (CMA, lila). (b) Fördelningar av nyckelaminosyror i de övre och nedre regionerna. Resterna i den nedre fickan visas i magenta och de gröna är i den övre delen.

Figur 5. Kristallkomplex av DMXAA och Merck 18. (a) Intermolekylära kontakter i komplexet av DMXAA och mSTING. Den bundna DMXAA visas i grå färg, med individuella STING-subenheter i den symmetriska dimeren som visas i grönt och lila. A- och B-uppteckningarna indikerar proteinmonomer eller individuell ligandidentitet. (b) Avstånd mellan nyckelresterna R237A respektive R237B och DMXAA (molekyl A). R237A till karboxyl av DMXAA är 6,02 Å, R237B till karboxyl av DMXAA är 3,06 Å. (c) Kristallstruktur av Merck 18 bundet till hSTING-protein (PDB 6MXE) och detaljer om dess intermolekylära kontakter. Den bundna liganden visas i grå färg, med individuella STING-subenheter i den symmetriska dimeren som visas i grönt och lila. A- och B-uppteckningarna indikerar proteinmonomer eller individuell ligandidentitet

Figur 6. Forskningsbas och våra optimerade hotspots för DMXAA- och CMA-derivat. (a) Överlagring av strukturen för DMXAA bunden till mSTING (PDB: 4LOL, visad som mörkblå) med strukturen av DMXAA bunden till hSTING S162A/G230I/Q266I (PDB: 4QXR, visad som orange). (b) Detaljer om DMXAA bundet till muterad hSTING (PDB: 4QXR). De streckade rutorna representerar de potentiella modifieringsplatserna. Aminorester som visas i grönt är muterade rester (S162A/Q266I).

Vi fann att oförmågan hos DMXAA att aktivera värdvägen var relaterad till platsen för DMXAA i bottenfickan (enligt avsnitt 2.1.1), vilket också försåg oss med designidén för STING-hämmare: öka kontakterna för DMXAA-derivat med bottenregionen genom strukturella modifieringar för att hålla STING i en icke-aktiverad konformation. S162 och Q266 ligger på lämpligt sätt i botten av bindningsstället, så DMXAA kan vara välplacerade i direkt kontakt med båda, vilket underlättar utforskningen av effekten av aminosyror i bottenfickan på ligander. Analysen av struktur-aktivitetssamband (SAR) visade att 5,6-dimetyldelen och C7-positionens metoxi var avgörande för den biologiska aktiviteten för 3 och 4. Som visas i figur 6b, 5 ,6-dimetylgruppen skapade hydrofoba interaktioner med flera aminosyror i bottenfickan; på grund av närheten av C7-positionen för DMXAA till aminosyra Q266, tillät motsvarande metoximodifiering 3 och 4 att binda till värd. Därför förutsatte våra strukturella utarbetningar låsningen av 5,6-dimetyl- och C7-metoxi, och designen av nya derivat fokuserade på att modifiera den polära gruppen vid C1/C2-positionen (som påverkar S162) och ändra karboxylsyragruppen ( utvidga den strukturella mångfalden). Vi designade och syntetiserade en serie derivat med hjälp av föreningarna 3 och 4 som byggnadsställningar, vilket validerade vår föreslagna inhibitorförmodan.

2.2. Kemi

Framställningen av alla intermediär- och målföreningar beskrivs i Schema 1. 1-metoxi-2,3-dimetyl-4-nitrobensen (5) och 2-brombensoesyra ( 7) var kommersiellt tillgängliga. Initialt omvandlades 1-metoxi-2,3-dimetyl-4-nitrobensen till 4-metoxi- 2,3-dimetylanilin (6) via reduktion med järnpulver. Därefter utsattes 6 och 7 för Ullmann-reaktion med kaliumkarbonat med katalys av koppar och koppar(I)oxid i N,N-dimetylformamid för att tillhandahålla motsvarande mellanprodukt 8. Den intramolekylära kondensationsreaktionen av 8 utfördes med Eatons reagens för att ge intermediär 2-metoxi-3,4-dimetylakridin-9(10H)-on (9). Den efterföljande substitutionen av 9 utfördes med etylbromacetat, och förlusten av 1 ekvivalent HBr gav etyl 2-(2-metoxi-3,4-dimetyl-9- oxoakridin-10(9H)-yl)acetat (10). Slutligen hydrolyserades etylacetat i 10 till karboxylsyra med natriumhydroxid vilket gav 2-(2-metoxi-3,4- dimetyl-9-oxoakridin-10 (9H)-yl)ättiksyra (11).

Schema 1. a. EtOH, Fe, NH4Cl; b. DMF, Cu, Cu2O, K2CO3; c. Eatons reagens; d. BrCH2COOC2H5, NaH; e. NaOH; f. CCI3CH(OH)2, NH2OH; g. H2SO4; h. EtOH, H2O2, NaOH.

För den efterföljande syntesen av fler målföreningar måste vi först syntetisera föreningen 2-amino-5-metoxi-3,4-dimetylbensoesyra (14). 6 omsattes med kloralhydrat och hydroxylamin, vilket bildade acetamid och hydroxyamino, med mellanprodukten (E)-2-(hydroxylamin)-N-(4-metoxi-2,3-dimetylfenyl (12) acetamid (12). Den efterföljande Beckmann-omlagringsreaktionen av hydroxiaminon av 12 utfördes med svavelsyra för att ge laktamderivat 13. Slutligen hydrolyserades mellanprodukt 13 med väteperoxid och natriumhydroxid i etanollösning för att ge 14. Med användning av 14 som utgångsmaterial för reaktionen syntetiserade ytterligare en serie av 8-metoxi-9,10-dimetyl-6Hpyrrolo[3,2,1-de]akridin-1,6( 2H)-dionderivat med substituenter vid R1 och R2. Inledningsvis utsattes 14 och 15–19 för Ullmann-reaktion med kaliumkarbonat med katalys av koppar och koppar(I)oxid i N,N-dimetylformamid för att ge motsvarande mellanprodukter 20–24. De intramolekylära kondensationsreaktionerna av 20–24 utfördes med Eatons reagens för att ge 8-metoxi-9,10-dimetyl-6H-pyrrolo[3,2,{{46} }de]akridin-1,6(2H)-dionderivat (25–29). På liknande sätt, med 14 som utgångsmaterial för reaktionen, syntetiserade vi ytterligare en serie av 7-metoxi-5,6-dimetyl-9-oxo-9,{{ 59}}dihydroakridin-4- karboxylsyraderivat med substituenter vid R. Inledningsvis utsattes 14 och 7 eller 30 för Ullmann-reaktion med kaliumkarbonat med katalys av koppar och koppar(I)oxid i N,N-dimetylformamid för att ge motsvarande mellanprodukter 31 och 32. De intramolekylära kondensationsreaktionerna av 31 och 32 utfördes med Eatons reagens för att ge 7-metoxi-5,6-dimetyl-9-oxo-9 ,10-dihydroakridin-4-karboxylsyraderivat (33,34). Sålunda designade, syntetiserade och screenade vi 16 akridonanaloger, vars strukturer sammanfattas i tabell 1.

Tabell 1. Strukturer för de nya analogerna av den nuvarande studien.

2.3. Nya föreningars bindningsförmåga till STING och deras SAR

Nya föreningars bindningsförmåga till STING och deras SAR För att direkt bekräfta effektiviteten av den strukturella modifieringen, screenade vi först alla syntetiserade föreningar med cGAMP-förskjutningsanalyser. Utöver artselektivitet finns det fem varianter av STING som är polymorfa hos människor, R232 (WT, 58 % av befolkningen), HAQ (20 %), H232 (13 %), AQ (7 %) och Q ( 2 %) [32]. Därför använde vi de kommersiella konkurrensanalyssatserna med homogen tidsupplöst fluorescens (HTRF)-teknologi för att testa den biokemiska styrkan hos nya föreningar på mSTING och olika hSTING-isoformer (WT, H232 och AQ) och jämförde dem med kontrollen. Som förväntat var kontrollföreningarna 1–4 alla bundna till mSTING; från hSTING-screeningen hade föreningarna 3 och 4 IC50-värden på mikromolär nivå.

Tabell 2. Resultaten av föreningar med olika hSTING-isoformer och mSTING-konkurrensbindningsanalyser.

Först, baserat på förening 3, infördes en halogenatom eller metoxigrupp vid C1/C2-stället (tabell 1). Förening 27, som det optimala derivatet av förening 3 (Cl-position substituerad med F), har bättre total aktivitet än förening 3 (ensiffrig mikromolär aktivitet i alla biokemiska analyser, tabell 2). Den R1-modifierade föreningen 25 har en bindningseffekt med ett brett spektrum men är inte lika aktiv som den F-substituerade eller osubstituerade versionen. Jämfört med förening 3 uppvisade föreningarna (26, 28 och 29) med C2--stället införd grupp alla olika grader av minskning i bindningsaffinitet, särskilt förening 29. För det andra, att behålla ryggraden i förening 4 och ersätta halogenatomen mot C1/C2-stället, fick vi föreningarna 35–38 (tabell 1). Dessa föreningar var inaktiva i alla fyra undanträngningsanalyserna vid koncentrationer upp till 100 µM, vilket visar att substitution med en halogenatom vid C1/C2-stället inte tolereras. Sedan omvandlade vi acetatgruppen på förening 4 till en karboxylgrupp (33) och introducerade metoxi vid C2-stället (34). Tyvärr var denna förändring ett misslyckande eftersom båda föreningarna förblev inaktiva. Efter att ha lärt oss av vårt misslyckande undersökte vi ytterligare SAR:erna för derivaten av förening 4 genom att flytta acetatgruppen till N-positionen och lämna C1/C2-positionerna omodifierade. Förening 11 visar bindning till ett brett spektrum av STING-varianter, alla med IC50s under 20 µM; aktiviteten är överlägsen förening 4 och jämförbar med förening 27. Dessutom är förening 9 (ingen karboxylgrupp på N-stället) och förening 10 (N-acetatetyl) syntetiska prekursorer till förening 11 som inte kan binda till STING, vilket indirekt visar betydelsen av karboxylsyragruppen.

2.4. Cellulär biologisk utvärdering

2.4.1. In vitro-screening av nya analoger med STING-agonistaktiviteter

Vi screenade systematiskt alla föreningar för STING-agonistaktivitet med hjälp av 293T hSTING-WT-, 293T-mSTING- och THP1-KO-STING-reportercellinjerna (tillhandahålls av Invivo Gen). Med hjälp av 293T-hSTING-R232-celler och 293T-mSTING-celler visade vi aktivering av IRF-vägen som ett indirekt mått på typ I IFN-induktion genom att övervaka aktiviteten av sekretoriskt embryonalt alkaliskt fosfatas (SEAP), vilket bidrog till vår studie av artselektiviteten hos föreningar. THP1-KO-STING-celler genererades från THP1-dubbla celler genom stabil knockout av STING-genen, och vi använde THP1-KO-STING-celler för att bekräfta om föreningen uppvisar funktionen av STING-beroende cytokininduktion. Vi jämförde STING-agonistaktiviteterna för alla målderivat med de för referensagonisterna för murin (DMXAA) och human (20,30 -cGAMP) STING. Överraskande nog kunde ingen av de syntetiserade föreningarna aktivera vare sig hSTING- eller mSTING-vägarna (maximal koncentration vid 200 µM), vilket är allvarligt oförenligt med resultaten av bindningsanalyserna. Därför kan våra screenade STING-bindande medel ha potentiella bindningsmönster som nya STING-antagonister.

2.4.2. In vitro-screening av STING-bindare med STING-hämmande aktiviteter

Först gjorde vi förexperiment: med den 1 µM kovalenta hämmaren H151 som en positiv referens, undersökte vi dess hämmande nivåer i mSTING- och hSTING-reportercellinjer samodlade med olika koncentrationer av 20 3 0 -cGAMP för att bestämma de optimala förhållandena för screening av inhibitorn (se avsnitt 4.2.3 för protokolldetaljer). För det andra screenade vi initialt den hämmande styrkan hos de nya föreningarna genom behandling med de förexperimentella metoderna vid en koncentration av 100 µM. Vi fann att de bredspektrum STING-bindande föreningarna 11 och 27 uppvisade utmärkt inhibering i både murina och humana STING-reporterceller, med föreningarna 3 och 4 och de andra föreningarna som inte var lika effektiva. För det tredje satte vi koncentrationsgradienter för föreningarna 11 och 27 för att testa båda IC50-värdena och jämföra dem med H151. Föreningarna 11 och 27 var aktiva vid mikromolära koncentrationer som hämmade 20 3 0 -cGAMP-inducerat IFN-uttryck i både hSTING- och mSTING-vägar.

cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret

Med IC50-värden överträffade förening 11 (hSTING 19,93 µM och mSTING 15,47 µM) förening 27 (hSTING 38,75 µM och mSTING 30,81 µM) (Figur 7a). I jämförelse var IC50-värdena för H-151 i 293T-hSTING- och 293T-mSTING-celler 1,04 och 0,82 µM (Figur 7a), vilket indikerar att den kovalenta hämmaren H-151 uppvisar en bättre hämmande effekt på STING -beroende signalering i cellbaserade analyser. För att ytterligare bekräfta den hämmande egenskapen hos föreningarna 11 och 27 använde vi en annan THP-1 human monocytreportercellinje THP1-Dual-hSTING-R232, som använder ett dubbelrapportersystem för att rapportera om IRF-aktivering som ett indirekt mått på typ I IFN-induktion och på NF-KB-aktivering som ett indirekt mått på proinflammatorisk cytokininduktion. Efter THP-1-reportercellinjestimuleringen med 20,30 -cGAMP tillsatte vi STING-hämmare med lämpliga koncentrationer för att hämma induktionen av I IFN och proinflammatoriskt cytokin. Som förväntat inhiberade föreningarna 11, 27 och H151 signifikant STING-utlösta IRF- och NF-KB-vägaktiveringar (Figur 7b). Dessutom, för att utesluta effekten av föreningarnas cytotoxicitet på den hämmande aktiviteten, använde vi CellTiter-Glo-kitet för att analysera cellulär aktivitet. Glädjande nog visade föreningarna 11 och 27 inga tecken på cytotoxicitet för 293T- och THP-1-celler genom cellviabilitetsanalys när de tillsattes i koncentrationer (5 till 100 µM) som hämmar STING, i motsats till H151, som redan visade signifikant cytotoxicitet vid 10 |iM (Figur 7c). Dessa studier identifierade föreningarna 11 och 27 som måttliga STING-hämmare, vilket bryter artkänsligheten och hämmar de dubbla IRF- och NF-KB-vägarna utan uppenbar cytotoxicitet.

2.5. Den strukturella grunden för aktiviteten av förening 11 undersöktes genom dockning

Mekanismen för konkurrerande STING-antagonister är att ockupera bindningsstället och störa aktiveringskonformationen av STING-proteinet [20,21]. Specifikt för hSTING lämnar antagonister hSTING-dimeren i en "öppen" konformation. Vi använde gliddockningen för att bestämma interaktionen mellan mänsklig STING CTD (PDB ID-kod 6MXE) och den bästa aktiva substansen 11. I dockningsstrukturen är de två föreningarna 11 delvis parallella med varandra och ligger längst ner i klyftan på hSTING-dimeren (Figur 8a), låser hSTING i en inaktiv öppen konformation (Figur S2). Förening 11 producerar huvudsakligen hydrofoba interaktioner, med den tricykliska strukturen hos liganden som tillåter mer kontakt med gränsytan i bottenfickan. Som med DMXAA eller CMA bildar karboxylgruppen en vätebindning med sidokedjan av T263, medan ketogruppen bildar en vätebindning med sidokedjan av T267. Metoxin i position C2 interagerar intimt med S162, vilket resulterar i ligand-ligand närhet mot varandra. Bis-metylsubstituenterna genererar inte bara ligand-ligand-interaktioner utan är också bekvämt placerade vid ingången till den övre fickan, vilket förhindrar bindningen av naturliga STING-agonister till nyckelrester (Figur 8b).

Figur 7. Bredspektrum-STING-bindare 11 och 27 är STING-antagonister. (a) Kemiska strukturer av föreningarna 11 och 27, och den hämmande aktiviteten hos STING-hämmare mot både m- och h-STING-vägar. 293T-celler (mSTING eller hSTING), förbehandlade med olika koncentrationer av föreningar, stimulerades av 20,30 -cGAMP; hämning av IRF-vägaktiviteten mättes indirekt med optisk densitet (OD)-värden. Den dosberoende hämmande kurvan anpassades för att beräkna IC50s för föreningar. (b) Föreningarna 11 och 27 kan hämma aktiveringen av hSTING dubbla vägar. THP1-hSTING-R232-reportercellinjer stimulerades med 20,30 -cGAMP och behandlades med föreningarna, vilket hämmade IFN-induktionen (bedömde aktiviteten med de relativa ljusenheterna (RLU) av Lucia-luciferas ) och proinflammatorisk cytokininduktion (övervakar aktiviteten av SEAP mätt med OD-värden). (c) Nya analoger uppvisar låg cytotoxicitet i jämförelse med den kovalenta inhibitorn. 293T (eller THP-1-celler) inkuberades med den angivna koncentrationen av inhibitorer under de angivna tidsperioderna. Cellviabilitet mättes med CellTiter-Glo-kit. Data som visas är medelvärdet från tre oberoende experiment. NS (ingen signifikant) p > 0,05, *** p < 0,001. p-värden beräknades genom ett tvåsidigt t-test.

Figur 8. Dockningsstruktur för förening 11 bunden till STING-protein. (a) Bindningssätt för förening 11. Den bundna liganden visas i grå färg, med individuella STING-subenheter i den symmetriska dimeren som visas i grönt och lila. I bindningsfickorna på STING-monomeren är botten färgad magenta och toppen grön. (b) De intermolekylära kontakterna av förening 11 är bundna till STING. Förening 11 och kontaktade STING-aminosyror visas som en stickmodell. De intermolekylära kontakterna och vätebindningarna visas med en gul streckad linje. A- och B-uppteckningarna indikerar proteinmonomer eller individuell ligandidentitet.

3. Diskussion

I ljuset av de omfattande rapporterna om mekanismen och kristallstrukturen hos STING har vi möjlighet att förklara det vetenskapliga problemet med varför DMXAA inte har mänsklig STING-agonistisk aktivitet. I denna studie, genom jämförelse av olika STING-kristallstrukturer, fick vi några intressanta resultat: 1. STING-aktiveringskonformationen är stabil; 2. Det finns olika aktiveringsmekanismer för hSTING och mSTING; 3. DMXAA och CMA är längst ner på bindningsstället och skiljer dem från andra agonister. Med tanke på de olika aktiveringsmekanismerna för mSTING och hSTING kan inte mSTING-agonisterna DMXAA eller CMA som finns i bottenfickan utöva en aktivering i hSTING eftersom apo-hSTING har en större bindningshålighet som förhindrar liganden från att associera med R238.

Gao et al. rapporterade att enstaka mutationer (G230I, S162A och Q266I) ger hSTING samma DMXAA-känslighet som mSTING [33]. MD-simuleringar avslöjade att lockregionsmutationen G230I sidokedja är tillräcklig för att bilda en sterisk barriär för att förhindra DMXAA-utsöndring, medan DMXAA lätt går ut i hSTING WT [27]. Baserat på den strukturella modifieringen som motsvarar hSTING-punktmutationer (S162A/Q266I) i bindningsstället, har betydande DMXAA- och CMA-analoger varit tillgängliga men inga potenta hSTING-agonister. Anledningen till detta kan vara att den subtila strukturella diskrepansen mellan "naturliga" och "muterade" hSTING:er kan spela en avgörande roll i igenkänningsprocessen. Genom MD-simuleringar har Che et al. fann att de onaturligt muterade hSTINGarna stör de samordnade rörelserna av vattenmolekyler och förändrar mängden vatten som drivs ut vid ligandbindning, vilket är mer gynnsamt för att återställa DMXAA-aktivering av hSTING [31].

Uppmuntrade av studiens upptäckt av STING-hämmare vid bottenbindningsstället [21], vågar vi föreställa oss att DMXAA, som ligger i samma region, har potential att omvandlas till nya STING-hämmare. I en tidigare studie fusionerade vi strukturerna för DMXAA och CMA med subtila strukturella modifieringar och upptäckte framgångsrikt 3 och 4 som kunde binda till hSTING, men deras svaga STING-agonistiska aktivitet matchar inte deras bindningsstyrka. I den här artikeln är designidén att ytterligare förbättra kontakterna för DMXAA-analoger med bottenfickan för att konkurrenskraftigt motstå bindningen av 20,30 -cGAMP, så vi designade och syntetiserade optimerade strukturer av föreningarna 3 och 4.

cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret

Det första screeningssteget var att testa den biokemiska aktiviteten med användning av bindningssatserna av flera STING-varianter för att karakterisera bindningsstyrkan hos de nya derivaten. Resultaten av bindningsanalyserna visade att våra designanvisningar var sunda; vi identifierade 11 och 27 som bredspektrum STING-bindare (överlägsna 3 och 4) och diskuterade SAR. För analogerna av förening 3 förbättrade modifieringarna vid Cl-positionen bindningen till olika STING-varianter signifikant, medan de C2-modifierade föreningarna inte hade någon effekt. Emellertid tolererades förening 4 inte väl för strukturella modifieringar i C1/C2. Efter att ha flyttat karboxylsyrapositionen (C4 till N), hittade vi det bättre STING-bindemedlet 11 och fastställde att karboxylsyragruppen var väsentlig för aktivitet. Därefter screenade vi alla föreningar för aktivitet på cellnivå med hjälp av tre reportercellinjer, och ingen av målföreningarna var aktiva. Vi etablerade sedan en screeningsmetod för STING-hämmare och screenade om alla nya analoger. STING-bindemedlen 11 och 27 uppvisade mikromolära hämmande aktiviteter, med data jämförbara med den konkurrerande bindningsanalysen. Den kovalenta hämmaren H151 visade något bättre STING-hämmande aktivitet än 11 ​​och 27 in vitro. Dessutom validerade vi ytterligare att 11 och 27 effektivt kan hämma 20,30 -cGAMP-inducerad aktivering av STING dubbla vägar. Mest imponerande är att 11 och 27 upprätthåller en hög nivå av cellviabilitet vid höga koncentrationer, vilket inte är möjligt med H151. Cytotoxicitet är ett vanligt problem med kovalenta hämmare och begränsar användningen av H151.

Genom dockningsanalys har vi fått insikt i den strukturella grunden för bästa aktiva substans 11-aktivitet. Förening 11 upptar bottenfickan perfekt, håller hSTING i en inaktiv öppen konformation och hämmar sålunda konkurrenskraftigt 20,30 -cGAMP-bindning. Strukturen av den tricykliska ringen av akridin är nyckeln till att generera hydrofoba interaktioner, med karboxylsyragruppen och ketondelen förankrar föreningen i botten av fickan. Vi spekulerar i att metoxi producerar intima associationer med S162, vilket drar proteinkonformationen marginellt stängd men inte tillräckligt för att förvandla den till en agonistisk konformation. Bis-metylstrukturen skapar en rumslig platsblockering som förbättrar ligand-ligand-interaktioner och försämrar agonisternas inträde i den övre fickan. För närvarande finns det inga rapporterade samkristallstrukturer av mSTING- och STING-antagonister, så vi kan inte förklara verkningsmekanismen för förening 11 med mSTING med en dockningsmetod. Men vi gissar att det finns två möjligheter: den ena är att agerande principen är identisk med den för hSTING; den andra är att förening 11 håller mSTING i en mer aggregerad apo-konformation och 20,30 -cGAMP kan inte komma in i fickan för att utöva den agonistiska effekten. Sammanfattningsvis har våra subtila strukturella optimeringar av de svagare STING-agonisterna framgångsrikt vänt den biologiska funktionen för att upptäcka STING-hämmare. Dessa fynd illustrerar komplexiteten hos STING-bindningsfickorna och ger nya forskningsinsikter för läkemedelsutvecklingen av STING-agonister eller -hämmare.

4. Material och metoder

4.1. Kemi

Lösningsmedel och reagens som användes i syntesen erhölls från Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Peking, Kina). Strukturerna för produkterna identifierades genom 1H- och 13C-NMR-spektroskopi (JNM-ECA-400, Japan). Molekylvikterna för produkterna mättes med högupplösande masspektrometri (HRMS) med elektrosprayjonisering (ESI) som joniseringssätt (Agilent 1260-G6230A, Tyskland). NMR och masspektra för föreningarna tillhandahålls i tilläggsmaterialen. Föreningarna 35–38 syntetiserades och identifierades av oss; vänligen se den tidigare rapporterade artikeln för detaljer [23].

Etyl {{0}}(2-metoxi-3,4-dimetyl-9-oxoakridin-10 (9H)-yl)acetat (1{ {25}}): Till en lösning av 4-metoxi{{10}},3-dimetylanilin (6) (0,97 g, 6,4 mmol) och 2-brom-bensoesyra (7) (1,29 g, 6,4 mmol) i DMF (6 ml) vid rumstemperatur, vi tillsatte därefter pulveriserad Cu (0.05 g), Cu2O ({{60}}.05 g) och K2CO3 ({{186}},71 g, 5,1 mmol). Reaktionsblandningen värmdes vid 11 0 ◦C i 12 timmar. Efter avlägsnande av lösningsmedlen under vakuum löstes återstoden i 1 N NaOH-lösning (25 ml). Råprodukten erhölls genom utfällning efter surgöring av filtratet med konc. HCl. Efter torkning sattes råprodukten till Eatons reagens (5 ml) vid rumstemperatur, varefter blandningen upphettades till 90 ◦C i 1 timme. Den kylda reaktionsblandningen droppades i mättad vattenhaltig NaHC03-lösning. Fällningen filtrerades för att samla upp den grova produkten. Rening av återstoden genom silikagelkolonnkromatografi gav 9, ett blekgult fast ämne (0,61 g, 37,7 % utbyte). En lösning av NaH (1,43 mmol) och 9 (0,33 g, 1,3 mmol) i DMF (5 ml) vid rumstemperatur omrördes i 1 timme och kyldes sedan till 5–7 ◦C. Etylbromacetatet (0,43 g, 2,6 mmol) sattes till den resulterande blandningen och omrördes kontinuerligt vid rumstemperatur under 20 timmar. Efter fullbordande av reaktionen (TLC) hälldes reaktionsblandningen i isvatten (15 ml). De resulterande fällningarna filtrerades av, torkades och extraherades sedan med kloroform. Avdunstning av lösningsmedlet gav en rå ester som renades genom omkristallisation för att ge 10, ett gult fast ämne (0,33 g, 76 % utbyte). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 5 8,30 (d, J=8,4 Hz, 1H), 8,08 (d, J=8,6 Hz, 1H), 7,75–7,67 (m 1H), 7,57–7,50 (m, IH), 7,48 (s, IH), 5,02 (s, 2H), 4,22 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3,96 (s, 3H) 2,77 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 1,21 (t, J=7,1 Hz, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) 5 (ppm): 169,25, 157,87, 155,96, 147,46, 146,72, 135,46, 132,15, 130,17, 129,118, 8. 19,46, 95,26, 72,06, 61,28, 56,06, 14,59 , 14,34, 13,77. HRMS (ESI) m/z [M+H]+ beräknat för C20H21NO4: 339,3910 funnet: 340,1546. 2-(2-metoxi-3,4-dimetyl-9-oxoakridin-10(9H)-yl)ättiksyra (11): En lösning av 10 (0,37 g, 1,1 mmol) och NaOH (0,05 g, 1,3 mmol) i etanol (20 ml) och vatten (2 ml) upphettades till 60 ◦C under 1 timme. Efter avlägsnande av lösningsmedlen löstes den resulterande återstoden i vatten och filtrerades. Efter neutralisering av filtratet med konc. HCl, blandningen filtrerades för att erhålla den råa fasta substansen, omkristalliserades därefter med metanol för att ge 11, ett blekgult pulver (0,29 g, 85,7 % utbyte). IH NMR (400 MHz, DMSO-D6) 5 10,51 (s, IH), 8,33 (d, J=6,9 Hz, IH), 8,04 (d, J=8,5 Hz, 1H 7,69 (s, IH), 7,67-7,62 (m, IH), 7,45 (t, J=6,8 Hz, IH), 4,52 (s, 2H), 3,90 (s, 3H), 2,75 (s, 3H), 2,31 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) 5 (ppm): 159,04, 155,63, 147,47, 146,64, 134,86, 131,52, 129,56, 128,98, 125,218, 5,91218, 5,91218, 5,91215. 01.77, 96.02, 74.81, 55.69, 14.42, 13.33 . HRMS (ESI) m/z [M+H]+ beräknat för C18H17NO4: 311,3370 funnet: 312,1229.

{{0}}klor-8-metoxi-9,10-dimetyl-6H-pyrrolo[3,2,1-de]akridin{ {9}},6(2H)-dion (25): Till en lösning av 6-karboxi-4-metoxi-2,3-dimetylbensenamin (14) (1,3 g, 6,4 mmol) och 2-(2-brom-4-klorfenyl)ättiksyra (15) (1,6 g, 6,4 mmol) i DMF (6 ml) vid rumstemperatur, tillsatte vi sedan Cu i pulverform (0.05 g), Cu2O (0.05 g) och K2CO3 (0,71 g, 5,1 mmol). Reaktionsblandningen upphettades vid 110 ◦C under 12 timmar. Efter avlägsnande av lösningsmedlen under vakuum löstes återstoden i 1 N NaOH-lösning (25 ml). Råprodukten erhölls genom utfällning efter surgöring av filtratet med konc. HCl. Efter torkning sattes råprodukten till Eatons reagens (5 ml) vid rumstemperatur, varefter blandningen upphettades till 90 ◦C i 1 timme. Den kylda reaktionsblandningen droppades i mättad vattenhaltig NaHC03-lösning. Fällningen filtrerades för att samla upp den grova produkten. Rening av återstoden genom silikagelkolonnkromatografi gav 25, ett gult fast ämne (0,80 g, 38,6 % utbyte). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 5 8,17 (d, J =8,1, 1,5 Hz, 1H), 7,86 (d, J=6,9 Hz, IH), 7,51 (s, IH), 3,84 (s, 3H), 3,78 (s, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ beräknat för C18H14CINO3: 327,7640 funnet: 328,0734. 4-klor-8-metoxi-9,10-dimetyl-6H-pyrrolo[3,2,1-de]akridin-1 ,6(2H)-dion (26): Syntesen av denna förening liknade 25. 15 ersattes med 2-(2-brom-5-klorfenyl)ättiksyra (16). Vi erhöll 0,82 g 26 som ett blekgult fast ämne med ett utbyte av 38,7%. 'H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 5 7,73 (s, IH), 7,52 (s, IH), 7,38 (s, IH), 3,71 (s, 3H), 3,64 (s, 2H), 2,36 (s, 3H), 2,13 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ beräknat för C18H14CINO3: 327,7640 funnet: 328,0734.

{{0}}fluoro-8-metoxi-9,10-dimetyl-6H-pyrrolo[3,2,1-de]akridin{ {9}},6(2H)-dion (27): Syntesen av denna förening liknade 25. 15 ersattes med 2-(2-brom-4-fluorfenyl)ättiksyra (17). Vi erhöll en djupgul fast substans 27 med 0,84 g (42,1 % utbyte). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 5 8,21 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,68 (s, 1H), 7,23 (d, J {{39} },5 Hz, IH), 3,88 (s, 3H), 3,81 (s, 2H), 2,53 (s, 3H), 2,30 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ beräknat för C18H14FNO3: 311,3124 funnet: 312,1030. 4-fluoro-8-metoxi-9,10-dimetyl-6H-pyrrolo[3,2,1-de]akridin-1 ,6(2H)-dion (28): Syntesen av denna förening liknade 25. 15 ersattes med 2-(2-brom-5-fluorfenyl)ättiksyra (18). 0,81 g djupgul fast substans erhölls (40,5 % utbyte). 1H NMR (400 MHz, DMSOD6) 5 7. 86 (s, IH), 7,64 (s, IH), 7,51 (s, IH), 3,83 (s, 3H), 3,77 (s, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,26 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ beräknat för C18H14FNO3: 311,3124 funnet: 312,1030.

4,8-dimetoxi-9,10-dimetyl-6H-pyrrolo[3,2,1-de]akridin-1,6(2H )-dion (29): Syntesen av denna förening liknade 25. 15 ersattes med 2-(2-bromo-5-metoxifenyl)ättiksyra (19). {{20}}.73 g gult fast material gavs med ett utbyte på 35,2 %. 1H NMR (400 MHz, DMSO D6) 5 7,93 (s, IH), 7,61 (s, IH), 7,47 (s, IH), 3,84 (s, 3H), 3,81 ( s, 3H), 3,67 (s, 2H), 2,44 (s, 3H), 2,28 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ beräknat för C19H17NO4: 323,348 0 funnet: 324,1230. 7-metoxi-5,6-dimetyl-9-oxo-9,10-dihydroakridin-4-karboxylsyra (33): Till en lösning av 6-karboxi-4-metoxi-2,3-dimetylbensenamin (14) (1,30 g, 6,4 mmol) och 2-brombensoesyra (7) (1,29 g, 6,4 mmol) i DMF (6 ml) vid rumstemperatur tillsatte vi därefter pulveriserat Cu (0,05 g), Cu2O (0,05 g) och K2CO3 (0,71 g, 5,1 mmol). Reaktionsblandningen upphettades vid 110 ◦C under 12 timmar. Efter avlägsnande av lösningsmedlen under vakuum löstes återstoden i 1 N NaOH-lösning (25 ml). Råprodukten erhölls genom utfällning efter surgöring av filtratet med konc. HCl. Efter torkning sattes råprodukten till Eatons reagens (5 ml) vid rumstemperatur, varefter blandningen upphettades till 90 ◦C i 1 timme. Den kylda reaktionsblandningen droppades i mättad vattenhaltig NaHC03-lösning. Fällningen filtrerades för att samla upp den grova produkten. Rening av återstoden med silikagelkolonnkromatografi gav 33, ett blekgult fast ämne (1,00 g, 52,7 % utbyte). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 5 13,00 (s, 1H), 10,28 (s, 1H), 8,01 (d, J=9,7 Hz, 1H), 7,69 (d , J=8,5 Hz, 1H), 7,48 (t, J=9,0 Hz, 1H), 7,34 (s, 1H), 3,67 (s, 3H), 2,32 (s, 3H) 2,10 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ beräknat för C17H15NO4: 297,3100 funnet: 298,1073. 2,7-dimetoxi-5,6-dimetyl-9-oxo-9,10-dihydroakridin-4-karboxylsyra (34): syntesen av denna förening liknade 33. 7:an ersattes med 2-bromo-5- metoxibensoesyra (30). Det gula fasta ämnet gav 1,05 g med ett utbyte av 50,2%. IH NMR (400 MHz, DMSO-D6) 5 12,96 (s, IH), 10,45 (s, IH), 7,84 (s, IH), 7,54 (s, IH), 7,50 (s, IH), 3,84 (s, 3H), 3,81 (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 2,27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ beräknat för C18H17NO5: 327,3360 funnet: 328,1179.

4.2. Biologisk analys

Mus STING bindningssatser, humana STING WT bindningssatser, humana AQ STING bindningssatser och humana H232 STING bindningssatser köptes från Cisbio. 293T mSTING (ISG/KI-IFNb)-celler, 293T hSTING-R232 (ISG/KI-IFNb)-celler, THP1-KI-hSTING-R232-celler, THP1-KO-STING-celler köptes från Invivogen. 293T mSTING-celler och 293T hSTING-R232-celler odlades med DMEM (Gibco, Waltham, MA, USA), 2 mM L-glutamin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 4,5 g/L glukos (Sigma- Aldrich), 10 % FBS (Gibco), Pen-Strep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), 100 µM normocin (Invivogen, San Diego, CA, USA), och kompletterat med selektiva antibiotika (Invivogen) 10 ) blasticidin (10 µM), hygromycin (100 µM) och zeocin (100 µM). THP1-KO-STING-celler och THP1-KI-hSTING-R232-celler odlades med RPMI-1640 (Gibco), 2 mM L-glutamin (Sigma-Aldrich), 25 mM HEPES (Sigma-Aldrich), 10 % värmeinaktiverad FBS (Gibco), PenStrep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), 100 µM normocin (Invivogen), och kompletterad med selektiva antibiotika (Invivogen) blasticidin ( 10 µM) och zeocin (100 µM). QUANTI-Blue-lösningen, QUANTI-Luc, 20,30 -cGAMP köptes från Invivogen. H151 erhölls från Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Peking, Kina). CellTiter-Glo luminiscerande cellviabilitetsanalyssats erhölls från Promega.

4.2.1. HTRF STING Binding Competitive Assay

Enligt instruktionerna för STING-bindningssatser tillsattes följande lösningar successivt till varje brunn i 384-brunnsplattan: 5 µL av detektionsföreningarna eller 2 0,30 -cGAMP (positiv kontroll ) med olika koncentrationer eller utspädningsmedel (negativ kontroll); 5 µL humant STING 6His-märkt protein (negativ kontrollbrunn sattes till detektionsbuffert); 10 µL STING-ligand d2 och Anti 6His-Tb3+ förblandad arbetslösning. Efter försegling av plattan och inkubation vid rumstemperatur under 3 timmar avlästes fluorescensvärdena vid 665 nm och 620 nm. Förhållandet mellan de två fluorescensintensiteterna (665 nm/620 nm) användes för att uppskatta bindningsstyrkan hos föreningar. IC50-värdena (50 % hämmande koncentration) beräknades med hjälp av programvaran GraphPad Prism.

4.2.2. Cellulär analys för screening av föreningar för agonistisk aktivitet

180 µL mängder av 293T mSTING-celler, 293T hSTING-R232-celler och THP1-KOSTING-cellsuspension fördelades i 96-brunnsplattor med platt botten med en densitet på ~50,000 celler /brunn (293T) eller ~100,000 celler/brunn (THP1). En mängd av 20 µL av antingen saltlösning eller en saltlösning av en testförening, eller 20,30 -cGAMP som positiv referens tillsattes, och cellerna inkuberades vid 37 ◦C med 5 % CO2 i 48 timmar. Därefter tillsattes en mängd av 20 µL supernatant till en 96-brunn med platt botten, följt av 180 µL QUANTI-Blue-lösning till varje brunn. Plattan inkuberades vid 37 ◦C i 3 timmar och SEAP-nivåer (IRF-vägaktiviteten) bestämdes med en spektrofotometer vid 620–655 nm.

4.2.3. Cellulär analys för screening av föreningar med avseende på hämmande aktivitet

Förexperiment: 180 µL 293T mSTING-celler, 293T hSTING-R232-celler (~50,000 celler/brunn) stimulerades under 48 timmar vid 37 ◦C i en 5 % CO2-inkubator med 10 µL 20,30 -cGAMP (3,125 µM, 6,25 µM) och 10 µL H151 (1,0 µM ). Därefter tillsattes en mängd av 20 µL supernatant till en 96-brunn med platt botten, följt av 180 µL QUANTI-Blue-lösning till varje brunn. Plattan inkuberades vid 37 ◦C i 3 timmar och SEAP-nivåer (IRF-vägaktiviteten) bestämdes med en spektrofotometer vid 620–655 nm. 180 µL 293T mSTING-celler, 293T hSTING-R232-cellsuspension fördelades i 96-brunnsplattor med platt botten med en densitet på ~50,000 celler/brunn. En mängd av 10 µL 2 0,30 -cGAMP (3,125 µM) och förening 11 eller förening 27 (0,78 µM, 1,56 µM, 3,13 µM, 6,25 µM, 12,5 µM, 5 µM, µM, 5 µM, µM, µM, µM, µM, µM, µM, 1,56 µM, 3,13 µM, µM) eller H151 (0,08 µM, 0,16 µM, 0,31 µM, 0,63 µM, 1,25 µM, 2,5 µM, 5 µM) tillsattes, och cellerna inkuberades vid 37 ◦C i 5 ◦C i 5 µM. Därefter tillsattes en mängd av 20 µL supernatant till en 96-brunn med platt botten, följt av 180 µL QUANTI-Blue-lösning till varje brunn. Plattan inkuberades vid 37 ◦C i 3 timmar och SEAP-nivåer (IRF-vägaktiviteten) bestämdes med en spektrofotometer vid 620–655 nm. IC50-värden beräknades med programvaran GraphPad.

4.2.4. Cellulär analys för hämning av STING Dual Pathways

180 µL THP1-KI-hSTING-R232-cellsuspension fördelades i 96-brunns plattbottnade plattor med en densitet på ~100,000 celler/brunn. En mängd av 10 µL 20,30 -cGAMP och 10 µL förening 11 (20 µM) eller förening 27 (33 µM) eller H151 (2 µM) tillsattes och cellerna inkuberades vid 37 ◦C med 5 % CO2 i 24 timmar. Därefter tillsattes en mängd supernatant till en 96-brunn vit (ogenomskinlig) platta, följt av QUANTI-Luc eller QUANTI-Blue-lösning till varje brunn, och luminescensnivåer eller SEAP-nivåer avlästes enligt tillverkarens instruktioner. Detta möjliggör samtidig studie av IFN regulatory factor (IRF)-vägen, genom att bedöma aktiviteten av Lucia-luciferas och NF-KB-vägen, genom att övervaka aktiviteten hos SEAP.

4.2.5. CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay

Cellviabilitet mättes med CellTiter-Glo luminiscerande cellviabilitetsanalyssats enligt tillverkarens instruktioner. Kortfattat inkuberades celler med tre olika koncentrationer (5 µM, 10 µM, 100 µM) av förening 11 förening 27 eller H-151 under 48 timmar. 100 µL CellTiter-Glo-reagens tillsattes i en 96-brunnsanalysplatta under 10 minuter, sedan registrerades luminescens.

4.3. Molekylär dockning av förening 11

Kristallstrukturen för STING-komplexet (PDB ID: 6MXE) togs från en Protein Data Bank-post och användes som utgångspunkt. Protein framställdes med hjälp av Proteinberedningen av Maestro och delades upp i kedja A och kedja B. Vi genererade ett bindningsställe i LBD av STING-monomer baserat på den ursprungliga liganden (Merck-18) med användning av Receptor Grid Generation. Vi använde SP-precisionen för gliddockning för den molekylära dockningsdelen, vilket gjorde att förening 11 kunde generera högst 20 poser. Vi producerade slutligen 16 bundna konformationer (alla i bottenfickan) och testade komplexens bindningsfria energi med hjälp av Prime MM-GBSA-modulen i Schrödingers programvara. Dessutom, baserat på dockningspoäng, glidmodellpoäng och MMGBSA dG Bind-poäng, valde vi den optimala konformationen som fick första poäng i två och rankades trea i en (se tabell S2). Slutligen slog vi samman de bästa konformationerna av A- och B-kedjorna för att erhålla den kompletta dockningsstrukturen.

Referenser

1. Abe, T.; Harashima, A.; Xia, T.; Konno, H.; Konno, K.; Morales, A.; Ahn, J.; Gutman, D.; Barber, GN STING Erkännande av cytoplasmatiskt DNA sätter igång cellförsvar. Mol. Cell 2013, 50, 5–15. [CrossRef]

2. Wu, J.; Sun, L.; Chen, X.; Du, F.; Shi, H.; Chen, C.; Chen, ZJ Cyklisk GMP-AMP är en endogen andra budbärare i medfödd immunsignalering av cytosoliskt DNA. Science 2013, 339, 826–830. [CrossRef]

3. Abe, T.; Barber, GN Cytosolic-DNA-medierad, STING-beroende proinflammatorisk geninduktion kräver kanonisk NF-KB-aktivering genom TBK1. J. Virol. 2014, 88, 5328–5341. [CrossRef]

4. Cai, X.; Chiu, Y.-H.; Chen, ZJ cGAS-cGAMP-STING-vägen för avkänning och signalering av cytosoliskt DNA. Mol. Cell 2014, 54, 289–296. [CrossRef] [PubMed]

5. Gao, D.; Li, T.; Li, X.-D.; Chen, X.; Li, Q.-Z.; Wight-Carter, M.; Chen, ZJ Aktivering av cykliskt GMP-AMP-syntas av själv-DNA orsakar autoimmuna sjukdomar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, E5699–E5705. [CrossRef] [PubMed]

6. Li, TJ; Cheng, H.; Yuan, H.; Xu, QM; Shu, C.; Zhang, YF; Xu, P.; Tan, J.; Rui, Y.; Li, PJSR Antitumöraktivitet av cGAMP via stimulering av cGAS-cGAMP-STING-IRF3-medierat medfödd immunsvar. Sci. Rep. 2016, 6, 19049. [CrossRef] [PubMed]

7. Motwani, M.; Pesiridis, S.; Fitzgerald, KA DNA-avkänning genom cGAS-STING-vägen inom hälsa och sjukdom. Nat. Rev. Genet. 2019, 20, 657–674. [CrossRef]

8. Zhang, H.; Du, QD; Xu, XL Targeting Stimulator of Interferon Geners (STING): A Medicinal Chemistry Perspective. J. Med. Chem. 2020, 63, 3785–3816. [CrossRef]

9. Gao, J.; Tao, J.; Liang, W.; Zhao, M.; Du, X.; Cui, S.; Duan, H.; Kan, B.; Su, X; Jiang, Z. Identifiering och karakterisering av fosfodiesteraser som specifikt bryter ned 30 3 0 -cyklisk GMP-AMP. Cell Res. 2015, 25, 539–550. [CrossRef] [PubMed]

10. Corrales, L.; McWhirter, SM; Dubensky, TW; Gajewski, TF Värdens STING-väg i gränssnittet mellan cancer och immunitet. J. Clin. Undersök. 2016, 126, 2404–2411. [CrossRef] [PubMed]

11. Baguley, BC; Ching, LM DMXAA: Ett antivaskulärt medel med flera värdsvar. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2002, 54, 1503–1511. [CrossRef]

12. Lara, PN; Douillard, J.-Y.; Nakagawa, K.; von Pawel, J.; McKeage, MJ; Albert, I.; Losonczy, G.; Reck, M.; Heo, D.-S.; Fan, X.; et al. Randomiserad fas III placebokontrollerad studie av karboplatin och paklitaxel med eller utan det vaskulärt störande medlet Vadimezan (ASA404) vid avancerad icke-icke-småcellig lungcancer. J. Clin. Oncol. 2011, 29, 2965–2971. [CrossRef]

13. Conlon, J.; Burdette, DL; Sharma, S.; Bhat, N.; Thompson, M.; Jiang, Z.; Rathinam, VAK; Monks, B.; Jin, T.; Xiao, TS; et al. Mus, men inte mänsklig STING, binder och signalerar som svar på det kärlstörande medlet 5,6-dimetylxantenon-4-ättiksyra. J. Immunol. 2013, 190, 5216–5225. [CrossRef] [PubMed]

14. Kim, S.; Li, L.; Maliga, Z.; Yin, Q.; Wu, H.; Mitchison, TJ Anticancerflavonoider är musselektiva STING-agonister. ACS Chem. Biol. 2013, 8, 1396–1401. [CrossRef] [PubMed]

15. Cavlar, T.; Deimling, T.; Ablasser, A.; Hopfner, K.-P.; Hornung, V. Artspecifik detektion av den antivirala småmolekylära föreningen CMA genom STING. EMBO J. 2013, 32, 1440–1450. [CrossRef]

16. Ramanjulu, JM; Pesiridis, GS; Yang, J.; Concha, N.; Singhaus, R.; Zhang, S.-Y.; Tran, J.-L.; Moore, P.; Lehmann, S.; Eberl, HC; et al. Design av amidobensimidazol STING-receptoragonister med systemisk aktivitet. Naturen 2018, 564, 439–443. [CrossRef] [PubMed]

17. Chin, EN; Yu, C.; Vartabedian, VF; Jia, Y.; Kumar, M.; Gamo, AM; Vernier, W.; Ali, SH; Kissai, M.; Lazar, DC; et al. Antitumöraktivitet hos en systemisk STING-aktiverande icke-nukleotid cGAMP-mimetik. Science 2020, 369, 993–999.

18. Pan, BS; Perera, SA; Piesvaux, JA; Presland, JP; Schroeder, GK; Cumming, JN; Trotter, BW; Altman, MD; Buevich, AV; Kontanter, B.; et al. En oralt tillgänglig icke-nukleotid STING-agonist med antitumöraktivitet. Science 2020, 369, eaba6098. [CrossRef] [PubMed]

19. Sali, TM; Pryke, KM; Jinu, A.; Andrew, L.; Iris, A.; Rebecca, B.; Staverosky, JA; Smith, JL; Ahmed, AS; Lisi, AJPP Karakterisering av en ny mänsklig-specifik STING-agonist som framkallar antiviral aktivitet mot nya alfavirus. PloS Pathog. 2015, 11, e1005324. [CrossRef] [PubMed]

20. Hong, Z.; Mei, J.; Li, C.; Bai, G.; Maimaiti, M.; Hu, H.; Yu, W.; Sun, L.; Zhang, L.; Cheng, D.; et al. STING-hämmare riktar sig mot den cykliska dinukleotidbindningsfickan. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2021, 118, e2105465118. [CrossRef] [PubMed]

21. Siu, T.; Altman, MD; Baltus, GA; Childers, M.; Ellis, JM; Gunaydin, H.; Hatch, H.; Ho, T.; Jewell, J.; Lacey, BM; et al. Upptäckten av en ny cGAMP kompetitiv ligand av den inaktiva formen av STING. ACS Med. Chem. Lett. 2019, 10, 92–97. [CrossRef] [PubMed]

22. Haag, SM; Gulen, MF; Reymond, L.; Gibelin, A.; Abrami, L.; Decout, A.; Heymann, M.; van der Goot, FG; Turcatti, G.; Behrendt, R.; et al. Inriktning på STING med kovalenta småmolekylära hämmare. Naturen 2018, 559, 269–273. [CrossRef]

23. Hou, S.; Lan, X.-J.; Li, W.; Yan, X.-L.; Chang, J.-J.; Yang, X.-H.; Sun, W.; Xiao, J.-H.; Li, S. Design, syntes och biologisk utvärdering av akridonanaloger som nya STING-receptoragonister. Bioorg. Chem. 2020, 95, 103556. [CrossRef] [PubMed]

24. Ouyang, S.; Song, X.; Wang, Y.; Ru, H.; Shaw, N.; Jiang, Y.; Niu, F.; Zhu, Y.; Qiu, W.; Parvatiyar, K.; et al. Strukturell analys av STING-adapterproteinet avslöjar ett hydrofobt dimergränssnitt och ett sätt för cyklisk di-GMP-bindning. Immunitet 2012, 36, 1073–1086. [CrossRef] [PubMed]

25. Shu, C.; Yi, G.; Watts, T.; Kao, CC; Li, P. Struktur av STING bunden till cyklisk di-GMP avslöjar mekanismen för cyklisk dinukleotidigenkänning av immunsystemet. Nat. Struktur. Mol. Biol. 2012, 19, 722–724. [CrossRef]

26. Huang, Y.-H.; Liu, X.-Y.; Du, X.-X.; Jiang, Z.-F.; Su, X.-D. Den strukturella grunden för avkänning och bindning av cyklisk di-GMP av STING. Nat. Struktur. Mol. Biol. 2012, 19, 728–730. [CrossRef]

27. Shih, AY; Damm-Gnamet, KL; Mirzadegan, T. Dynamiska strukturella skillnader mellan människa och mus STING leder till olika känslighet för DMXAA. Biophys. J. 2018, 114, 32–39. [CrossRef]

28. Gao, P.; Ascano, M.; Zillinger, T.; Wang, W.; Dai, P.; Serganov, AA; Gaffney, BL; Shuman, S.; Jones, RA; Deng, L.; et al. Struktur-funktionsanalys av STING-aktivering med c[G(20,50)pA(30,50)p] och målsökning med antiviral DMXAA. Cell 2013, 154, 748–762. [CrossRef] [PubMed]

29. Zhang, C.; Shang, G.; Gui, X.; Zhang, X.; Bai, X.; Chen, ZJN Strukturell grund för STING-bindning med och fosforylering av TBK1. Naturen 2019, 567, 394–398. [CrossRef]

30. Vavˇrina, Z.; Gutten, O.; Smola, M.; Zavrel, M.; Aliakbar Tehrani, Z.; Charvát, V.; Kožíšek, M.; Boura, E.; Birkuš, G.; Rulíšek, L. Protein-ligand-interaktioner i STING-bindningsplatsen undersökt av rationellt utformade enpunktsmutationer: experiment och teori. Biokemi 2021, 60, 607–620. [CrossRef] [PubMed]

31. Che, X.; Du, X.-X.; Cai, X.; Zhang, J.; Xie, WJ; Long, ZR; Ye, Z.-Y.; Zhang, H.; Yang, L.; Su, X.-D.; et al. Enstaka mutationer Omformar det strukturella korrelationsnätverket i DMXAA-Human STING Complex. J. Phys. Chem. B 2017, 121, 2073–2082. [CrossRef] [PubMed]

32. Diner, EJ; Burdette, DL; Wilson, SC; Monroe, KM; Kellenberger, CA; Hyodo, M.; Hayakawa, Y.; Hammond, MC; Vance, RE Den medfödda immun-DNA-sensorn cGAS producerar en icke-kanonisk cyklisk dinukleotid som aktiverar mänsklig STING. Cell Rep. 2013, 3, 1355-1361. [CrossRef] [PubMed]

33. Gao, P.; Zillinger, T.; Wang, W.; Ascano, M.; Dai, P.; Hartmann, G.; Tuschl, T.; Deng, L.; Barchet, W.; Patel, DJ Binding-Pocket och Lid-Region Substitutions gör mänsklig STING känslig för den artspecifika drogen DMXAA. Cell Rep. 2014, 8, 1668–1676. [CrossRef] [PubMed]

34. Hwang, J.; Kang, T.; Lee, J.; Choi, B.-S.; Han, S. Design, syntes och biologisk utvärdering av C7-funktionaliserade DMXAA-derivat som potentiella human-STING-agonister. Org. Biomol. Chem. 2019, 17, 1869–1874. [CrossRef] [PubMed]