Chimärt humant papillomvirus-16 virusliknande partiklar som presenterar P18I10- och T20-peptider från HIV-1-hölje inducerar HPV16 och HIV-1-specifik humoral och T-cellsmedierad immunitet i BALB/c-möss
Dec 07, 2023
Abstrakt:
I denna studie infogades HIV-1 P18I10 CTL-peptiden härledd från V3-loopen av HIV-1 gp120 och T20-antifusionspeptiden från HIV-1 gp41 i HPV16 L1-kapsidproteinet för att konstruera chimära HPV: HIV (L1:P18I10 och L1:T20) VLP:er genom att använda däggdjurscellexpressionssystemet. HPV: HIV VLP renades genom kromatografi. Vi visade att införandet av P18I10- eller T20-peptider i DE-loopen av HPV16 L1-kapsidproteiner inte påverkade in vitro-stabilitet, självmontering och morfologi hos chimär HPV: HIV VLP. Viktigt är att det inte störde vare sig HIV-1-antikroppsreaktiviteten riktad mot sekventiella och konformationella P18I10- och T20-peptider som presenterades på chimära HPV: HIV-VLP:er eller med induktionen av HPV16 L1-specifika antikroppar in vivo. Vi observerade att chimära L1:P18I10/L1:T20 VLP-vacciner kunde inducera HPV16- men svaga HIV-1-specifika antikroppssvar och framkallade HPV16- och HIV-1-specifik T- cellsvar i BALB/c-möss. Dessutom kan det vara en potentiell booster för att öka HIV-specifika cellulära svar i den heterologa immuniseringen efter priming med BCG.HIVA-vaccin. Detta forskningsarbete skulle bidra till ett steg mot utvecklingen av den nya chimära HPV: HIV VLP-baserade vaccinplattformen för att kontrollera HPV16 och HIV-1-infektion, som är akut nödvändig i utvecklings- och industriländer.
cistanche fördelar för män stärker immunförsvaret
Klicka här för att se produkter från Cistanche Enhance Immunity
【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Nyckelord:
HIV-1; HPV16; vaccin; virusliknande partiklar; P18I10; T20-enfuvirtid; BCG.HIVA; humoral immunitet; T-cellsmedierad immunitet
1. Introduktion
Humant immunbristvirus-1 (HIV-1), som orsakar förvärvat immunbristsyndrom (AIDS), upptäcktes i början av 1980-talet och sedan dess har det blivit en global epidemi [1]. Även om högaktiv antiretroviral behandling (HAART), tillsammans med före-exponeringsprofylax (PrEP) kan ha en verklig inverkan på kontrollen av hiv-1-infektion, är vaccination fortfarande ett grundläggande tillvägagångssätt för allmänhetens nytta och för att sätta en slut på den globala hiv-1-epidemin [2]. Trots över tre decennier av grundlig HIV-1-forskning och många kliniska vaccinprövningar är ett licensierat HIV-1-vaccin hittills fortfarande omöjligt att uppnå. RV144-prövningen som genomfördes i Thailand var det första fallet som avslöjade en blygsam effekt på 31,2 % mot förvärv av HIV-1-infektion [3]. Majoriteten av andra HIV-1-vaccinkandidater som genomgick kliniska prövningar var huvudsakligen baserade på DNA, rekombinanta virala vektorer eller subenhetsproteinmodeller [4,5]. Helst är ett effektivt HIV-1-vaccin kapabelt att inducera medfödda immunsvar, neutralisera antikroppar för att förhindra virusinfektion [6] samt cytotoxiska T-lymfocyt- (CTL)-svar för att eliminera infekterade celler [7]. Men att framkalla varje svar kan kräva olika vaccinstrategier, vilket motiverar separata men parallella utvecklingsinsatser. Valet av immunogener och leveransvektorer kommer att ha betydande effekter på funktionen och specificiteten hos HIV-1-vacciner [8,9]. De upprepade misslyckandena med standardmetoderna för utvecklingen av HIV-1-vaccinet ledde till ett erkännande av vikten av val av leveransvektor, prime-boost-regimer och immunogenspecificitet i både humorala och cellulära svar. Mer än 100 typer av humant papillomvirus (HPV) är redan kända och HPV-genotyperna 16 och 18 anses vara ansvariga för cirka 70 % av livmoderhalscancer över hela världen [10]. HPV L1-virusliknande partiklar (VLPs), klassificerade som en typ av subenhetsvacciner, kan huvudsakligen inducera jämförbara L1--specifika humorala svar på vildtypsvirion och även T-cellsmedierade svar [11–13]. För närvarande har tre HPV-förebyggande vacciner licensierats på marknaden och alla är baserade på VLPs av HPV L1-kapsidprotein. Två av dem, Gardasil (Merck, Rahway, NJ, USA) och Gardasil-9 (Merck) produceras av uttryckssystemet jäst (Saccharomyces cerevisiae) medan den andra, Cervarix (GSK, Brentford, Storbritannien), produceras av baculovirus expressionsvektor/insektscell (BEVS/IC) systemet [14]. Hittills har optimala betingelser för produktion av HPV16 L1-proteiner i däggdjursexpressionssystemet inte varit väletablerade. Sålunda är utvecklingen av ett kombinerat vaccin som skulle skydda mot HPV- och HIV-infektioner en logisk insats i kampen mot dessa två stora globala patogener.
I vår tidigare recensionspublikation angående designkoncept för virusliknande partiklar (VLP)-baserade HIV-1-vacciner nämnde vi att icke-höljeförsedda VLP:er, såsom papillomvirus VLP:er, kan spela en funktionell roll som leveransvektorer för att presentera HIV-1 CTL eller neutraliserande antikroppsepitoper [15,16]. Denna hypotes har bekräftats i flera chimära bovina papillomvirus (BPV) L1-VLP som presenterar P18I10 CTL-epitop från V3-loop av gp120 HIV-1-höljeprotein (Env) och 2F5-epitop eller MPER-region av gp41 HIV-1 Env [17–22]. Den strukturella egenskapen hos L1-kapsidproteiner av humant papillomvirus typ-16 (HPV16) liknar den hos BPV och kan självmontera till L1-VLP:er i ett lager [23]. Fem av HPV16 L1-proteinerna bildar en pentamer och 72 av pentamererna sätts ihop till en HPV16 VLP [24]. Det finns dock fortfarande inga tydliga bevis för att chimära HPV16:HIV-kapsidproteiner skulle kunna vara stabila in vitro och självmontera till morfologiskt integrerade VLP:er. Å andra sidan har HPV16 L1 VLPs visat sig vara mycket immunogena och kan inducera antigenspecifika T- och B-cellsimmunsvar [11-13]. Det återstår fortfarande att se om presentationen av HIV-1-epitoper genom HPV: HIV-VLP kan vara immunogena. I denna studie syftade vi till att utveckla ett chimärt VLP-baserat HPV: HIV-vaccin genom att använda humana 293F-celler, ett väletablerat system för uttryck av däggdjursceller. HPV 16 L1-proteinet fungerade som den strukturella vaccinställningen, och P18I10- och T20-peptiderna valdes ut som HIV-1-immunogener och infogades i DE-loopen av HPV 16 L1-proteinet. Den immundominanta P18I10 CTL-epitopen som omfattar 10 aminosyror (resterna 311–320: RGP GRAFVTI) härleds från den tredje variabla domänen (V3) av HIV-1-höljesglykoproteinet gp120. P18I10-peptiden har identifierats som en H-2Dd-begränsad MHC klass-I-molekyl för att inducera cytotoxiska T-lymfocyt- (CTL)-svar [25,26]. T20-peptiden, känd som Enfuvirtide och designad som en antiretroviral multimer fusionspeptid, består av en 36 aminosyrasekvens (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF) som efterliknar den C-terminala heptadhelixsekvensen nära membranet0 s proximala externa regionen (MPER) av HIV-1-höljesglykoproteinet 41 (gp41) [27]. Dessa två HIV-1 T (P18I10) och B (T20) cellbaserade epitoper valdes ut som utgångspunkt och proof of concept-experiment för den chimära VLP-baserade HPV: HIV-vaccinutvecklingsplattformen.
Under det senaste decenniet har många olika prime-boost-format av VLP-baserat HIV-1-vaccin testats [15]. Även om majoriteten av tidigare HIV-1 VLP [28] eller chimär BPV: HIV VLP [17–22] vaccinstrategier var fokuserade på att inducera immunsvar genom att använda den homologa prime-boost-regimen, antydde två tidigare studier att heterolog immunisering bestående av rekombinantMycobacterium bovisBacillus Calmette-Guérin (rBCG) som uttrycker HIV-1 Gag prime och HIV-1 Gag VLP-boost kan bidra till att förbättra T-cellsimmuniteten [29,30]. I vår forskargrupp har vi visat att priming med rBCG-uttryckande HIVA-immunogen och förstärkning med rekombinant viral vektor MVA.HIVA var säker och framkallade HIV-1-specifika T-cellsimmunsvar i BALB/c-möss [31–33]. HIVA-immunogenet, designat av Dr. Tomas Hanke, består av fullängds HIV-1 Gag-proteinet kombinerat med flera CTL-epitoper inklusive P18I10-epitoper vid C-terminalen [34]. Därför syftade vi till att utvärdera om BCG.HIVA kunde öka T-cellsimmunsvaret inducerat av HIV: HPV (L1:P18I10) VLPs i BALB/c-möss.
I denna studie designades och producerades de chimära HPV:HIV (L1:P18I10 och L1:T20) immunogenerna genom att använda 293F-expressionssystemet. Det chimära L1:P18I10- och L1:T20-proteinuttrycket bekräftades genom immunfärgning. HPV: HIV VLP renades sedan med en 3-stegskromatografisk metod, inklusive katjon (CEC), storleksuteslutning (SEC) och heparinaffinitet (H-AC) kromatografi. Sedan bekräftades in vitro-stabiliteten, in vitro-självsammansättningen och morfologin för renade HPV: HIV-VLPs genom icke-reducerande SDS-PAGE, molekylmassaanalys respektive transmissionselektronmikroskopi (TEM). De sekventiella och konformationella P18I10- och T20-peptiderna presenterade på chimära HPV: HIV VLPs karakteriserades ytterligare av anti-HIV-1 gp120 V3 och 2F5 monoklonala antikroppar in vitro genom att använda Western blot och indirekt ELISA-analys. Slutligen utvärderades immunogeniciteten hos HPV: HIV VLPs i BALB/c-mössmodellen. Vi visade att chimära L1:P18I10 och L1:T20 VLP-baserade vacciner kunde inducera HPV16- och HIV-1-specifika antikroppssvar och chimära L1:P18I10 VLPs kunde inducera HPV16- och HIV{ {37}}specifika T-cellssvar i BALB/c-möss. Eftersom utvecklingen och tillverkningen av ett immunogent HPV: HIV-vaccin fortfarande är ouppnåeligt, gav denna studie en baslinjestrategi som kan vara värd att stödja de globala ansträngningarna att utveckla nya chimära VLP-baserade vacciner för att kontrollera HPV- och HIV-1-infektioner.
2. Material och metoder
2.1. Konstruktion av vaccinstammen BCG.HIVA2auxo.int
Rekombinant BCG-uttryckande HIVA-immunogen konstruerades tidigare med användning av E.coli-mycobacterial integrativ skyttelvektor p2auxo.int. Konstruktionen av E. coli/mykobakteriell vektor som uttrycker HIVA-antigen har tidigare beskrivits [31-33]. BCG.HIVA2auxo.int späddes i PBS-Tween20 till 2 × 107 cfu/mL, sonikerades för att bryta bakterieklumpar och inokulerades i den bakre matdynan eller BALB/c-möss (50 µL, 106 cfu/mus).
cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret
2.2. Bakteriekulturer och transformation
Celler av den auxotrofa glycinstammen av E. coli, M151GlyA (Invitrogen, Waltham, MA, USA), tillhandahållen av Dr. Pau Ferrer, odlades i minimalt M9-derivatmedium (M9-D: Na2HPO4, 6,78 g/L; KH2PO4, 3 g/L; NaCl, {{10}},5 g/L; NH4Cl, 1 g/L, glukos, 1{{20 }} g/L; MgSO4, 2 mmol/L; CaCl2, 0,1 mmol/L; tiamin, 0,1 g/L; FeCl3, 0.{{56 }}25 g/L; AlCl3·6H2O, 0.13 mg/L; ZnSO4·7H2O, 2.6 mg/L; CoCl2·6H2O, 0.47 mg/L; CuSO4·H2O, 4,6 mg/L; H3BO3, 0.03 mg/L; MnCl2·4H2O, 4,2 mg/L; NiCl2·6H2O, 0,02 mg/L; Na2MoO4·2H2O, 0,06 mg/L) kompletterat med glycin (70 µg/ml). E. coli M151Gly-cellerna transformerades med p2auxo.HIVA-plasmiderna genom elektroporering. För detta odlades E. coli-kulturerna till en optisk densitet av 0,9 vid 600 nm och transformerades med användning av en Bio-Rad-genpulserelektroporator vid 2,5 kV, 25 µF och 200 Ω. De transformerade cellerna odlades därefter på M9-D-agarplattor (komponenter som tidigare beskrivits, med 1,5 % baktoagar tillsatt) utan glycintillskott för selektion eller med glycintillskott som kontroll. Den lysin-auxotrofa BCG-stammen, BCG∆lys, vänligen tillhandahållen av WR Jacobs Jr., BR Bloom och T. Hsu transformerades med p2auxo.HIVAint-plasmid-DNA genom elektroporering. Mykobakterierna odlades i Middlebrook 7H9-buljongmedium eller på Middlebrook-agar 7H10-medium kompletterat med albumin-dextros-katalas (ADC; Difco) innehållande 0,05 % Tween 80. L-lysinmonohydroklorid (Sigma, Kawasaki, Japan) löstes i destillerat vatten och används som tillskott vid en slutlig koncentration av 40 µg/ml. För transformation odlades BCG till en optisk densitet av 1,5 vid 600 nm och transformerades med användning av en Bio-Rad genpulserelektroporator vid 2,5 kV, 25 µF och 1000 Ω. Transformanterna odlades sedan på ADC-supplerat Middlebrook-agar 7H10-medium innehållande 0,05 % Tween 80 utan lysintillskott.
2.3. Cellinjer och cellkultur
293F-cellerna (Tibco), härledda från humana embryonala njure (HEK) 293-celler, odlades i FreeStyle 293 expressionsmedium (Tibco) kompletterat med 5 ml/L penicillin-streptomycin (Tibco) och inkuberades i en 37 ◦C inkubator en fuktad atmosfär av 5% CO2 på en orbital shaker-plattform som roterar med 125 rpm.
2.4. Produktion av L1:P18I10 och L1:T20 proteiner med hjälp av 293F Expression System
pCDNA3.1-konstruktionen innehöll L1:P18I10- eller L1:T20-DNA-kodande sekvenser motsvarande chimära L1:P18I10- respektive L1:T20-proteiner. HIV-1 P18I10 CTL-peptiden (RGPGRAFVTI) eller T20-peptiden (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) sattes in i DE-slingan av HPV16 L1-kapsidprotein. HPV16 L1 DE-loopsekvensen som kodar för 130–136 aminosyror ersattes med antingen P18I10I10- eller T20-peptid. L1:P18I10- eller L1:T20-DNA-kodningssekvenserna modifierades med Kozak-sekvens, optimerades med humant kodon, flankerade av restriktionsenzymställena för HindIII och Xbal, och klonades in i pcDNA3.1(+)-vektorn genom att använda GeneArt-gensyntestjänster ( Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). Det rekombinanta plasmid-DNA (pDNA) transformerades in i E. coli DH5-kompetenta celler (Invitrogen) för amplifiering och extraherades med användning av plasmid Maxi-kit (QIAGEN, Hilden, Tyskland). 293F-cellerna odlades med 30 ml FreeStyle 293-expressionsmedium i en 125 ml Erlenmeyer-kolv (Corning, New York, NY, USA) till en densitet av 1,0 × 106/ml och transfekterades övergående med L1:P18I10 eller L1:T20 med förgrenad DNA. polyetylenimin med en molekylvikt på 25 kDa (PEI-25K) (polyvetenskap) vid ett optimerat förhållande mellan DNA och PEI 1:3 (vikt/vikt) och DNA till odlingsmedium 1:1 (vikt/volym), enligt till tillverkarens instruktioner [35]. 293F-cellerna skördades 96 timmar efter transfektion. 293F-cellerna kan nå en sammanflytande densitet på 3,6 × 106 celler/ml med cirka 50 % livsduglighet.
2.5. Immunfluorescensfärgning
Cellerna permeabiliserades på objektglaset med 100 % kall aceton. Därefter sonderades de fixerade cellerna med anti-HPV16 L1-antikroppen CAMVIR-1 (Abcam, Cambridge, Storbritannien) och fångades in med anti-mus IgG-FITC (Sigma). Immunfärgade cellmonoskikt tvättades noggrant med PBS och täcktes med ett monteringsmedium med DAPI (Abcam). Immunofluorescensbilderna inspekterades under ett inverterat mikroskop vid 40x förstoring. Transfektionseffektiviteten bestämdes av förhållandet mellan FITC (grön)-positiva celler och DAPI (blå)-färgade celler.
2.6. Rening av HPV: HIV (L1:P18I10 och L1:T20) VLPs
Totalt 108 transfekterade 293F-celler i en 125 ml Erlenmeyer-kolv (30 ml odlingsmedium/kolv) samlades upp genom centrifugering vid 1500 rpm under 5 minuter och tvättades två gånger med PBS. Cellpellets återsuspenderades i lysbuffert formulerad med 1 % Triton X-100, en proteashämmare (1:100) (Millipore) och Benzonase (25 U/ml) (Millipore). Cellysat klarnades med ett 0,45 µm PVDF-sprutfilter (Millipore). HPV: HIV (L1:P18I10 och L1:T20) VLP-proverna serierenades med användning av katjonbyte (Capto SP ImpRes, GE, Boston, MA, USA), storleksuteslutning (Capto Core 700, GE) och affinitet (HiTrap Heparin HP , GE) kromatografi. De kromatografiska protokollen beskrevs i våra tidigare studier [36,37] och följde tillverkarens protokoll [38]. L1-proteinsignalen i varje reningssteg karakteriserades av Western blot-analys och sonderades med anti-HPV16 L1-antikropp CAMVIR-1 [39].
2.7. Icke-reducerande SDS-PAGE
HPV16 L1, L1:P18I10 och L1:T20 VLP blandades med 2x Laemmli provbuffert (BIO-RAD) i frånvaro eller närvaro av 5 % (v/v) 2-merkaptoetanol ({{11} }ME) och fick reagera vid rumstemperatur (RT) under 24 timmar. Prover separerades med 8–16 % TGX fläckfria proteingeler (BIO-RAD). Sedan överfördes gelerna till PVDF-membran. Membranen undersöktes med anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb vid en utspädning av 1:4000. Därefter inkuberades membranen med anti-mus-IgG-peroxidaskonjugat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) vid en utspädning av 1:4000. Signalen utvecklades och visualiserades genom kemiluminescens med hjälp av Western Blot ECL-substratkit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Blottbilderna förvärvades genom att använda Odyssey Fc-avbildningssystemet.
2.8. Molekylär massanalys
HPV16 L1, L1:P18I10 och L1:T20 VLP utan 2-ME-behandling filtrerades ut genom 1000 kDa molekylviktsavskärning (MWCO) ultrafiltreringsanordningar (SARTORIUS). HPV16 L1, L1:P18I10 och L1:T20 VLP med 2-ME-behandling passerades genom 100 kDa MWCO ultrafiltreringsenheter (Amicon). Retentaten rekonstituerades till den ursprungliga volymen och samlades upp från filteranordningens provreservoar, medan filtraten samlades upp i botten av centrifugröret. L1-signalen mättes genom att använda en dot-blot som undersöktes med anti-HPV16 L1 mAb och detekterades med anti-mus-IgG-peroxidaskonjugat (Sigma-Aldrich). Bilder förvärvades med hjälp av Odyssey Fc Imaging System vid en kemiluminescenskanal.
Fördelarna med cistanche tubulosa-stärka immunförsvaret
2.9. Negativ färgning och transmissionselektronmikroskopi
Efter laddning av de kolbelagda koppargallren (Sigma-Aldrich) under ultraviolett ljus i 5 minuter, kommer kommersiella HPV16 L1 (Abcam), renade L1:P18I10 och L1:T20 VLPs i jämvikt med 20 mM Tris-HCl (pH 7,4, 137 mM NaCl). ) absorberades på galler under 1 min och sköljdes tre gånger med miliQ vatten. HPV: HIV VLP:er var negativt färgade med 2% uranylacetat vid pH 4,5 (Sigma-Aldrich) under 1 min. Överskott av färgningsmedel avlägsnades med Whatman kvalitativt filterpapper (Sigma-Aldrich). Galler placerades i en avfuktarkammare minst 2 timmar före observation. Bilder togs med hjälp av ett transmissionselektronmikroskop (Tecnai Spirit 120 kV) vid förstoring SA135K (100 nm) respektive SA59000 (200 nm).
2.10. Natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores och Western blottinganalys
Lika mängder (500 ng) HPV16 L1-protein (Abcam), renade L1:P18I10 och L1:T20 VLP:er blandades med 2 x Laemmli provbuffert innehållande 5 % 2-ME och kokades vid 95 ◦C i 5 minuter . Prover separerades med 8–16 % TGX-fläckfria proteingeler och överfördes sedan till ett PVDF-membran (Millipore, Burlington, MA, USA) med en Semi-Dry-överföringsanordning (Bio-Rad). Membranet blockerades med 5 % skummjölk i TBST. Därefter sonderades membranen med anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb vid en spädning av 1:4000, anti-HIV-1 gp120 V3 loop mAb (NIBSC, EVA3012) vid en spädning av 1: 40 och HIV1 gp41 (2F5) mAb (NIBSC, ARP3063) vid en spädning av 1:4000. Därefter inkuberades membranen med anti-mus-IgG-peroxidaskonjugat (Sigma-Aldrich) vid en utspädning av 1:4000. Western ECL substrat kit (BIO-RAD) användes för signalutveckling. Blottbilderna förvärvades genom att använda Odyssey Fc-avbildningssystemet vid en kemiluminescenskanal.
2.11. Immunisering av möss, samling av sera och isolering av splenocyter
Detta är en preliminär proof-of-concept-studie för att visa immunogeniciteten hos HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 och L1:T20 VLPs). Dosen, administreringsvägen och prime-boost-intervallet för vår HPV: HIV VLP hänvisade till tidigare studier som immuniserade möss med bovint papillomvirus (BPV): HIV VLP för att inducera antikroppssvar [20,21]. Renat HPV: HIV VLP emulgerades med en lika stor volym (225 µg per varje 0,5 ml dos) aluminiumhydroxifosfatsulfat (Thermo Fisher), för att säkerställa en liknande formulering som det licensierade Gardasil-9 HPV-vaccinet [40]. Alla musgrupper hade lika könsfördelning (man n=4 och kvinnlig n=4 per grupp). I grupperna A och B immuniserades BALB/c-möss intramuskulärt (im) med 10 µg L1:P18I10 respektive L1:T20 VLP genom att följa en homolog prime-boost-regim. I grupp C inokulerades möss med 106 cfu BCG.HIVA2auxo.int intradermalt (id, vid matdynan) och boostades med 10 µg L1:P18I10 VLPs intramuskulärt. I grupp D inokulerades positiva kontrollmöss med Gardasil- 9 prime följt av Gardasil-9 boost intramuskulärt med 10 µg HPV16 L1 VLPs. I grupp E immuniserades negativa kontrollmöss två gånger med PBS-buffert. Prime-boost-intervallet var 2 veckor. Möss avlivades på dag 28. Blodprover togs från hjärtan på möss. Serum utvanns genom centrifugering och lagrades vid -20 ◦C för ELISA-analys. Murina mjältar avlägsnades och pressades individuellt genom en cellsil (Falcon) med en 5 ml sprutgummikolv. Efter avlägsnande av röda blodkroppar med ACK-lyseringsbuffert (Lonza), tvättades splenocyter och återsuspenderades i lymfocytmedium R10 (RPMI 1640 kompletterat med 10 % fetalt kalvserum (FCS), penicillin-streptomycin, 20 mM HEPES och 15 mM {{ 46}}ME) vid en koncentration av 2 × 107 celler/ml.
2.12. Enzymkopplad immunosorbentanalys
För att testa de HPV16 L1-- och HIV-1-specifika antikropparna som binder till chimär HPV: HIV VLP-konstruktioner in vitro, 50 µL av samma koncentration (200 ng/ml) av rekombinant HPV16 L1-protein (Abcam, ab119880 ), renade L1:P18I10 och L1:T20 VLPs i 50 mM karbonatbikarbonatbuffert (pH=9.6) (Sigma) 2-faldigt serieutspäddes och belades på Maxisorb-plattorna (Nunc). Plattorna inkuberades vid 4 ◦C över natten. Plattorna blockerades med blockeringsbufferten (5 % skummjölk i TBST) vid 37 ◦C i minst 2 timmar. Efter tvätt två gånger med TBST inkuberades de VLP-belagda plattorna med anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb i en utspädning av 1:8000, 2F5 mAb (NIBSC, ARP3063) vid en utspädning av 1:8000 och anti- HIV-1 gp120 V3 loop mAb (NIBSC, EVA3012) vid en spädning av 1:40 i blockerande buffert, respektive, vid 37 ◦C under 2 timmar. Efter tvättning tre gånger med TBST inkuberades plattorna med rekombinant protein G-peroxidaskonjugat (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) i en utspädning av 1:4000 i blockerande buffert vid 37 ◦C under 1 timme. TMB användes för att utveckla signalen för enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) och stoppades med 50 µL 2M H2SO4. Den optiska densiteten (OD) för varje brunn mättes och registrerades vid en våglängd av 450 nm med användning av en EL × 800 absorbans mikroplattläsare.
För att mäta de VLP-inducerade antikropparna i BALB/c-möss belades mikrotiterplattorna med 50 µL 2 µg/mL rekombinant HPV16 L1-protein (Abcam, ab119880), HIV-1 P18I10-peptid (NIBSC, ARP734), T20-peptid (NIBSC, ARP984) respektive med 50 mM karbonat-bikarbonatbuffert (pH=9.6). Plattorna inkuberades vid 4 ◦C över natten. Plattorna blockerades med blockeringsbufferten (5 % skummjölk i TBST) vid 37 ◦C i minst 2 timmar. Samtidigt späddes sera uppsamlat från gruppen AE-immuniserade möss med 5 % skummjölk i TBST i ett förhållande av 1:50. Efter tvättning två gånger med TBST inkuberades plattorna med det utspädda serumet vid 37 ◦C under 2 timmar. Efter tvättning tre gånger med TBST tillsattes plattorna rekombinant protein G HRP-konjugat i en utspädning av 1:4000 i blockeringsbuffert och inkuberades vid 37 ◦C under 1 timme. TMB användes för att utveckla ELISA-signalen och stoppades med 50 µL 2M H2SO4. OD för varje brunn mättes vid en våglängd av 450 nm med användning av en EL × 800 absorbans mikroplattläsare (Biotek).
2.13. IFN-ELISpot-analys
Analysen av enzymkopplade immunabsorberande fläckar (ELISpot) utfördes med användning av det kommersiella murina IFN-ELISpot-kitet (Mabtech, Nacka Strand, Sverige), enligt tillverkarens instruktioner. ELISpot-plattorna (MSISP4510, 96-brunnsplattor med polyvinylidendifluoridmembran, Millipore, Middlesex County, MA, USA) var 70 % EtOH-behandlade och belagda med renad anti-mus-interferon- (IFN-) infångande monoklonal antikropp utspädd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en slutlig koncentration av 5 µg/ml vid 4 ◦C över natten. Sedan sattes 2,5 x 105 färska splenocyter till varje brunn. Därefter stimulerades cellerna från grupperna A och B med 2 µg/mL HPV16 L1 VLPs respektive HIV-1 P18I10-peptider. Alla prover och kontroller ströks ut i dubbla brunnar. ELISpot-analyser inkuberades i 16 timmar vid 37 ◦C, 5 % CO2. Plattorna tvättades därefter 5 x med PBS, inkuberades i 2 timmar med en biotinylerad anti-IFN-monoklonal antikropp (mAb) utspädd i PBS 2 % fetalt kalvserum (FCS) till en slutlig koncentration av 2 µg/ml, tvättades 5 gånger i PBS, och inkuberades med streptavidin-alkaliskt fosfataskonjugatet i PBS 2% FCS. Därefter tvättades plattorna 5 gånger med PBS innan de inkuberades med 100 µL 5-bromo-4-kloro-3-indolylfosfat (BCIP)/nitroblått tetrazolium (NBT) substratlösning (Sigma-Aldrich) , St. Louis, MO, USA). Efter 5–10 minuter tvättades plattorna med kranvatten, torkades och de resulterande fläckarna räknades med en ELISPOT-läsare (AID, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasberg, Tyskland). För varje djur subtraherades medelvärdet av bakgrundssvar individuellt från alla brunnar för att möjliggöra en jämförelse av de IFN-fläckbildande cellerna (SFC)/106 mellan grupper. För att definiera positiva svar definierades ett tröskelvärde som minst fem fläckar per brunn, och svar som översteg medelantalet fläckar i negativa kontrollbrunnar plus tre standardavvikelser för de negativa kontrollbrunnarna.
2.14. Statistisk analys
All statistisk analys utfördes med Prism 6 GraphPad programvara (CA, USA). Vi använde data från experiment utförda över 5 olika ELISA-plattbeläggningskoncentrationer (0, 50, 100, 150, 200 ng/mL) av rekombinant HPV16 L1-protein (Abcam, ab119880) och HPV: HIV VLPs. Vi samlade in data från 2 grupper (HPV16 L1 och HPV: HIV VLPs) och samlade in tre replikat för varje beläggningskoncentration. Grafen i Prism visade data som ett spridningsdiagram som visar beläggningskoncentration (ng/ml) på X-axeln och OD450 på Y-axeln. Eftersom vi antog att våra in vitro ELISA-data är relaterade i ett linjärt mönster, utförde vi den linjära regressionsanalysen och jämförde lutningarna för de två linjerna för att bekräfta datamängden-1 och datamängden-2 (antikropp reaktivitet mellan HPV16 L1 och HPV: HIV VLPs) är olika i sina handlingar. Vi valde 95 % konfidensintervall tillsammans med den bästa passformen. Prisma överlagrade automatiskt en linjär regressionslinje på båda våra datamängder och den har ritat en prickad linje som representerar 95 % konfidensintervall. Under den linjära regressionsanalysen beräknade programvaran endast det genomsnittliga Y-värdet för vår datamängd som visade att passformen var god. Dessutom gav Prism oss en kommentar, så vi kan dra slutsatsen att skillnaderna mellan de två backarna är extremt betydande.
Vi hade 5 uppsättningar (ELISA) och 4 uppsättningar (ELISPOT) av data insamlade från musimmuniseringsexperiment. Dessa datamängder hade lika många (man n=4 och kvinnlig n=4) i varje grupp. Vi använde Gardasil-9-immuniserade möss som en positiv kontrollgrupp och PBS-immuniserade möss som en negativ kontrollgrupp. Data från våra designade experiment matchade inte eller parades inte. Vi genomförde en envägsanalys av varians (ANOVA) för att se om dessa medel var olika. Vi kontrollerade först att våra data passade den Gaussiska normalfördelningen. Vi fann att vissa grupper av data i ELISA-analysen inte klarade Gaussisk normalfördelningstestet. Därför genomförde vi en icke-parametrisk statistisk analys av dessa data. Däremot har alla grupper av data i ELISPOT-analysen förbi det Gaussiska normalfördelningstestet. Således utförde vi en parametrisk statistisk analys av dessa data. Signifikanströskeln och konfidensnivån sattes till 0.05 (motsvarande ett 95 % konfidensintervall). p-värde som visar generellt sannolikheten för att det finns skillnader mellan grupper. Eftersom vår huvudsakliga oro för detta experiment är vad som är skillnaderna mellan våra grupper, gav de multipla jämförelserna i Prism oss resultatet av jämförelsen i alla grupper med alla andra grupper.
2.15. Etiska uttalanden
Sex till åtta veckor gamla BALB/c-möss köptes från Envigo (ett Inotiv Company, Chicago, IL, USA) och godkändes av lokala myndigheter (Generalitat de Catalunya, projektnummer 11157) och Universitat Autònoma de Barcelona Ethics Commitee. Djurförsöken överensstämde strikt med djurskyddslagstiftningen i Generalitat de Catalunya. Alla experiment godkändes av den lokala forskningsetiska kommittén (Procedur 43.19, Hospital de la Vall d'Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona).
3. Resultat
3.1. Design av L1:P18I10 och L1:T20 immunogener och utvärdering av HPV: HIV-proteinuttryck genom att använda 293F-uttryckssystem
P18I10-peptiden från HIV-1 Env tredje variabla domänen (V3)-loopen och T20-peptiden från HIV-1 Env-membranets proximala yttre region (MPER) sattes in i HPV16 L1 DE-loopproteinet för att generera chimärt L1 :P18I10 och L1:T20 immunogener. De chimära L1:P18I10- och L1:T20-DNA-kodande sekvenserna klonades in i pcDNA3.1 (+) plasmid-DNA-expressionsvektor för transient transfektion i 293F-celler (Figur lA). Monomerstrukturerna för HPV16 L1, chimära L1:P18I10 och L1:T20 kapsidproteiner förutspåddes preliminärt med användning av SWISS-modellservern (Figur 1B). HPV16 huvudkapsidprotein L1 (7cn2.1.R) valdes som den strukturella mallen för att bygga HPV16 L1, L1:P18I10 och L1:T20 kapsidproteinhomologimodellering. Jämfört med konformationen av den bundna P18I10-peptiden i den tidigare studien [41], löper huvudkedjans N till C-terminalriktning för P18I10-peptiden på vårt chimära L1:P18I10-protein från höger till vänster (Figur 1B, mitten och övre panelen), och de exponerande P18I10-sidokedjorna skulle potentiellt kunna interagera med T-cellsreceptorer (Figur 1B, mitten och bottenpanelen). Jämfört med strukturen av HIV-1-fusionshämmarpeptiden i det tidigare översiktsdokumentet [42], presenteras den infogade T20-peptiden på HPV16 L1-kapsidproteinet som en -helixliknande formation (Figur 1B, höger och övre panelen) ), och de exponerande T20-sidokedjorna skulle potentiellt kunna kännas igen av B-cellsreceptorer (Figur IB, högra och nedre panelen). Eftersom HPV16 L1-kapsidproteiner homogent kunde sammanfogas till en T=7 ikosaedrisk partikel med 72 pentameriska kapsomerer [43], är högdensitetsvisningen av P18I10- eller T20-peptider på den yttre ytan av chimär HPV: HIV-VLP är potentiellt starkt immunstimulerande för att inducera epitopspecifika immunsvar.
Figur 1. L1:P18I10- och L1:T20-immunogendesign och konstruktion av chimär HPV: HIV-VLP genom att använda 293F-expressionssystem. (A) De chimära L1:P18I10- och L1:T20-DNA-kodande sekvenserna klonades in i pcDNA3.1+-expressionsvektorer respektive för transient transfektion i 293F-celler. (B) Förutsägelse av monomerstrukturer av HPV16 L1 och chimär HPV: HIV-kapsidproteiner med hjälp av SWISS-modellservern. HPV16 huvudkapsidprotein L1 (7cn2.1.R) valdes som den strukturella mallen för att bygga HPV16 L1 (vänster panel), L1:P18I10 (mittpanelen) och L1:T20 (höger panel) kapsidproteinhomologimodellering. Sekundära strukturella element av HPV16 L1-kapsidprotein är märkta med bokstäverna h1–h5 för 5 -helixarna. Slingor av HPV16 L1-kapsidprotein mellan strängarna är märkta BC, CD, DE, EF, FG och HI. Sekundära strukturella element av HIV-1 P18I10- och T20-peptiderna L1 är märkta med pilarna (övre panelen). Den del av P18I10- och T20-peptiden som sticker ut över ytan av HPV16 L1-kapsidproteinet indikeras av pilarna (nedre panelen). (C) Immunfluorescensfärgning av L1-protein i 293F-celler. Följande pDNA.L1:P18I10 (vänster), pDNA.L1:T20 (mitten) och pDNA utan insättning (höger) transfekterades i 293F-celler. De transfekterade cellerna sonderades med anti-HPV16 L1 mAb och detekterades med anti-mus IgG-FITC (grön kanal). Cellkärnor färgades med DAPI (blå kanal). Immunfluorescensbilder slogs samman med hjälp av Adobe Photoshop
Eftersom HPV16 L1-protein C-terminalsekvensen förmedlar cellulärt kärnimportmaskineri under infektion [44], har nukleära lokaliseringssignaler (NLS) av HPV16 L1-protein identifierats i tidigare studier [45]. Den monoklonala CAMVIR-1-antikroppen valdes för att känna igen HPV16 L1-epitop (GFGAMDF, 230–236 aa) [39], och fluoresceinbaserat färgämne FITC användes som reporter för att övervaka uttrycket av L1:P18I10 och L1: T20-proteiner. Immunfluo rnärvarobilder visade tydligt att HPV16 L1 (i grönt) huvudsakligen var lokaliserat i kärnorna (i blått) av 293F-celler. Ingen L1-signal observerades i kontrollplasmid-transekerade 293F-celler (pcDNA3.1-plasmid utan infogning) (Figur IC). Resultaten antydde att både chimära L1:P18I10- och L1:T20-kapsidproteiner kunde uttryckas genom att använda polyetylenimin (PEI)-medierad transfektion och igenkännas av HPV16 L1 CAMVIR-1 monoklonal antikropp.
3.2. Rening av L1:P18I10 och L1:T20 VLP:er genom att använda kromatografiska metoder
The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 kDa och ett heterologt lägre band<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.
Figur 2. Rening och karakterisering av L1:P18I10 och L1:T20 VLP. (A) Schematiskt processflödesschema för L1:P18I10 och L1:T20 VLP-rening genom kromatografi. (B, C) Western blot-analys av L1:P18I10- och L1:T20-VLP-prover från varje reningssteg. Signalen för L1 i varje reningssteg karakteriserades av Western blot-analys undersökt med anti-HPV16 L1 mAb. Pilen indikerar molekylvikten för ~56 kDa för L1:P18I10 och ~58 kDa för L1:T20-proteiner. Spår 1: klargjort cellysat (CCL); Spår 2: genomströmning (FT) från katjonbyteskromatografi (CEC) provladdning; Spår 3: CEC-eluat; Spår 4: FT från CEC 2M NaCl-regenereringssteg; Spår 5: storleksuteslutningskromatografi (SEC) FT-1; Bana 6: SEC FT-2; Spår 7: FT från heparinaffinitetskromatografi (H-AC) provladdning; Spår 8: H-AC-eluat; Bana 9: FT från H-AC 2M NaCl-regenereringssteg; Bana 10: 10-faldig diafiltrering.
3.3. In vitro stabilitet och självmontering av L1:P18I10 och L1:T20 VLPs
För att bekräfta att renade HPV: HIV VLPs visade liknande stabilitet in vitro som HPV16 L1 VLPs, utförde vi icke-reducerande SDS-PAGE för att utvärdera disulfid tvärbindning av HPV: HIV kapsidproteiner (Figur 3A). Det är känt att pH, jonstyrka, temperatur [52] och redoxmiljö alla korrelerar med disulfidbindningar av HPV16 L1 kapsidproteiner [53]. HPV L1 VLPs tenderar att självmontera vid lågt pH och hög jonstyrka. Maximal demontering av VLP kräver vanligtvis exponering för en hög koncentration av reduktionsmedel, såsom 5 % 2-merkaptoetanol (2-ME) under en relativt lång tid [54]. I frånvaro av reduktionsmedel 2-ME migrerade endast en liten del av HPV-16 L1-, L1:P18I10- och L1:T20-proteinet till monomerer med en skenbar molekylvikt (MW) på 55 kDa . Ungefär 70 % av L1-proteinerna var disulfidbundna till större dimerer eller pentamerer, med förutsagd MW på 110 kDa och 280 kDa (Figur 3A, spår 2, 4 och 6). Däremot visade nästan alla HPV-16 L1-, L1:P18I10- och L1:T20-proteiner i demonteringsbufferten monomera strukturer i icke-reducerande SDS-PAGE (Figur 3A, bana 3, 5 och 7). Dessa resultat indikerade att in vitro-stabilitet för renade L1:P18I10 och L1:T20 VLPs uppvisade liknande disulfidtvärbindningsmönster som HPV16 L1 VLPs under samma pH, jonstyrka och termiska betingelser. De renade VLP:erna verkar brytas ner till nivån av pentamerer, trimerer och dimerer efter långvarig exponering för höga koncentrationer av reduktionsmedel. Dessa data är i överensstämmelse med tidigare studier [53,54] Men demonteringen av HPV: HIV VLPs var fortfarande långt ifrån komplett (monomerer).
Figur 3. In vitro-stabilitet för L1:P18I10 och L1:T20 VLPs. (A) Disulfid tvärbindning av L1:P18I10 och L1:T20 VLPs i icke-reducerande SDS-PAGE. HPV16 L1 VLP, renad L1:P18I10 och L1:T20 VLP blandades med Laemmli provbuffert i frånvaro eller närvaro av 2-merkaptoetanol (2-ME), respektive, och analyserades genom icke-reducerande SDS-SIDA. Positionen för L1-monomeren (55 kDa), L1-dimeren (110 kDa) och L1-pentameren (280 kDa) indikeras med pilen. Spår 1: proteinmolekylviktsmarkör; Spår 2: HPV16 L1 VLP; Bana 3: HPV16 L1 VLP behandlad med 2-ME; Spår 4: Ll:P18I10 VLP; Bana 5: L1:P18I10 VLP behandlad med 2-ME; Spår 6: Ll:T20 VLP; Bana 7: L1:T20 VLP behandlad med 2-ME. (B) Molekylmassaanalys av L1:P18I10 och L1:T20 VLPs. Sammansatta VLP:er obehandlade med 2-ME (banorna 2, 4 och 6) filtrerades ut genom 1000 kDa molekylviktsavskärningsanordningar (MWCO) diafiltreringsanordningar (övre panel). Demonterade VLPs behandlade med 2-ME (banorna 3, 5 och 7) filtrerades ut genom 100 kDa MWCO centrifugalfilteranordningar (nedre panelen). Retentaten (R) uppsamlades från filteranordningens provreservoarer, medan filtraten (F) samlades upp i botten av centrifugrören. L1-proteinsignalen detekterades genom att använda en dot-blot undersökt med anti-HPV16 L1 mAb.
To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 kDa) och konserverades i retentater. Mönstret överensstämde med de data som observerades i icke-reducerande SDS-PAGE. Även om alla VLP-grupper behandlade med 2-ME visades i ett monomert band (~55 kDa) i den icke-reducerande SDS-PAGE (Figur 3A, bana 3, 5 och 7). Men motsvarande reducerade VLP filtrerades inte ut genom 100 kDa ultrafiltreringsmembran (Figur 3B, bottenpanel). Dessa resultat antydde att chimära HPV: HIV-proteiner kunde självmontera till större partiklar, men maximal demontering av VLP:er till monomerer krävde inte bara reduktion av disulfidbindningar utan även andra denaturerande faktorer, såsom pH eller jonstyrka.
3.4. Morfologisk karaktärisering av L1:P18I10 och L1:T20 VLPs
Transmissionselektronmikroskopi (TEM) användes för att undersöka den morfologiska konformationen av HPV16 L1 och HPV: HIV VLPs. HIV-1 P18I10- och T20-peptiderna infogades i DE-loopar av HPV16 L1-proteinet. Dessa kommersiella HPV16 L1 och chimära HPV: HIV-kapsidproteiner kan spontant självmontera in vitro till integrerade VLP: er med en diameter på cirka 50–60 nm (Figur 4A–C, högra panelen). Jämfört med elektronmikrofotografier av HPV16 L1 VLPs publicerade i tidigare studier [55,56], var den ikosaedriska strukturen av HPV16 L1, L1:P18I10 och L1:T20 VLPs här mindre kontrasterande och vaga. Det kan tillskrivas det negativa färgreagenset som vi använde i denna studie. I vår senaste studie publicerad i en tidigare studie [37] och ett annat pågående dokument under peer review (data visas inte), har vi fått god kvalitet och upplösning på elektronmikrofotografier när jäst- och baculovirus-härledda L1:P18I10 VLPs (samma chimära konstruktion) ekvilibrerades i PBS och negativt färgades med fosfovolframsyra (PTA). Eftersom vi använde de olika VLP-produktions- och reningssystemen i denna studie, jämviktades L1:P18I10 och L1:T20 VLP från däggdjursceller med Tris-HCl och negativt färgade med uranylacetat. Även om elektronmikrofotografierna kunde förbättras kunde vi fortfarande observera ett tydligt mönster att det mesta av HPV16 L1-, L1:P18I10- och L1:T20-kapsidproteinet kunde självmontera till morfologiska VLPs under TEM-skärm (Figur 4A–C, vänster panel ). I grund och botten är HPV-VLP skyddade mot aggregering under höga saltförhållanden [57]. En del av den detekterbara aggregeringen av HPV16 L1 och HPV: HIV VLPs i tris-HCl-buffert med låg salthalt kunde ses under den nedre förstoringen (Figur 4A–C, vänster panel). Från dessa resultat drog vi slutsatsen att modifiering av partiell L1 DE-loopsekvens genom infogning av HIV-1 P18I10- eller T20-peptider inte signifikant påverkade morfologin hos HPV: HIV VLPs.
Figur 4. Elektronmikrofotografier av L1:P18I10 och L1:T20 VLP. (A) Morfologi av HPV16 VLPs. (B) Morfologi för L1:P18I10 VLPs. (C) Morfologi för L1:T20 VLPs. Renade VLP absorberades på UV-laddade kolbelagda koppargaller och färgades negativt med 2% uranylacetat. Bilder togs under transmissionselektronmikroskopi. Stapeln representerar 200 nm vid förstoring 59,000 (vänster panel) respektive 100 nm vid förstoring 135K (höger paneler), respektive
3.5. Presentation och reaktivitet av HPV-16- och HIV-1-epitoper
För att bekräfta att sekventiella HIV-1 P18I10- eller 2F5-epitoper presenterades i kromatografirenade L1:P18I10- eller L1:T20-VLP:er, utfördes Western blot-analys och indirekt ELISA med användning av epitopspecifika mAbs. Vi valde en välkänd monoklonal antikropp (mAb), betecknad CAMVIR -1, för att känna igen den mycket konserverade epitopen (GFGAMDF, aa 230–236) av HPV16 L1-protein [39,58]. En tidigare publicerad mAb riktad mot HIV-1 gp120 V3 loop-epitop (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308–322) valdes för att detektera sekventiella P18I10-epitoper (RGPGRAFVTI, aa311–320) [59]. Å andra sidan valdes den breda neutraliserande antikroppen (bnAb) som känner igen HIV-1 gp41 2F5-epitop (ELDKWA) mot en mängd olika laboratorie-HIV-1-stammar för T20-peptidkarakterisering [ 60,61]. Western blot-analys undersökt med HPV16 L1 mAb visade band 55, 56 och 58 kDa motsvarande HPV16 L1, L1:P18I10 respektive L1:T20 protein (Figur 5A, B, vänster). Molekylvikten (MW) för L1:P18I10-protein liknade HPV16 L1-protein (Figur 5A, vänster). Bandet som motsvarar L1:T20-protein observerades något högre än HPV16 L1-protein, som förutspåtts från den ytterligare aminosyrasekvensen (Figur 5B, till vänster). Banden på cirka 56 och 58 kDa, motsvarande L1:P18I10- och L1:T20-protein, detekterades i Western blot-analys som undersöktes med anti-HIV-1 gp120 V3 respektive 2F5 mAb (Figur 5A, B, höger ). Vi trodde att molekylvikten (MW) för anti-2F5-färgat L1:T20-protein var korrekt och passade in på de förväntade 58 kDa (Figur 5B, höger). MW för anti-HIV-1 gp120 V3-färgat L1:P18I10-protein är dock lite lägre (Figur 5A, höger). Detta kan tillskrivas den heterogena strukturen hos chimära L1:P18I10-proteiner. Eftersom den sekventiella epitopkonformationen kan gå förlorad under denaturerande tillståndet i SDS-PAGE. Därför utförde vi ytterligare indirekt ELISA för att demonstrera den konformationella P18I10-peptiden korrekt presenterad på våra chimära L1:P18I10 VLPs (Figur 5E). Å andra sidan kände anti-HIV-1 gp120 V3 loop-antikroppen som vi använde igen hela HIV{103}} V3-loopen snarare än P18I10-epitopen. Följaktligen var den totala anti-V3-signalen lägre (Figur 5A, B, högra paneler). Trots detta indikerade dessa resultat att de sekventiella HIV-1 P18I10- och T20-peptiderna presenteras i HPV: HIV VLPs.
Figur 5. Presentation av HPV-16- och HIV-1-epitoper. (A, B) Sekventiell epitopdetektion av chimära L1:P18I10 och L1:T20 VLPs. De renade L1:P18I10 och L1:T20 VLP:erna analyserades med Western blot, med användning av anti-HPV16 L1, anti-HIV-1 gp120 V3 och 2F5 mAb. HPV16 L1 VLPs användes som en kontroll. Molekylvikten för proteinerna L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa) och L1:T20 (58 kDa) indikeras med pilen. Spår 1: proteinmolekylviktsmarkör; Spår 2: HPV16 Ll-protein; Spår 3: Ll:P18I10-protein; Bana 4: L1:T20-protein. (C, D) Bindning av HPV16 L1 mAb till chimära L1:P18I10 och L1:T20 VLPs. (E) Bindning av anti-HIV-1 gp120 V3 mAb till chimära L1:P18I10 VLPs. (F) Bindning av HIV-1 2F5 mAb till chimära L1:T20 VLPs. Linjediagrammet för indirekta ELISA utfördes för att detektera de konformationella epitoperna av rekombinanta HPV16 L1, L1:P18I10 och L1:T20 VLPs bundna till anti-L1, anti-HIV-1 gp120 V3 respektive 2F5 mAbs. Data är representativa för tre oberoende experiment. Ett enkelt linjärt regressionstest gjordes för att jämföra linjeskillnaden för renade L1:P18I10 och L1:T20 VLPs med standardkurvan för kommersiella L1 VLPs; ns: ej signifikant; ** p < 0,01.
Dessutom, för att avgöra om HIV{{{{50}}}} konformationsepitoper presenterade på HPV: HIV VLP kunde identifieras av de gp120 V3 och 2F5 neutraliserande antikropparna in vitro, utförde vi en indirekt ELISA-analys för att kontrollera den epitopbindande specificiteten och reaktiviteten. Såsom visas i figur 5C, kändes D, HPV16 L1, L1:P18I10 och L1:T20 VLP igen av anti-L1 mAb. Vi utförde linjär regressionsanalys för att jämföra lutningen för varje utspädningslinje. Resultaten avslöjade att L1-epitopbindningsspecificiteten för antingen L1:P18I10 eller L1:T20 VLPs inte skilde sig från HPV16 L1 VLPs. Dessutom kunde anti-HIV-1 gp120 V3 mAb binda L1:P18I10 VLPs, men inte HPV16 L1 VLPs (Figur 5E). Dessutom kunde 2F5 mAb känna igen L1:T20 VLPs, men inte HPV16 L1 VLPs (Figur 5F). Efter linjär regressionsanalys var skillnaden i gp120 V3 epitopbindande specificitet mellan L1:P18I10 och HPV16 L1 extremt signifikant (p < 0,01%). 2F5-epitopbindningsspecificiteten för L1:T20-VLP:er skilde sig signifikant från HPV16 L1-VLP:er (p < 0,01%). Detta mönster avslöjade att hydrofoba cellulära lipider inte var nödvändiga för bindningen av 2F5-neutraliserande antikroppar mot HPV: HIV VLPs in vitro. Även om reaktiviteten hos anti-HIV-1 gp120 V3 och 2F5 neutraliserande antikroppar mot HPV: HIV VLPs är relativt mild, var bindningen av anti-HIV-1 gp120 V3 och 2F5 mAb till HPV: HIV VLPs signifikant epitopspecifik.
3.6. Immunogenicitet av L1:P18I10 och L1:T20 VLP efter BALB/c mössimmunisering
Vi utvärderade de HPV16- och HIV-1-specifika immunsvaren efter immunisering av BALB/c möss med L1:P18I10 och L1:T20 VLPs. Immuniseringsschemat visas i figur 6A. Eftersom VLP-inducerad immunogenicitet efter administrering av slemhinnor i allmänhet var svagare än efter systemisk administrering, immuniserades möss intramuskulärt med en sjättedel av Gardasil-9 HPV16 L1-dosen [22,62]. Adjuvansen för aluminiumhydroxifosfatsulfat för en dos (10 µg/100 µL) chimär HPV: HIV VLP justerades till samma koncentration (1 mg/1 ml) som Gardasil-9. För att bedöma könsskillnaden i vaccinationsresultaten utvärderades en jämförelse av antikroppssvar mellan hanmöss (n=4) och honmöss (n=4). I gruppen L1:P18I10 VLP, L1:T20 VLP och Gardasil-9 var anti-HPV16 L1-antikroppssvar från honmöss i genomsnitt högre än de hanmöss (Figur 6B). 2 av 4 (50 %) L1:P18I10 VLP-immuniserade honor, 3 av 4 (75 %) L1:T20 VLP-immuniserade honor och alla (100 %) Gardasil-immuniserade honmöss framkallade högre titer av anti-L1-antikroppar än hanmöss. Anti-L1-svar inducerade av honmöss i Gardasil-9-gruppen var signifikant högre än hanmöss (p=0.0041) (Figur 6B). En mycket låg nivå av anti-L1-antikroppssvar detekterades i gruppen BCG.HIVA-priming och L1:P18I10 VLP-förstärkning. Detta mönster motsvarar tidigare fynd som beskriver att BCG övervägande inducerar T-cellssvar snarare än IgG-produktion [63].
Figur 6. Induktion av humorala immunsvar av L1:P18I10 och L1:T20 VLPs i BALB/c-möss. Immuniseringsschemat är avbildat i (A) Alla musgrupper hade lika könsfördelning (man n=4 och kvinnlig n=4). Grupperna A och B: homolog prime-boost-immunisering med 10 µg L1:P18I10 eller L1:T20 VLPs intramuskulärt (im); Grupp C: priming med 106 cfu rBCG.HIVA intradermalt (id) och förstärkning med 10 µg L1:P18I10 VLPs im; Grupp D: homolog prime-boost-vaccination med Gardasil-9 innehållande 10 µg HPV16 L1 VLP im; Grupp E: immunisering två gånger med PBS-buffert. Prime-boost-intervallet var 2 veckor. Slutpunkten för denna prövning var dag 28. Sera uppsamlades och späddes vid en titer av 1:50 för ELISA-analys. (B) HPV L1-specifik IgG hos möss av hankön och hona. (C–E) Epitopspecifik IgG inducerad av L1:P18I10 och L1:T20 VLPs. ELISA utfördes för att analysera anti-L1, anti-P18I10 och anti-T20 IgG inducerade av BALB/c-möss efter olika prime-boost-kombinationer som beskrivits ovan. Data visas som medelvärde ± SD Envägs ANOVA (icke-parametriskt) test gjordes för att jämföra skillnader mellan grupper. OD: optisk densitet. Ns inte signifikant; ** p < 0,01
Vi bedömde om möss immuniserade med L1: P18110 och L1: T20 VLP kunde inducera HPV-16 L1-specifika och HIV-1 epitopspecifika antikroppar i BALB/c-möss. VLP-inducerade IgG-antikroppar i murina sera mättes med ELISA belagd med rekombinant HPV16 L1-protein, P18I10 respektive T20-peptider. En statistisk skillnad i L1-specifik IgG vid en serumtiter på 1:50 upptäcktes i Gardasil-9-gruppen jämfört med PBS-kontrollgruppen (p=0.0039). Anti-L1-svaren bland Gardasil-9, L1:P18I10 och L1:T20 VLP-immuniserade möss var liknande och skilde sig inte signifikant (Figur 6C). BCG.HIVA2auxo.int prime och L1:P18I10 VLP boost möss framkallade en mycket låg nivå av anti-L1 IgG. Dessa resultat antydde att HPV: HIV VLP-immuniserade möss producerade samma nivå av anti-L1 IgG som Gardasil-9-immuniserade möss (Figur 6C). Även om L1:P18I10 VLP-gruppen numeriskt verkar ha en trend mot en högre nivå av P18I10-epitopspecifik IgG än andra immuniseringsgrupper, var dessa skillnader inte statistiskt signifikanta (Figur 6D). Hos några av L1:P18I10 VLP-immuniserade möss (4 av 8, 50 %) observerades högre anti-P18I10-bindande antikroppar jämfört med Gardasil-9-immuniserade möss. Alternativt visade en T-testanalys att skillnaden mellan L1:P18I10 VLP- och Gardasil-9-gruppen var signifikant (p=0.005) (data visas inte). I L1:T20 VLP-gruppen detekterades ett signifikant högre antikroppssvar mot T20-peptiden jämfört med Gardasil-9-gruppen (p=0.0083). Som väntat var anti-T20-titrar odetekterbara i Gardasil-9, PBS, L1:P18I10 VLP och BCG.HIVA prime kombinerat med L1:P18I10 VLP-förstärkningsgrupper (Figur 6E). Titern för den T20-peptidspecifika antikroppen var relativt låg. Detta beror sannolikt på: (1) T20 är en subdominant peptid; (2) framkallande av MPER- eller 2F5-neutraliserande antikroppar kräver peptid-lipidkonjugat (Figur 6E). Sammantaget visade våra resultat att L1:P18I10 och L1:T20 VLPs kunde inducera HPV16- men svaga HIV-1-specifika antikroppssvar hos möss.
cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret
För att utvärdera HPV- och HIV-specifika T-cellsimmunsvar hos möss följde vi immuniseringsschemat som visas i figur 7A. Dessutom jämfördes heterolog BCG.HIVA2auxo.int priming och L1:P18I10 VLPs boosting med homolog L1:P18I10 VLP prime och boost immunisering för att utvärdera frekvensen av specifika HPV16 och HIV-1 T-cellsimmunsvar. Det fanns inga skillnader mellan Gardasil-9- och PBS-grupper när det gäller IFN-sekretionen efter splenocytstimulering med HPV16 L1 VLPs. Skillnader i L1--specifik IFN-sekretion var inte heller signifikanta mellan grupperna L1:P18I10 VLP och Gardasil-9. Vi drog slutsatsen att den svaga L1-specifika IFN-utsöndringen kan tillskrivas den låga koncentrationen (2 µg/ml) av HPV16 L1 VLPs som används som stimuli. Gruppen BCG.HIVA2auxo.int prime och L1:P18I10 VLP-boost inducerade högre frekvens av IFN-utsöndrande splenocyter och signifikanta skillnader i IFN-sekretion observerades jämfört med möss vaccinerade med Gardasil-9-gruppen (p {{36 }}.0103). 3 av 8 möss (~38%) framkallade de högsta L1--specifika IFN-svaren (Figur 7B). Detta kan tillskrivas den ospecifika adjuvansiteten hos BCG enligt våra tidigare studier [64-66]. Den uppenbara primingeffekten, även av vildtyp BCG, är i linje med förmågan hos rBCG-derivat att fungera som potenta adjuvans för efterföljande boostande vacciner [64,65]. När det gäller HIV-1-specifika T-cellssvar, observerades den högsta totala storleken av IFN-fläckbildande celler (SFC)/106 splenocyter i BCG.HIVA2auxo.int-primade möss jämfört med möss som fick Gardasil{{54} } vacciner eller L1:P18I10 VLPs. Möss primerade med BCG.HIVA och boostade med L1:P18I10 VLPs framkallade signifikant högre IFN-sekretion jämfört med möss vaccinerade med L1:P18I10 VLP homolog prime-boost (p=0.0268). Dessutom observerades en signifikant högre IFN-sekretion hos möss vaccinerade med L1:P18I10 VLPs jämfört med möss som fick Gardasil-9-vaccin (p=0.0157) (Figur 7C). Som väntat var IFN-utsöndringen odetekterbar i Gardasil-9- och PBS-grupper. Dessa resultat visade att (1) L1:P18I10 VLP framkallade HIV-1-specifika T-cellsimmunsvar; (2) L1:P18I10 VLPs framkallade HPV-specifika T-cellsimmunsvar och (3) BCG.HIVA2auxo.int kunde förstärka de HIV-1-specifika T-cellsimmunsvaren framkallade av L1:P18I10 VLP.
Figur 7. Induktion av HPV16- och HIV-1-specifika T-cellssvar av chimära L1:P8I10-VLP:er och BCG.HIVA i BALB/c-möss. Immuniseringsschemat är avbildat i (A). Alla musgrupper hade lika könsfördelning (man n=4 och kvinnlig n=4). Grupp A: homolog prime-boost immunisering med 10 ug L1:P18I10 VLPs intramuskulärt (im); Grupp B: priming med 106 cfu rBCG.HIVA intradermalt (id) och förstärkning med 10 µg L1:P18I10 VLPs im; Grupp C: homolog prime-boost-vaccination med Gardasil-9 innehållande 10 µg HPV16 L1 VLP im; Grupp D: immunisering två gånger med PBS-buffert. Prime-boost-intervallet var 2 veckor. Slutpunkten för denna studie var dag 28. Splenocyter isolerades för IFN-ELISpot-analys. T-cellsimmunsvar mot HPV16 och HIV-1 bedömdes ex vivo med IFN-ELISpot efter splenocytstimulering med HPV16 L1 VLP och P18I10 peptid. (B, C) HPV16 L1- och HIV-1 P8I10-specifika T-cellssvar framkallade av L1:P8I10 VLPs och BCG.HIVA prime kombinerat med L1:P18I10 VLP boost. Data visas som median ± SD Ett envägs ANOVA-test gjordes för att jämföra skillnader mellan grupper. Ns inte signifikant; * p < 0,05.
4. Discussion
Både HPV16 och HIV-1 är sexuellt överförbara sjukdomar och är för närvarande i fokus för många vaccinstudier. Även om HPV-profylaktiska vacciner har kommersialiserats och HIV-1-överföringen i hög grad har kontrollerats av antiretroviral behandling (ART) och PrEP, är ett effektivt, säkert och prisvärt chimärt HPV: HIV-vaccin mot båda virusen ett akut behov. I denna studie, (1) visade vi att 293F-expressionssystemet och den kromatografiska reningsmetoden kan vara möjliga tillvägagångssätt för att producera och rena chimära L1:P18I10 och L1:T20 VLPs; (2) vi bekräftade att införandet av P18I10- eller T20-peptider i DE-slingan av HPV16 L1-kapsidproteiner inte påverkade in vitro-stabilitet, självmontering och morfologi hos chimära HPV: HIV VLP; (3) De sekventiella och konformationella P18I10- eller T20-peptiderna exponerade för DE-loopar av chimär HPV: HIV-VLP:er kunde detekteras av anti-HIV-1 gp120 V3- och 2F5-neutraliserande antikroppar in vitro; (4) De chimära L1:P18I10 och L1:T20 VLP:erna kunde framkalla HPV men svaga HIV-1-specifika bindande antikroppar i BALB/c möss. Dessutom påverkade inte införandet av HIV-1 P18I10- eller T20-peptider i HPV16 L1-proteinet HPV16 L1-specifik antikroppsinduktion in vivo; (5) L1:P18I10 VLP kan inducera både HPV16 och HIV-1-specifika T-cellssvar; (6) BCG.HIVA prime- och L1:P18I10 VLP-boost framkallade den högsta magnituden av IFN-producerande splenocyter i jämförelse med L1:P18I10 VLPs homologa prime-boost i BALB/c-möss. Dessa fynd stödde ytterligare utveckling av HIV-1-vacciner baserade på rBCG och chimär HPV: HIV VLP. Sammantaget ger denna studie en baslinjestrategi som kan vara värd att stödja de globala ansträngningarna att utveckla nya chimära VLP-baserade vacciner för att kontrollera HPV- och HIV-infektioner.
I denna studie kunde L1:P18I10 och L1:T20 VLPs inducera samma nivå av anti-HPV16 L1-bindande antikroppar som HPV Gardasil-9-vaccinet. Emellertid framkallar L1:P18I10 och L1:T20 VLP endast låga nivåer av P18I10 och T20 epitopspecifika HIV-bindande antikroppssvar. Vi antog att det kan bero på att ELISA-analysplattor är belagda med rekombinant HPV16 L1-protein, HIV-1 P18I10-peptid respektive HIV-1 T20-peptid. De murina anti-L1-antikropparna som induceras av våra L1:P18I10- och L1:T20-VLP:er kan rikta in sig på flera bindande epitoper av L1-protein. Däremot riktar sig murina anti-HIV-1-antikroppar framkallade av våra L1:P18I10- och L1:T20-VLPs endast mot en enda HIV-peptid (P18I10 eller T20) på HPV: HIV-VLPs. Följaktligen var de totala maximala OD450-värdena för anti-HIV-1-bindande antikroppar mycket lägre än anti-HPV16 L1-antikroppar.
Anledningen till att vi valde HPV16 L1-kapsidprotein DE-loop som den preliminära insättningsregionen av HIV-1-immunogen hänvisade till en tidigare studie som immuniserade möss med bovint papillomvirus (BPV): HIV-VLP för att inducera antikroppssvar [20]. Det är känt att epitoperna lokaliserade inom ytexponerade DE- och FG-loopar av HPV L1-huvudkapsidproteinerna dominant bidrar till de vaccininducerade korsneutraliserande antikropparna [67]. Dessutom har det visats av tidigare studier att införande av HIV-1 MPER i BPV L1 DE-loopen kan inducera partiellt neutraliserande antikroppar som specifikt känner igen den naturliga konformationen av MPER i HIV-1 Env [20]. Inga data har dock visat om det rekombinanta BPV L1:MPER VLP påverkar immunogeniciteten och neutraliseringen mot BPV efter insättning av HIV-1 MPER i BPV L1-protein. I vår studie med HPV16 L1 VLPs som HIV-antigenleveransvektor har vi observerat att HIV-1-peptidinsättning inte har modifierat HPV L1-strukturen och att de chimära HPV: HIV-proteinerna fortfarande har kapaciteten att bilda VLPs. Dessutom genomförde vi konceptet med immunförbränning för att visa jämförbara immunsvar mellan en HPV: HIV VLP-kandidat (vår) och ett godkänt VLP-baserat HPV-vaccin (licensierad Gardasil-9). Våra data avslöjade att införandet av HIV-1 P18I10- eller T20-peptid i chimär HPV: HIV-VLP kunde framkalla en liknande titer av HPV16 L1-specifika bindande antikroppar, jämfört med HPV Gardasil-9 vaccin. De typspecifika anti-HPV16 L1-bindande antikropparna som observerades med licensierat HPV Gardasil-9 VLP-vaccin jämfört med chimära versioner av HPV Gardasil-9 VLP-vaccin överensstämde med våra data.
Längden och platsen för optimalt HIV-1 främmande antigen som är inkorporerat i HPV16 L1 VLP och in vitro-stabiliteten hos den resulterande chimära HPV: HIV VLP bör verifieras före mössimmunisering. Vår nuvarande studie har visat att införandet av P18I10- eller T20-peptider i HPV16 L1-protein inte påverkade in vitro-stabilitet, självmontering och morfologi hos chimär HPV: HIV VLP. Dessa resultat var i överensstämmelse med tidigare studier som indikerar att införande av HIV-1 MPER-domän i BPV L1 DE-loopsekvensen inte påverkade kapaciteten hos BPV L1-kapsidprotein självmontering till VLPs [20]. I grund och botten bidrar epitoper lokaliserade inom ytexponerade DE- och FG-loopar av HPV L1-kapsidproteinerna dominant till att inducera L1-specifika korsneutraliserande antikroppar [67]. Här visade vi att införandet av HIV-1 P18I10- eller T20-peptider i HPV16 L1 DE-loopen inte påverkade L1-specifik antikroppsinduktion av chimär HPV: HIV-VLP efter mössimmunisering. Dessutom detekterades HIV-1 P18I10- eller T20-epitoperna på HPV16 DE-slingor av chimär HPV: HIV-VLPs detekterades in vitro och var immunogena in vivo. HPV16 L1 VLPs utgör en potentiell ställning för ytvisning av HIV-1-epitopen av intresse. I denna studie har vi utfört indirekt ELISA för att demonstrera den konformationella P18I10- och T20-peptiden som presenteras på ytan av våra chimära HPV: HIV VLPs. I framtiden kan immunelektronmikroskopi också vara ett ytterligare tillvägagångssätt för att visa P18I10- eller T20-antigenstrukturell lokalisering och organisation inom HPV: HIV VLPs.
Självmontering är ett representativt index för in vitro-stabiliteten hos HPV16 L1 VLP:er. Det är känt att pH, jonstyrka, temperatur [52] och redoxmiljö alla korrelerar med disulfidbindningar av HPV16 L1 kapsidproteiner [53]. De tidigare arbetena på papillomvirus VLPs antydde vikten av disulfidbindningar för L1 huvudkapsid självmontering [68,69]. Disulfidbildning indikerade ett högre cystein av L1-kapsidprotein i en lämplig geometri [53]. Dessa disulfid-tvärbindningar förbinder resterna 175 och 428 (för HPV16) som stabiliserar HPV-virioner och VLPs [70]. I denna studie analyserade vi intermolekylära disulfid tvärbindningsmönster som indirekta bevis för att bevisa att våra L1: P18I10 och L1: T20 kapsidproteiner tenderar att självmontera in vitro. I figur 3A visade vi att renade L1:P18I10 och L1:T20 VLPs presenterade liknande intermolekylära disulfid tvärbindningsmönster som HPV16 L1 VLPs under samma pH, jonstyrka och termiska förhållanden. I figur 3B visade vi vidare att renade L1:P18I10- och L1:T20-proteiner kunde självmontera till större partiklar (större än L1-pentamer MW 280 kDa) in vitro. Därför, tillsammans med det morfologiska självmonterande VLP-mönstret (även om den ikosaedriska strukturen inte var riktigt bra) som observerades i figur 4, drog vi slutsatsen vår renade chimära HPV: HIV-VLP är stabil in vitro. Förutom VLP-stabilitet bör många andra kritiska faktorer som kan påverka immunogeniciteten hos chimär HPV: HIV-VLP övervägas, såsom immunogeninsättningsställe bland olika slingor av VLPs [71], dos, prime-boost-intervall och administreringsväg [22] , etc.
P18I10-peptiderna härledda från HIV-1 gp120 V3-slingan presenteras i HIV-infekterade celler av major histocompatibility complex (MHC-I) klass I-molekyler [26]. CD8+, cytotoxiska T-lymfocyter (CTL), kunde känna igen MHC-I-begränsade P18I10-antigener och utsöndra en mängd olika cytokiner, såsom IFN- för att eliminera HIV-infekterade celler [72–75]. Rekombinant viralt eller plasmid-DNA är bra vaccinbärare för att uttrycka P18I10-peptider i värdceller och inducera P18I10-specifika cellulära svar genom MHC-I-vägen [76–79]. Till exempel var en kombinerad regim av DNA-prime och modifierad vacciniavirus Ankara (MVA) boost tillräcklig för induktion av IFN- och CTL-svar mot P18I10-epitopen [79]. Tvärtom, exogena P18I10-peptider presenteras inte effektivt för CD8+ T-celler genom MHC-I-vägen [80,81] och kräver deltagande av lämpliga adjuvans [82–85] eller antigenbärare, som t.ex. VLP:er. Till exempel var immunogeniciteten hos syntetiska P18I10-peptider kompletterade med adjuvans marginell på grund av frånvaron av T-hjälpardeterminanter [82-85]. Det har tidigare rapporterats att HIV-1 Gag VLPs [86], hepatit B ytantigen (HBsAg) VLPs [87], parvovirus VP2 VLPs [88] och papillomvirus L1 VLPs [17–19] skulle kunna fungera som leveransvektorer för MHC-I-begränsad CTL-epitoppresentation in vivo. Även om mekanismen för VLP-inducerade MHC-I-begränsade T-cellssvar fortfarande är oklar, kan den partikelformiga strukturen hos VLP:er gynna endocytiskt upptag av makrofager eller dendritiska celler, och därmed komma åt cytosolen och därefter gå in i typisk MHC-I-väg [89, 90]. Dessutom observerades den MHC-I-begränsade P18I10-determinanten inducera CD4+-hjälpar-T-cellsvar genom en MHC-II-väg [91,92]. Hybrid BPV1 L1 VLP kan användas som antigena epitopbärare för att framkalla terapeutiska virusspecifika CTL-svar genom MHC-I- och MHC-II-vägar [17,19], vilket ger en lovande strategi för vaccindesignen för att kontrollera virusinfektion. Vissa tidiga studier indikerade också BPV L1 VLP som uttrycker HPV16 E7 epitop eller P18I10 epitop av HIV-1 gp120 V3 loop-inducerade slemhinneytor och även systemisk VLP epitopspecifik humoral och T-cellsimmunitet [18]. I linje med tidigare studier har vi preliminärt visat att våra chimära HPV: HIV (L1:P18I10) VLPs kunde inducera HIV-specifika T-cellsimmunsvar i BALB/c-möss efter splenocytstimulering med P18I10-peptid. Dessutom förbättrade BCG.HIVA-priming de HIV-1-specifika T-cellsimmunsvaren hos möss. Emellertid skulle de multifunktionella T-cellsimmunsvaren inducerade av L1:P18I10 VLPs behöva ytterligare immunologiska studier.
Bredare CD8+ T-cellssvar mot flera konserverade CTL-epitoper är fördelaktiga för att övervinna HIV-1 genetisk mångfald och undkomma [7,93–100]. Den rationella designen av HIV-1 T-cellsimmunogener, såsom HIVA, bör ha potential att svara på flera CTL-epitoper [34]. HIV-1 HIVA-immunogenet, designat av Dr. Tomas Hanke, består av fullängds HIV-1 Gag-proteinet kombinerat med flera CTL-epitoper inklusive P18I10-epitoper vid C-terminalen [34]. DNA, MVA och rBCG valdes ut som HIVA-immunogentillförselvehiklar och inducerade hög magnitud och bredd av CTL-epitopspecifika cellulära svar genom att använda heterologa prime-boost-regimer i mus- och icke-humana primater (NHP)-modeller [34,101]. Våra tidigare studier har visat att BCG.HIVA-primer i kombination med MVA.HIVA-boost framkallade HIV-1-specifika IFN-producerande CD8+ T-celler i BALB/c-möss [31–33,102]. Intressant nog kan VLP vara en potentiell booster för att öka HIV-specifika cellulära svar i den heterologa immuniseringen med rBCG [29,30] eller DNA-vacciner [103,104]. Till exempel kan rBCG-uttryckande HIV-1 Gag-protein effektivt prima T-cellernas immunsystem för en boost med Gag VLPs i NHP-modeller [29,30]. I den aktuella studien har vi visat att BCG.HIVA-priming kan öka T-cellsimmunsvaret inducerat av HPV: HIV (L1:P18I10) VLPs. Vi kommer att undersöka omfattningen av polyfunktionella CD4+, CD8+ och minnes T-cellssvar som genereras av denna rBCG prime och VLP boost regim.
cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret
För närvarande fokuserar vår forskargrupp på utvecklingen av lovande rBCG: HIV-vacciner som uttrycker nya HIV-1 T-cellsimmunogener, såsom tHIVconsvX och HIVACAT (HTI) T-cellsimmunogen, för att förbättra HIV-1 variantmatchning och T-cellsvarsbredd. 2:a generationens HIVconsvX-immunogener designades genom att omdefiniera grupp M-konserverade regionerna och använda en bivalent mosaikdesign för att maximera matchningen av potentiella 9-mer T-cellsepitoper i vaccinet till globala varianter [64]. HTI-immunogenet utformades för att täcka T-cellsmål mot vilka T-cellssvar främst observeras hos HIV-1-infekterade individer med låg HIV-1 viral mängd [65,66]. Eftersom papillom-VLP har visat sig vara flera CTL-epitopbärare [17], syftade vi till att konstruera chimära HPV16 L1-VLP:er som bär flera konserverade HIV-1 CTL-epitoper i kombination med rBCG-uttryckande ThivconsvX- eller HTI T-cellsimmunogener för att inducera bredare CTL-immunsvar mot HIV-1. Den höga densiteten och flera kopior av HIV-1 CTL-epitopen som presenteras på chimär HPV: HIV-VLP kan förbättra antigenleveransen till immunsystemet och inducera en högre frekvens av CTL-svar. Däremot är det mer sannolikt att rekombinant BCG genererar en lägre frekvens av CTL-svar på grund av långsam replikation in vivo. Eftersom BCG har ett tydligt inflytande på differentieringen av T-celler, vilket innebär att BCG kan inducera minne av CD8+ T-celler genom deltagande av CD4+ T-hjälparceller [105], denna immunogena egenskap kan göra BCG lämpligt som ett primingmedel i heterologa prime-boost-regimer. Därför förväntade vi oss att våra HPV: HIV VLPs kan tyckas vara en lovande booster för att öka storleken och bredden av HIV-1 CTL-svar vid priming med ett rekombinant BCG som uttrycker nytt HIV-1 T-cellsimmunogen .
T20-peptiden innehåller en mycket konserverad linjär epitop 2F5 (ELDKWA). 2F5-antikroppen som samlats in från långtidshiv-infekterade patienter rapporterades ha i stort sett neutraliserande effekt [106,107]. MPER för gp41 anses vara dåligt immunogen, kanske relaterad till dess placering nära det cellulära och virala fosfolipiddubbelskiktet [108]. Att använda DNA-vektorer som presenterar MPER i en lipidmiljö är fördelaktigt för att inducera gp41-specifika nAbs [109–111]. Till exempel har de HIV-1 T20-kodande DNA-vaccinerna, designade av Dr. Britta Wahren, visat sig inducera cross-clade neutraliserande antikroppssvar (nAb) [109]. Däremot har många tidiga försök att inducera nAbs riktade mot gp41 genom att använda peptid- eller subenhetsvaccinstrategier misslyckats [112-116]. Nyligen indikerade vissa studier att BPV L1-VLPs som uttrycker 2F5-epitop eller MPER av HIV-1 gp41-inducerade 2F5-specifika antikroppar i möss resulterade i neutralisering av korsplattan [20,21]. Ett liknande immunogenicitetsmönster hittades när hepatit B-ytantigen (HBsAg) fusionerades med HIV-1 2F5-epitop eller MPER [59,117–119]. Här visade vi att presentationen av HIV-1 T20- och P18I10-peptider i vår chimära HPV16 L1 VLP kunde inducera antikroppssvar mot HIV-1 och HPV16. Neutraliserande epitoper stabiliserade på en konformationell byggnadsställning, såsom HIV-1 funktionella spikes eller VLPs, kan vara huvudströmmen i B-cellsimmunogendesign för att uppnå breda neutraliserande antikroppar (bnAbs) [93]. De flesta nya bnAb-epitoper (ungefär 90 %) är emellertid icke-kontinuerliga och konstituerade regioner sammanförda i 3-dimensionella konfigurationer [120]. Även om presentationen av diskontinuerliga epitoper på en proteinställning kunde förutsägas genom beräkningsmodellering [121], kan dessa bnAb-epitoper utmanas att vara inbäddade i en icke-höljeförsedd HPV16 L1-proteinställning. Däremot innehåller en minoritet av HIV-1 B-cellsimmunogener, såsom MPER (2F5) av HIV-1 gp41 eller V3 loop (P18IIB) av gp120, linjära neutraliserande epitoper och kan vara lämpliga för HPV: HIV-proteinryggraden. Därför valde vi den linjära 2F5-neutraliserande epitopen som ingår i en utökad T20-peptid av HIV -1 MPER när det gäller gynnsam struktur för -helixbildning [122]. T20-peptider skulle kunna fuseras och stabiliseras på L1-kapsidställningar för att framkalla neutraliserande antikroppssvar om den naturliga konfigurationen av 2F5-epitopen kunde presenteras. I denna studie fann vi att 2F5 nAbs var bundna till chimära HPV: HIV (L1:T20) VLPs in vitro. Dessutom kan L1:T20 VLPs också inducera T20-specifika bindande antikroppar i BALB/c-möss. Det fanns växande bevis för att HIV-1-fusionshämmande (T20)-peptidinducerade antikroppar har liknande egenskaper som anti-HIV-1-fusionspeptiden Enfuvirtide för att binda den hydrofoba transmembran-T20-resten som finns i MPER av gp41 under HIV-1 fusion och bidrar till viruskontroll [109,123,124]. Enligt våra tidigare recensioner skulle den rationella utformningen av chimära VLP-baserade vacciner för att inducera HPV och HIV-specifika neutraliserande antikroppar och CTL-svar alltid behöva övervägas i termer av immunogenselektion, antigenleveransvektorer och prime-boost-regimer. Sammanfattningsvis har denna studie visat en alternativ däggdjurscellbaserad expressionsplattform och en skalbar kromatografisk reningsmetod för att konstruera chimära HPV: HIV VLPs. Vi anser att våra nya reningsmetoder kommer att hjälpa till att återvinna antigena HPV: HIV VLP från däggdjursceller med målet att minska tid, kostnader och arbete samtidigt som vi ökar kapaciteten för industriell produktion., Dessutom visade vi HPV16 L1 VLPs kan fungera som en leveransplattform för att bära HIV-1-peptidantigen eftersom införandet av P18I10- eller T20-peptider i DE-slingan av HPV16 L1-kapsidproteiner inte påverkade in vitro stabilitet, självmontering och morfologi hos chimär HPV: HIV VLP och gjorde inte störa HPV16 L{107}}specifik antikroppsinduktion in vivo. Å andra sidan kan chimär HPV: HIV VLP framkalla HPV16 och HIV-specifika B- och T-cellsimmunsvar mot båda virusen. Den här rapporten undersökte möjligheten att utveckla HIV-1-vacciner baserade på rekombinanta BCG-uttryckande HIV-1-immunogener och HPV: HIV-VLPs, som kan användas för HIV{113}}-immunisering hos barn. Eftersom utvecklingen av ett effektivt chimärt vaccin mot HPV16 och HIV-1 fortfarande är en utmaning, bidrar detta arbete till ett steg mot utvecklingen av den nya chimära HPV: HIV VLP-baserade vaccinplattformen för kontroll av HPV16 och HIV{{118 }} infektion, som är akut nödvändig i utvecklings- och industriländer.
Referenser
1. UNAIDS Global HIV & AIDS Statistics-2018 faktablad. 2019. Tillgänglig online: http://www.unaids.org/en/resources/faktablad (tillgänglig den 15 juni 2020).
2. Baeten, JM PrEP för HIV: Grad A för bevis men väntar på effekt. Nat. Rev. Urol. 2019, 16, 570–571. [CrossRef]
3. Rerks-Ngarm, S.; Pitisuttithum, P.; Nitayaphan, S.; Kaewkungwal, J.; Chiu, J.; Paris, R.; Premsri, N.; Namwat, C.; De Souza, M.; Adams, E.; et al. Vaccination med ALVAC och AIDSVAX för att förhindra HIV-1-infektion i Thailand. N. Engl. J. Med. 2009, 361, 2209–2220. [CrossRef]
4. Ng'uni, T.; Chasara, C.; Ndhlovu, ZM Stora vetenskapliga hinder i utvecklingen av HIV-vaccin: Historiskt perspektiv och framtida riktningar. Främre. Immunol. 2020, 11, 590780. [CrossRef]
5. Robinson, HL HIV/AIDS-vaccin: 2018. Clin. Pharmacol. Ther. 2018, 104, 1062–1073. [CrossRef]
6. Wang, Q.; Zhang, L. Bredt neutraliserande antikroppar och vaccindesign mot HIV-1-infektion. Främre. Med. 2020, 14, 30–42. [CrossRef]
7. Collins, DR; Gaiha, GD; Walker, BD CD8+ T-celler i HIV-kontroll, botemedel och förebyggande. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 471–482. [CrossRef] [PubMed]
8. Pollard, AJ; Bijker, EM En guide till vaccinologi: Från grundläggande principer till nya utvecklingar. Nat. Rev. Immunol. 2021, 21, 83–100. [CrossRef]
9. Shapiro, SZ Lektioner för allmän vaccinologiforskning från försök att utveckla ett HIV-vaccin. Vaccin 2019, 37, 3400–3408. [CrossRef]
10. Ahmed, HG; Bensumaidea, SH; Alshammari, FD; Alenazi, FSH; ALmutlaq, BA; Alturkstani, MZ; Aladani, IA Prevalens av humant papillomvirus subtyper 16 och 18 bland jemenitiska patienter med livmoderhalscancer. Asian Pacific J. Cancer Föreg. 2017, 18, 1543–1548. [CrossRef]
11. Olcese, VA; Chen, Y.; Schlegel, R.; Yuan, H. Karakterisering av HPV16 L1-loopdomäner i bildandet av en typspecifik konformationsepitop. BMC Microbiol. 2004, 4, 29. [CrossRef]
12. Dupuy, C.; Buzoni-Gate, D.; Touze, A.; Le Cann, P.; Bout, D.; Coursaget, P. Cellmedierad immunitet inducerad i möss av HPV 16 L1-virusliknande partiklar. Microb. Patog. 1997, 22, 219-225. [CrossRef] [PubMed]
13. Schiller, J.; Lowy, D. Förklaringar till den höga styrkan hos HPV-profylaktiska vacciner. Vaccin 2018, 36, 4768–4773. [CrossRef] [PubMed]
14. Markowitz, LE; Schiller, JT Humant papillomvirusvaccin. J. Infect. Dis. 2021, 224, S367–S378. [CrossRef] [PubMed]
15. Chen, CW; Saubi, N.; Joseph-Munné, J. Designkoncept för virusliknande partikelbaserade HIV-1-vacciner. Främre. Immunol. 2020, 11, 573157. [CrossRef] [PubMed]
16. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph, J. Designa chimära virusliknande partikelbaserade vacciner för humant papillomvirus och HIV: Lärdomar. AIDS Rev. 2019, 21, 218–232. [CrossRef]
17. Liu, WJ; Liu, XS; Zhao, KN; Leggatt, GR; Frazer, IH Papillomavirusvirusliknande partiklar för leverans av flera cytotoxiska T-cellsepitoper. Virology 2000, 273, 374–382. [CrossRef]
18. Liu, XS; Abdul-Jabbar, I.; Qi, YM; Frazer, IH; Zhou, J. Mukosal immunisering med papillomvirusvirusliknande partiklar framkallar systemisk och mukosal immunitet hos möss. Virology 1998, 252, 39-45. [CrossRef]
19. Peng, S.; Frazer, IH; Fernando, GJ; Zhou, J. Papillomavirusvirusliknande partiklar kan leverera definierade CTL-epitoper till MHC klass I-vägen. Virology 1998, 240, 147-157. [CrossRef]
20. Zhai, Y.; Zhong, Z.; Zariffard, M.; Spear, GT; Qiao, L. Bovint papillomvirus-liknande partiklar som presenterar konserverade epitoper från den membranproximala yttre regionen av HIV-1 gp41-inducerade slemhinne- och systemiska antikroppar. Vaccin 2013, 31, 5422–5429. [CrossRef]
21. Zhang, H.; Huang, Y.; Fayad, R.; Spear, GT; Qiao, L. Induktion av mukosala och systemiskt neutraliserande antikroppar mot humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) genom oral immunisering med bovint papillomvirus-HIV-1 gp41 chimära virusliknande partiklar. J. Virol. 2004, 78, 8342–8348. [CrossRef]
22. Xiao, SL; Wen, JL; Kong, NZ; Yue, HL; Leggatt, G.; Frazer, IH Administreringssätt för chimärt BPV1 VLP bestämmer karaktären hos de inducerade immunsvaren. Immunol. Cell Biol. 2002, 80, 21–29. [CrossRef]
23. Kirnbauer, R.; Taub, JANET; Grönsten, LJUD; Roden, RICHARD; Dürst, M.; Gissmann, L.; Lowy, DR; Schiller, JT Effektiv självmontering av humant papillomvirus typ 16 LI och L1-L2 till virusliknande partiklar. J. Virol. 1993, 67, 6929–6936. [CrossRef] [PubMed]
24. Zhao, Q.; Potter, CS; Carragher, B.; Lander, G.; Sworen, J.; Towne, V.; Abraham, D.; Duncan, P.; Washabaugh, MW; Sitrin, RD Karakterisering av virusliknande partiklar i GARDASIL® genom kryotransmissionselektronmikroskopi. Brum. Vacciner Immunother. 2014, 10, 734–739. [CrossRef] [PubMed]
25. Achour, A.; Lemhammedi, S.; Picard, O.; M'bika, JP; Zagury, JF; Moukrim, Z.; Willer, A.; Beix, F.; Burny, A.; Zagury, D. Cytotoxiska T-lymfocyter specifika för HIV-1 gp160-antigen och syntetisk P18IIIB-peptid i en HLA-A11-immuniserad individ. AIDS Res. Brum. Retrovirus 1994, 10, 19–25. [CrossRef]
26. Nakagawa, Y.; Kikuchi, H.; Takahashi, H. Molekylär analys av TCR och peptid/MHC-interaktion med användning av P18-I10-härledda peptider med en enda D-aminosyrasubstitution. Biophys. J. 2007, 92, 2570–2582. [CrossRef]
27. Qiu, Z.; Chong, H.; Yao, X.; Su, Y.; Cui, S.; He, Y. Identifiering och karakterisering av en underficka på N-trimeren av HIV-1 Gp41: Implikation för viralt inträde och läkemedelsmål. Hjälpmedel 2015, 29, 1015–1024. [CrossRef]
28. Peters, BS; Cheingsong-Popov, R.; Callow, D.; Foxall, R.; Patou, G.; Hodgkin, K.; Weber, JN En pilotfas II-studie av säkerheten och immunogeniciteten av HIV p17/p24:VLP (p24-VLP) hos asymtomatiska HIV-seropositiva individer. J. Infect. 1997, 35, 231-235. [CrossRef]
29. Chege, GK; Burgers, WA; Stutz, H.; Meyers, AE; Chapman, R.; Kiravu, A.; Bunjun, R.; Shephard, EG; Jacobs, WR; Rybicki, EP; et al. Robust immunitet mot en Auxotrophic Mycobacterium bovis BCG-VLP Prime-Boost HIV-vaccinkandidat i en icke-mänsklig primatmodell. J. Virol. 2013, 87, 5151–5160. [CrossRef]
30. Chege, GK; Thomas, R.; Shephard, EG; Meyers, A.; Bourn, W.; Williamson, C.; Maclean, J.; Gray, CM; Rybicki, EP; Williamson, AL En prime-boost-immuniseringsregim med användning av rekombinanta BCG- och Pr55gag-virusliknande partikelvacciner baserade på HIV typ 1-subtyp C framkallar framgångsrikt Gag-specifika svar hos babianer. Vaccin 2009, 27, 4857–4866. [CrossRef]
31. Joseph, J.; Saubi, N.; Jag, EJ; Fernández-Lloris, R.; Gil, O.; Cardona, PJ; Gatell, JM; Hanke, T. Vaccination av nyfödda möss med BCG.HIVA222 + MVA.HIVA förstärker HIV-1-specifika immunsvar: Påverkan av ålder och immuniseringsvägar. Clin. Dev. Immunol. 2011, 2011, 516219. [CrossRef]
32. Saubi, N.; Gea-Mallorquí, E.; Ferrer, P.; Hurtado, C.; Sánchez-Úbeda, S.; Eto, Y.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Engineering ny mykobakteriell vaccindesign för HIV-TB pediatriskt vaccin vektoriserat av lysinauxotrof av BCG. Mol. Ther. Metoder Clin. Dev. 2014, 1, 14017. [CrossRef]
33. Mahant, A.; Saubi, N.; Eto, Y.; Gitarr, N.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Preklinisk utveckling av BCG.HIVA2auxo.int, som innehåller en integrerad expressionsvektor, för ett HIV-TB pediatriskt vaccin. Förbättring av stabilitet och specifik HIV-1 T-cellsimmunitet. Brum. Vacciner Immunother. 2017, 13, 1798–1810. [CrossRef] [PubMed]
34. Hanke, T.; McMichael, AJ Design och konstruktion av ett experimentellt HIV-1-vaccin för ett år-2000 klinisk prövning i Kenya. Nat. Med. 2000, 6, 951–955. [CrossRef] [PubMed]
35. Durocher, Y.; Perret, S.; Kamen, A. Produktion av rekombinant protein på hög nivå och hög genomströmning genom transient transfektion av suspensionsväxande humana 293-EBNA1-celler. Nucleic Acids Res. 2002, 30, E9. [CrossRef] [PubMed]
36. Kim, HJ; Kim, SY; Lim, SJ; Kim, JY; Lee, SJ; Kim, HJ Enstegskromatografisk rening av humant papillomvirus typ 16 L1-protein från Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr. Purif. 2010, 70, 68–74. [CrossRef] [PubMed]
37. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph-Munné, J. Uttryck av chimärt HPV-HIV-protein L1P18 i pichia pastoris; rening och karakterisering av de virusliknande partiklarna. Pharmaceutics 2021, 13, 1967. [CrossRef]
38. GE. Användningen av CaptoTM Core 700 och Capto Q ImpRes vid rening av humant papillomvirusliknande partiklar. J. Asia's Pharm. Biopharm. Ind. 2014, 1–4.
39. McLean, CS; Churcher, MJ; Meinke, J.; Smith, GL; Higgins, G.; Stanley, M.; Minson, AC Produktion och karakterisering av en monoklonal antikropp mot humant papillomvirus typ 16 med användning av rekombinant vacciniavirus. J. Clin. Patol. 1990, 43, 488–492. [CrossRef]
40. Merck Canada Inc. Produktmonografi Gardasil®. Driva. Monogr. Monopril Prod. Monogr. 2015, 1–71.
41. Achour, A.; Persson, K.; Harris, RA; Sundbäck, J.; Sentman, CL; Lindqvist, Y.; Schneides, G.; Kärre, K. Kristallstrukturen av H-2D(d) MHC klass I komplexbunden med den HIV-1--härledda peptiden P18-110 vid 2,4 Å upplösning: Implikationer för T-cell och NK-cell erkännande. Immunitet 1998, 9, 199–208. [CrossRef]
42. Pang, W.; Tom, SC; Zheng, YT Aktuella peptid HIV-typ-1 fusionshämmare. Antivir. Chem. Kemother. 2009, 20. [CrossRef]
43. Chen, XS; Garcea, RL; Goldberg, I.; Casini, G.; Harrison, SC Struktur av små virusliknande partiklar sammansatta från L1-proteinet från humant papillomvirus 16. Mol. Cell 2000, 5, 557–567. [CrossRef] [PubMed]
44. Dag, PM; Weisberg, AS; Thompson, CD; Hughes, MM; Pang, YY; Lowy, DR; Schiller, JT Humant papillomvirus 16 kapsider medierar nukleärt intrång under infektion. J. Virol. 2019, 93, e00454-19. [CrossRef]
45. Zhou, J.; Dörrbar, J.; Sol, XY; Crawford, LV; McLean, CS; Frazer, IH Identifiering av den nukleära lokaliseringssignalen för humant papillomvirus typ 16 L1-protein. Virology 1991, 185, 625-632. [CrossRef] [PubMed]
46. Vlps, A.; Middelberg, APJ; Lua, LHL Biobearbetning av virusliknande partiklar: utmaningar och möjligheter. Pharm. Bioprocess. 2013, 1, 407–409.
47. Bousarghin, L.; Touzé, A.; Combita-Rojas, AL; Coursaget, P. Positivt laddade sekvenser av kapsidproteiner från humant papillomvirus typ 16 är tillräckliga för att förmedla genöverföring till målceller via heparansulfatreceptorn. J. Gen. Virol. 2003, 84, 157–164. [CrossRef]
48. Sasagawa, T.; Pushko, P.; Steers, G.; Gschmeissner, SE; Nasser Hajibagheri, MA; Finch, J.; Crawford, L.; Tommasino, M. Syntes och sammansättning av virusliknande partiklar av humana papillomvirus typ 6 och typ 16 i fissionsjäst Schizosaccharomyces pombe. Virology 1995, 206, 126-135. [CrossRef]
49. Biemelt, S.; Sonnewald, U.; Galmbacher, P.; Willmitzer, L.; Müller, M. Produktion av humant papillomvirus typ 16 virusliknande partiklar i transgena växter. J. Virol. 2003, 77, 9211–9220. [CrossRef]
50. Zahin, M.; Joh, J.; Khanal, S.; Husk, A.; Mason, H.; Warzecha, H.; Ghim, SJ; Miller, DM; Matoba, N.; Jenson, AB Skalbar produktion av HPV16 L1-protein och VLP från tobaksblad. PLoS ONE 2016, 11, e0160995. [CrossRef]
51. Aires, KA; Cianciarullo, AM; Carneiro, SM; Villa, LL; Boccardo, E.; Pérez-Martinez, C.; Perez-Arellano, I.; Oliveira, MLS; Ho, PL Produktion av humant papillomvirus typ 16 L1-virusliknande partiklar av rekombinanta Lactobacillus casei-celler. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72, 745–752. [CrossRef]
52. Shank-Retzlaff, ML; Zhao, Q.; Anderson, C.; Hamm, M.; Hög, K.; Nguyen, M.; Wang, F.; Wang, N.; Wang, B.; Wang, Y.; et al. Utvärdering av den termiska stabiliteten hos Gardasil®. Brum. Vaccin. 2006, 2, 147–154. [CrossRef] [PubMed]
53. Mukherjee, S.; Thorsteinsson, MV; Johnston, LB; DePhillips, PA; Zlotnick, A. En kvantitativ beskrivning av in vitro-sammansättning av humant papillomvirus 16 virusliknande partiklar. J. Mol. Biol. 2008, 381, 229–237. [CrossRef] [PubMed]
54. McCarthy, MP; White, WI; Palmer-Hill, F.; Koenig, S.; Suzich, JA Kvantitativ demontering och återmontering av humant papillomvirus typ 11 virusliknande partiklar in vitro. J. Virol. 1998, 72, 32–41. [CrossRef] [PubMed]
55. Kirnbauer, R.; Booy, F.; Cheng, N.; Lowy, DR; Schiller, JT Papillomavirus L1 huvudkapsidprotein självmonteras till virusliknande partiklar som är mycket immunogena. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 88, 12180–12184. [CrossRef]
56. Patel, MC; Patkar, KK; Basu, A.; Mohandas, KM; Mukhopadhyaya, R. Produktion av immunogent humant papillomvirus-16 huvudkapsidprotein härledda virusliknande partiklar. Indian J. Med. Res. 2009, 130, 213–218.
57. Shi, L.; Sanyal, G.; Ni, A.; Luo, Z.; Doshna, S.; Wang, B.; Graham, TL; Wang, N.; Volkin, DB Stabilisering av humant papillomvirusvirusliknande partiklar av icke-joniska ytaktiva ämnen. J. Pharm. Sci. 2005, 94, 1538–1551. [CrossRef]
58. Carter, JJ; Wipf, GC; Benki, SF; Christensen, ND; Galloway, DA Identifiering av en 16-specifik epitop av humant papillomvirustyp på C-terminalarmen av huvudkapsidproteinet L1. J. Virol. 2003, 77, 11625–11632. [CrossRef]
59. Von Brunn, A.; Brand, M.; Reichhuber, C.; Morys-Wortmann, C.; Deinhardt, F.; Schdelt, F. Den huvudsakliga neutraliserande domänen av HIV-I är mycket immunogen när den uttrycks på ytan av hepatit B-kärnpartiklar. Vaccin 1993, 11, 817–824. [CrossRef]
60. Dennison, SM; Anasti, K.; Scearce, RM; Sutherland, L.; Parks, R.; Xia, S.-M.; Liao, H.-X.; Gorny, MK; Zolla-Pazner, S.; Haynes, BF; et al. Icke-neutraliserande HIV-1 gp41 Envelope Cluster II Humana monoklonala antikroppar visar polyreaktivitet för bindning till fosfolipider och proteinautoantigener. J. Virol. 2011, 85, 1340–1347. [CrossRef]
61. Trkola, A.; Kuster, H.; Russert, P.; Joos, B.; Fischer, M.; Leemann, C.; Manrique, A.; Huber, M.; Rehr, M.; Oxenius, A.; et al. Fördröjning av hiv-1 återhämtning efter avslutad antiretroviral behandling genom passiv överföring av humana neutraliserande antikroppar. Nat. Med. 2005, 11, 615–622. [CrossRef]
62. Shank-Retzlaff, M.; Wang, F.; Morley, T.; Anderson, C.; Hamm, M.; Brown, M.; Rowland, K.; Pancari, G.; Zorman, J.; Lowe, R.; et al. Korrelation mellan musstyrka och relativ styrka in vitro för humant papillomvirus Typ 16-virusliknande partiklar och Gardasil-vaccinprover. Brum. Vaccin. 2005, 1, 191–197. [CrossRef] [PubMed]
63. Kilpeläinen, A.; Maya-Hoyos, M.; Saubí, N.; Soto, CY; Joseph Munne, J. Framsteg och utmaningar inom utveckling av rekombinant Mycobacterium bovis BCG-baserad HIV-vaccin: Lärdomar. Expert Rev Vaccines 2018, 17, 1005–1020. [CrossRef] [PubMed]
