Dissektion av antikroppssvar från Gam-COVID-Vac-vaccinerade försökspersoner tyder på involvering av epitoper utanför RBD i SARS-CoV-2-neutralisering

Abstrakt: Miljontals människor har vaccinerats med Gam-COVID-Vac men fina specificiteter för inducerade antikroppar har inte studerats fullt ut. Plasma från 12 naiva och 10 konvalescenta patienter med coronavirussjukdom 2019 (COVID-19) erhölls före och efter två immuniseringar med Gam-COVID-Vac. Antikroppsreaktivitet i plasmaproverna (n=44) ​​studerades på en panel av mikroarrayade rekombinanta vikta och oveckade proteiner för allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) och 46 peptider som spänner över spiken protein (S) och genom immunglobulin G (IgG) subklass enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA). Förmågan hos Gam-COVID-Vac-inducerade antikroppar att hämma bindningen av den receptorbindande domänen (RBD) till dess receptorangiotensinomvandlande enzym 2 (ACE2) undersöktes i en molekylär interaktionsanalys (MIA). Antikropparnas virusneutraliserande förmåga studerades med pseudotypat virusneutraliseringstestet (pVNT) för Wuhan-Hu-1 och Omicron. Vi fann att Gam-COVID-Vac-vaccination inducerade signifikanta ökningar av IgG1 men inte av andra IgG-underklasser mot veckat S, spikproteinsubenhet 1 (S1), spikproteinsubenhet 2 (S2) och RBD på ett jämförbart sätt i naiva och konvalescenta ämnen. Virusneutralisering var starkt korrelerad med vaccinationsinducerade antikroppar specifika för veckad RBD och en ny peptid (dvs peptid 12). Peptid 12 var belägen nära RBD i den N-terminala delen av S1 och kan potentiellt vara involverad i övergången av konformationen före till efter fusion av spikeproteinet. Sammanfattningsvis inducerade Gam-COVID-Vac-vaccination S-specifika IgG1-antikroppar hos naiva och konvalescenta patienter på ett jämförbart sätt. Förutom de antikroppar som är specifika för RBD, var antikropparna inducerade mot en peptid nära N-terminalen av RBD också associerade med virusneutralisering.

Nyckelord: SARS-CoV-2; COVID-19; Gam-COVID-Vac; epitop; antikropp; virusneutralisering; molekylär interaktionsanalys; Omicron

cistanche tillägg fördelar-öka immunitet

Klicka här för att se produkter från Cistanche Enhance Immunity

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

1. Introduktion

Efter de första fallen av infektion med det allvarliga akuta respiratoriska syndromet Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) i slutet av 2019 i Wuhan, Kina, spred sig den nya coronavirussjukdomen (COVID-19) snabbt över hela världen världen och växte till en global pandemi [1–4]. Den snabba utvecklingen av covid-19-vacciner och införandet av globala vaccinationsprogram tillsammans med uppkomsten av mindre patogena SARS-CoV-2-varianter anses vara viktiga faktorer för att minska antalet covid-19-relaterade dödsfall och pandemins svårighetsgrad [1,5]. De första vaccinerna som blev tillgängliga var genetiska vacciner baserade på adenovirusmedierad överföring av genen som kodar för SARS-CoV-2 ytprotein S [6–8]. SARS-CoV-2 S-proteinet består av S1-subenheten som innehåller den receptorbindande domänen (RBD) som fäster till dess receptor ACE2 på mänskliga celler och S2-subenheten som säkerställer virusanslutning till värdcellmembranet genom proteolytisk klyvning av fusionspeptid (FP) under virusinfektionen [9]. S-genen som används för genöverföring i vissa adenovirusbaserade vacciner (t.ex. COVID-19-vaccin Janssen) kan modifieras för att stabilisera proteinet och påverka dess klyvning, men detta är inte fallet för de andra [10]. Mänskliga celler som är infekterade av adenovirus som innehåller den S-kodande genen producerar en varierande mängd av S-antigenet som frisätts och presenteras av det stora histokompatibilitetskomplexet (MHC) klass II till T-celler, vilket resulterar i CD4+ T-cellshjälp för produktion av S-specifika antikroppar. S-protein som uttrycks av transfekterade celler presenteras också av MHC klass I på ytan av den infekterade cellen och utlöser aktiveringen av S-specifika cytotoxiska CD8+ T-celler, som kan känna igen S-antigenproducerande celler och förstöra dem. Principen för vaccination, dvs. införandet av S-kodande genetisk information i värdceller och efterföljande produktion av S-antigen av de infekterade cellerna, liknar budbärar-ribonukleinsyra (mRNA)-vaccin, även om tekniken för genöverföring skiljer sig från adenovirus -baserade vacciner. Således efterliknar "genetiska vacciner" i viss mån en naturlig SARS-CoV-2-infektion. Identifieringen av epitoper som känns igen av antikroppar från vaccinerade försökspersoner involverade i virusneutralisering är avgörande inte bara för att förstå mekanismen för verkan av befintliga vacciner utan också för utvecklingen av förfinade aktiva vaccinations- och passiva immuniseringsstrategier mot covid-19 [11 ,12]. De flesta av de nuvarande vaccinerna är fokuserade på att erhålla ett S-specifikt antikroppssvar med särskild uppmärksamhet på RBD-specifikt antikroppssvar eftersom man har sett att RBD-specifika antikroppar är korrelerade med hög neutraliserande aktivitet mot SARS-CoV-2 [ 13–15]. Men antalet mutationer som förvärvats av varje ny variant av oro (VOC) indikerar vikten av att identifiera epitoper som konserveras bland VOC som riktas mot neutraliserande antikroppar som inte bara finns i RBD utan även utanför RBD [16]. Faktum är att det finns studier som indikerar närvaron av neutraliserande epitoper utanför RBD, som känns igen av antikroppar efter immunisering [17-20]. År 2020 blev det vektorbaserade vaccinet Gam-COVID-Vac, även kallat Sputnik-V, tillgängligt för användning i klinisk praxis och har för närvarande godkänts för användning i mer än 70 länder (https://sputnikvaccine.com/about-vaccine) / (åtkom den 17 januari 2023)). Enligt resursen Our World In Data (OWID) fick 79 miljoner människor i Ryssland minst en injektion av vaccinet och 72 miljoner är helt vaccinerade (https://ourworldindata.org/ covid-vaccinations?country= RUS (tillträde den 22 mars 2022)). Gam-COVID-Vac består av två vaccintyper, som är baserade på två olika humana adenovirusvektorer (hAd26 och hAd5) som bär den naturliga formen av S-proteinet från Wuhan-Hu-1-stammen SARS-CoV{{ 73}}. Sputnik-V omfattar två injektioner, en med hAd26 och en andra med hAd5 och Sputnik light, med endast hAd26. De två olika adenovirusvektorerna används för den första och andra immuniseringen för att minska möjligheten att vaccinerade individer producerar immunitet mot S-proteinimmuniteten mot adenoviruset. Faktum är att adenovirusspecifika antikroppar skulle begränsa effektiviteten av boostervaccinationer genom neutralisering av adenovirusvektorvehikeln. Därför, den 21:a dagen efter den första dosen av ett vaccin med rAd26, utförs upprepad antigentillförsel med rAd5-vektorn [8,21]. Få studier har i någon märkbar utsträckning undersökt S- och RBD-specifika antikroppssvar och virusneutraliseringsaktiviteten i sera från Gam-COVID-Vac-vaccinerade [10,22,23]. Ökning av RBD-specifika IgG-antikroppar tre månader efter Gam-COVID-Vac-administrering har rapporterats och det har visats att antikroppar korsreagerar med Alfa-, Beta-, Delta- och Omicron-varianter av oro [24–26]. Gam-COVID-Vac har också jämförts med flera andra licensierade vacciner mot SARS-CoV-2, som visade hög virusneutralisering och hög effektivitet mot covid-relaterad{102}}dödlighet för Sputnik-V, även om det var en viss underlägsenhet till vissa mRNA-vacciner angående virusneutralisering hittades [24]. Slutligen har det visats att immunisering av humant immunbristvirus-positiv (HIV+) antiretroviral terapi-behandlade (ART-behandlade) patienter med Gam-COVID-Vac visar epidemiologisk effekt mot den ursprungliga vildtypen och Delta-varianten av SARS-CoV{{ 113}} [27]. Hittills har dock ingen detaljerad analys av epitopigenkänningen av antikroppar i Gam-COVID-Vac-vaccinerade försökspersoner utförts och data behövs för att förstå immunglobulinisotypen och IgG-subklasssvaren hos Gam-COVID-Vac-vaccinerade försökspersoner. Här undersökte vi två grupper av försökspersoner som hade vaccinerats med Gam-COVID-Vac, en som hade haft en tidigare SARS-CoV-2-infektion och en annan grupp av SARS-CoV-2-naiva försökspersoner. Vi utförde en noggrann analys av epitopspecificiteten hos inducerade antikroppar med hjälp av mikroarrayade SARS-CoV-2-härledda vikta och oveckade proteiner och peptider som spänner över hela S-proteinet, inklusive RBD. Vidare analyserades IgG-subklasssvar. Vår studie avslöjar att Gam-COVID-Vac-vaccinerade försökspersoner monterar RBD-specifika antikroppar som kan blockera RBD-ACE2-interaktionen. Intressant nog fann vi att virusneutralisering också var associerad med antikroppar riktade mot en peptid utanför RBD, som kan vara involverad i övergången av preto-post-fusionskonformationen av spikeproteinet.

cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret

2. Resultat

2.1. Gam-COVID-vaccinerade försökspersoner inkluderar covid-19 naiva och konvalescenta försökspersoner

Konvalescenta försökspersoner infekterades av Wuhan-Hu-1-stammen enligt dess prevalens och sekvenseringsdata som erhölls vid tidpunkten för infektionen i Moskva-regionen. Naiva försökspersoner hade inga symtom på covid-19 och saknade SARS-CoV-2-specifika antikroppar vid tidpunkten för rekryteringen. I studien ingick 15 kvinnor och 7 män med en medianålder på 60 (dvs. 25–70 år) (tabell 1).

Tabell 1. Demografiska, kliniska och serologiska egenskaper hos försökspersoner.

Ett plasmaprov erhölls från var och en av försökspersonerna vid tidpunkten 0 (dvs baslinje) (Figur 1A), sedan vaccinerades varje försöksperson med Sputnik-V med ett intervall på cirka 21 dagar mellan första och andra injektion (tidpunkterna 1 och 2). Vid tidpunkten 3 samlades ett andra plasmaprov för att bestämma vaccininducerade antikroppssvar (Figur lA). Försökspersoner observerades i ytterligare 120 dagar. På dag 110 efter slutlig vaccination hade en patient (dvs. försöksperson 22) covid-19 medan de andra inte hade utvecklat några symtom på covid-19 (tabell 1).

Figur 1. Studiedesign och SARS-CoV-2-specifika antikroppssvar före och efter vaccination med Sputnik-V. (A) Studiedesign. Plasmaprov togs från covid-19-naiva (n=12) och konvalescenta försökspersoner (n=10) vid tidpunkten 0 (baslinje), sedan fick försökspersonerna två Sputnik-V vaccinationer vid tidpunkt 1 respektive 2 och ett plasmaprov togs vid tidpunkt 3 (dvs. dag 80–85 efter den första vaccinationen). (B) Nukleokapsidspecifika IgG-antikroppsnivåer (y-axel: ISU) hos naiva och konvalescenta patienter (x-axel) vid baslinjen. Den horisontella linjen indikerar gränsen för positivitet. (C) IgG-antikroppsnivåer (y-axlar: ISU) specifika för RBD, S, S1 och S2 hos försökspersoner vid tidpunkten 0 och 3 (x-axlar). (D) Från vänster till höger IgG1 , IgG2 , IgG3 och IgG4 antikroppsnivåer (y-axlar: optisk densitet OD-värden) till S (övre delen) och RBD (nedre delen) vid tidpunkterna 0 och 3 ( x-axlar). Signifikanta skillnader mellan grupper som bestämts med Wilcoxon-testet indikeras: ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns—inte signifikant.

2.2. Gam-COVID-Vac-vaccination inducerar breda IgG-svar på S, inklusive S1, RBD och S2

cistanche tillägg fördelar-öka immunitet

Vi utförde en detaljerad analys av antikroppssvar mot en stor panel av mikroarrayade vikta och oveckade SARS-CoV-2-proteiner och peptider som spänner över S-proteinet i plasmaprover från SARS-CoV-2-naiva och konvalescenta försökspersoner efter en fullständig kur av immuniseringar med Gam-COVID-Vac (Figur 1A,B; Tabell 1). Vid jämförelse av plasmaprover från tidpunkten 0 och tidpunkten 3 efter vaccination fann man en signifikant induktion av IgG-svar mot veckad men inte ovikt RBD, S, S1 och S2 (Figur 1C). Tre månader efter vaccination visade försökspersoner en 21-faldig ökning av RBD-specifika IgG-antikroppar (p < 0.{{20}}001) och en {{ 18}}-faldig ökning av S-specifika IgG-antikroppar (dvs tidpunkt 0: median 0,291, tidpunkt 3: median 5,778) (p < 0,0001), respektive. IgG-antikroppar mot S1 ökade 3.7- gånger (p=0.0023) och IgG-antikroppar mot S2 ökade 2.8- gånger (p=0}.0094) (Figur 1C ). Vaccination med Gam-COVID-Vac inducerade huvudsakligen IgG-svar på vikta S, S1 och RBD i jämförelse med naiva och konvalescenta patienter (figur 1C, S2 och S3), vilket indikerar att det kan användas för att förstärka SARS-CoV-2- specifika antikroppssvar även hos konvalescenta patienter. Signifikanta ökningar av IgG-antikroppar mot RBD, S och S1 observerades hos naiva och konvalescenta försökspersoner (Figur S2) och det fanns inga signifikanta skillnader vad gäller IgG-nivåer mot RBD, S, S1 och S2 hos naiva och konvalescenta försökspersoner vid tidpunkt 3 (Figur S3).

2.3. Gam-COVID-Vac-vaccination inducerar huvudsakligen ett IgG1-subklasssvar på S och RBD

Det har rapporterats att allergenspecifik immunterapi (AIT) främst inducerar allergenspecifika IgG1- och IgG4-svar som skiljer sig inte bara när det gäller deras effektorfunktioner (IgG1 kan mediera antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet (ADCC) och komplementaktivering medan IgG4 inte har dessa effektorfunktioner) men också när det gäller deras kinetik (IgG1: snabbt insättande och tidig nedgång: IgG4: långsamt insättande men ihållande nivåer) [28–30]. Vi undersökte därför IgG-subklassen (dvs. IgG1–IgG4) svar på S och RBD hos Sputnik-V-vaccinerade försökspersoner. Figur ID visar att vaccination nästan uteslutande inducerade ett IgG1-subklasssvar på S och RBD. Signifikanta ökningar av IgG1-nivåer specifika för S och RBD (p=0.0002 respektive p=0.0071) hittades efter vaccination. Emellertid kunde inga relevanta IgG2-, IgG3- eller IgG4-subklasssvar specifika för S och RBD detekteras (Figur 1D).

2.4. Induktion av virusneutraliserande antikroppar och antikroppar som hämmar RBD-ACE2-interaktionen genom Gam-COVID-Vac-vaccination

För att detektera virusneutraliserande antikroppar använde vi ett pVNT-test, där virusliknande partiklar pseudotypades med S-protein från den ursprungliga Wuhan-Hu-1-stammen och den nyligen beskrivna VOC Omicron. Antikroppar med neutraliserande aktivitet för Wuhan Hu-1-stam hittades hos alla utom en (dvs. försöksperson 22) av de 22 försökspersonerna (Figur 2A, Tabell 2) medan neutraliserande antikroppstitrar för Omicron var signifikant lägre (Figur 2B) och hittades endast i 17 av 20 försökspersoner (Figur 2A, Tabell 2). Ingen relevant neutralisering hittades för försökspersonerna 6, 7, 10, 11, 15 (Figur 2A, Tabell 2). Virusneutraliseringstitrar för Omicron var 25 gånger lägre än för WT (median 141,9 och 5,7 för Wuhan-Hu-1 respektive Omicron) (Figur 2B).

Figur 2. Virusneutraliserande aktivitet i plasma 3 månader efter Sputnik-V-vaccination och association med IgG-antikroppssvar mot RBD och S-härledda peptider. (A) Virusneutralisering (ID50) (y-axel) mot Wuhan-hu-1-stam (grön) och Omicron (orange) erhölls med plasma från naiv (blå) och konvalescent (röd) ämnen (x-axlar). (B) Jämförelse av virusneutralisering (y-axel: ID50 erhållen för plasma från de testade försökspersonerna, staplar representerar medianer med interkvartilintervall (IQR) Wuhan Hu-1 (grön) och Omicron (orange) Den horisontella linjen representerar resultat som erhållits med plasma från en frisk, icke-infekterad kontrollperson (frisk kontroll, HC) Signifikanta skillnader mellan stammar bestämdes med Mann–Whitney-testet: **** p < 0. {{30}}001. (C) Lokalisering av RBD och peptider korrelerade med virusneutralisering i ett schema av S (S1, S2). (D) Korrelationer mellan virusneutraliseringstitrar för Wuhan-Hu{{19 }} (WT) eller Omicron (y-axlar) och IgG-nivåer specifika för RBD och spik-härledda peptider 12, 32 och 46A (x-axlar: ISU). Blå och röda symboler indikerar naiva respektive konvalescenta personer. Asterisker indikerar signifikanta korrelationer enligt det icke-parametriska Spearman-testet, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 **** p < 0,0001, ns=inte signifikant.

Tabell 2. Jämförelse av IgG-nivåer specifika för S, S1, S2 och RBD uppmätt med mikro-array med hämningar av RBD-bindning till ACE2 och virusneutralisationstitrar (Wuhan-Hu-1, Omicron) bestämda för plasma från undersökta ämnen. Värmekartläggning utfördes för varje parameter separat med hjälp av Excel. Den högsta nivån ansågs vara mörkröd och den lägsta var vit.

Det faktum att hos alla utom en patient (dvs. individ 22) ökade virusneutraliserande antikroppar efter vaccination indikerar att de inducerades av vaccination (tabell 2). Försöksperson 21 visade redan en hög blockering av RBD-ACE2-interaktionen i MIA och hög virusneutralisering vid baslinjen (tabell 2). Plasmaprover från Gam-COVID-Vac-vaccinerade konvalescenta patienter som hade måttlig sjukdom (#1, 2, 17, 18, 21) hade högre virusneutraliseringstitrar än de från konvalescenta patienter som hade mild sjukdom (#22) eller inga symtom (#4, 5, 7, 9) (Tabell 1 och 2). Ett nyckelfynd var dock att hämning av RBD-bindning till ACE2 och virusneutralisering inte alltid var associerade. En mer än 25 % hämning av bindningen av RBD Wuhan Hu-1 till ACE2 inträffade endast för 6 försökspersoner som också hade visat hämning i virusneutraliseringstestet på grund av vaccination (dvs. försökspersoner 1, 2, 3, 17, 18 och 19) (tabell 2). Intressant nog observerades virusneutraliserande aktivitet (50 % infektionsdos (ID50) > 100) för 6 försökspersoner även om de visade ingen eller dålig hämning av RBD-bindning till ACE2 (tabell 2: Försökspersoner 6, 10, 12, 13, 16, 20) .

2.5. Virusneutralisering hos Gam-COVID-vaccinerade försökspersoner är starkt korrelerad med IgG-svar på RBD och den S-härledda peptiden 12

Som nämnts tidigare visade plasma från flera Gam-COVID-Vac-vaccinerade försökspersoner (t.ex. hos försökspersonerna 6, 10, 12, 13, 16, 20; Tabell 2) virusneutraliserande aktivitet men hämmade inte RBD-ACE2-interaktionen. Vi analyserade därför IgG-antikroppsreaktivitet mot peptiderna som spänner över S-proteinet genom mikroarray-baserad chipanalys [13] (Figur S4 och Figur 2C) och korrelerade peptidspecifika IgG-svar med virusneutralisering av Wuhan-Hu {{19} } stam och Omicron (Figur 2D). IgG-svar på tre peptider (dvs peptiderna 12, 32, 46A) såsom IgG-svar på veckad RBD korrelerade signifikant med neutralisering av Wuhan-Hu-1-stammen (Figur 2C, D). Peptid 12 stack ut eftersom antikroppssvar mot oveckad peptid 12 (Figur S1), men inte mot oveckade peptider 32 och 46A, förstärktes signifikant av Gam-COVID Vac hos naiva försökspersoner (Figur 3A) och även signifikant korrelerade med neutralisering av Omicron (Figur 2D) ). Ingen signifikant förstärkning observerades för konvalescenta patienter till peptiderna 12, 32 eller 46A (Figur 3A). Sekvensen för peptid 12 är mycket konserverad bland SARS-CoV-2-stammar (Figur 4) och finns i S1 nära N-terminalen av RBD och betecknar därför en region som kan vara relevant för övergången av pre- till efterfusionskonformationen av S-proteinet (Figur 3B).

Figur 3. Mediannivåer av IgG-antikroppar (y-axlar: ISU) mot S-härledda peptider (P12, P32, P46A) hos vaccinerade naiva och konvalescenta patienter vid tidpunkterna 0 och 3 (x-axlar) (A) . Signifikanta skillnader mellan grupper som bestämts med Wilcoxon-testet indikeras: * p < 0.05, ns=inte signifikant. (F) (B) Figur 3. Mediannivåer av IgG-antikroppar (y-axlar: ISU) mot S-härledda peptider (P12, P32, P46A) hos vaccinerade naiva och konvalescenta patienter vid tidpunkterna 0 och 3 (x) -axlar) (A). Signifikanta skillnader mellan grupper som bestämts med Wilcoxon-testet indikeras: * p < 0,05, ns=inte signifikant. (B) Visualisering av peptiderna 12, 32 och 46A i ytrepresentationen av SARS-CoV-2 spikproteintrimer (sidovy, prefusionskonformation) genererad med PyMOL. Peptid 12 är markerad i S-trimermodellen i rött, peptid 32 i blått och 46A i orange. Kolhydrater visas i ljusgrått.

Figur 4. Proteinsekvensanpassning av Wuhan-Hu-1 (överst) och Omicron (nedan) av SARS-CoV-2 S-protein. RBD är färgad i ljusgult och peptiderna 12, 22, 25, 32, 33, 46A och 47 är understrukna. Wuhan S-proteinsekvens motsvarar WA1-isolat (GeneBank accessionsnummer: BCN86353.1), Omicron S-proteinsekvens Omicron är klädd GRA, härstamning B.1.1.529 BA.1 baserat på GISAID-databasen ( https://www.gisaid.org/ (åtkom den 15 mars 2022)). Aminosyrasubstitutioner är färgkodade enligt deras hydropati- och laddningsegenskaper (rosa=hydrofob, grön=neutral, ljusblå=basisk hydrofil och ljusröd=sur hydrofil).

3. Diskussion

Det vektorbaserade vaccinet Gam-COVID-Vac även kallat Sputnik-V, var ett av de första SARS-CoV-2-vaccinerna som blev tillgängliga för användning i klinisk praxis. Det finns dock relativt lite information tillgänglig om de fina specificiteterna hos antikroppssvar hos försökspersoner som har vaccinerats med covid-19. I den här studien utförde vi en detaljerad analys av antikroppssvar mot mikroarrayade vikta och oveckade SARS-CoV-2-proteiner och peptider som spänner över S-proteinet i plasmaprover från SARS CoV-2-naiva och konvalescenta försökspersoner efter en fullständig kur av vaccinationer med Gam COVID-Vac. Gam-COVID-Vac inducerade huvudsakligen IgG1 men inga andra IgG-underklasssvar på vikta S, S1, S2 och RBD på ett jämförbart sätt hos naiva och konvalescenta patienter, vilket indikerar att det kan användas för att förstärka SARS-CoV-2- specifika antikroppssvar även hos konvalescenta patienter. Liksom andra genetiska vacciner fanns det Gam-COVID-Vac-inducerade antikroppssvaret huvudsakligen i IgG1-underklassen som har en kortare halveringstid jämfört med ett IgG4-underklasssvar som är mer hållbart. Till exempel är specifika IgG4-subklasssvar förknippade med långsiktigt skydd under allergenspecifik immunterapi medan specifika IgG1-svar byggs upp snabbt men bleknar efter några månader [28–30]. Följaktligen kommer frekventa boosterinjektioner av Gam-COVID-Vac och andra genetiska vacciner att behövas för att hålla neutraliserande antikroppssvar på en hög nivå. Vaccination med Gam-COVID-Vac inducerar ett antikroppssvar som i stor utsträckning efterliknar det som finns efter naturlig infektion med SARS-CoV-2 [13]. Dessutom tillhör antikroppssvar efter naturlig infektion huvudsakligen IgG1-subklassen och är riktade mot vikta S, S1, S2 och RBD [13]. Det nya och intressanta resultatet av vår studie var att plasma från flera Gam-COVID-Vac-vaccinerade försökspersoner (t.ex. hos försökspersonerna 6, 10, 12, 13, 16, 20; Tabell 2) visade virusneutraliserande aktivitet men hämmade inte RBD-ACE2 interaktion. Vi analyserade därför IgG-antikroppsreaktivitet mot peptiderna som spänner över hela S-proteinet genom mikroarray-baserad chipanalys [13] (figur 2D och S4) och korrelerade peptidspecifika IgG-svar med virusneutralisering av Wuhan-Hu {{62} } stam och Omicron BA.1 (Figur 2D). IgG-svar på tre peptider (dvs peptiderna 12, 32, 46A) såsom IgG-svar på RBD korrelerade signifikant med neutralisering av Wuhan-Hu-1-stammen (Figur 2C, D). Peptid 12 var emellertid unik eftersom antikroppssvar endast mot peptid 12, men inte mot peptiderna 32 och 46A, förstärktes signifikant genom vaccination (Figur 3A) och även signifikant korrelerade med neutralisering av Omicron (Figur 2D). Omfattningen av vaccininducerad förstärkning av IgG-svar på peptid 12 var blygsam men signifikant hos naiva försökspersoner och ganska jämförbar med förstärkningen av IgG-antikroppar riktade mot S och S1. Emellertid kan IgG-antikroppar mot den isolerade oveckade peptiden (Figur S1) representera endast en del av antikroppar riktade mot peptid 12 i det veckade proteinet. Dessutom är inte bara nivåerna utan även aviditeten hos antikropparna viktiga. Sekvensen av peptider 12 är mycket konserverad bland Wuhan-Hu-1-stammen och BA.1 Omicron VOC (Figur 4) och är härledd från en region som kan vara relevant för övergången av pre- till postfusion konformation av S-proteinet (Figur 3B). Dessutom visar jämförelsen av nya mutanta varianter av Omicron (BA.1, BA.2, BA.4/5, BA.2.12.1, BA.2.75, BQ.1), att peptid 12 (284–313 aa. ) förblir oförändrad vad gäller aminosyrasekvens, i motsats till till exempel peptid 32 (https://covariants.org/shared-mutations, (tillgänglig den 28 november 2022)). Noterbart har monoklonala antikroppar med virusneutraliserande förmåga som riktar sig mot den N-terminala domänen (NTD)-regionen som peptid 12 är en del av beskrivits [31], och det rapporterades att även andra vacciner kan inducera ett antikroppssvar riktat mot denna region [18–20,32], vilket indikerar att regionen som definieras av peptid 12 kan vara viktig för att inducera neutraliserande antikroppar. Man kan därför anta att antikroppar inducerade av Gam-COVID-Vac-vaccination kan neutralisera SARS-CoV-2 med två mekanismer, en helt enkelt genom att hämma RBD-ACE2-interaktionen och en annan genom att rikta in sig på regionen som innehåller peptid 12 av S- protein som kan vara involverat i strukturella förändringar (dvs övergång av prefusionen till fusionskonformationen av S). Vår studie har begränsningar. Till exempel använde vi en neutraliseringsanalys baserad på pseudotypade lentivirus men dessa analyser är brett använda och tillförlitliga [33]. Det är också en begränsning av vår studie att peptider på vår mikro-array var oveckade och således kan ha identifierat endast en bråkdel av neutraliserande antikroppar som kände igen de oveckade peptiderna medan en ännu större del av antikroppar kan ha varit bundna till konformationella epitoper i de identifierade område. Dessutom är det en begränsning av vår studie att vi analyserade endast ett litet antal ämnen. Vår studie indikerar dock tydligt att antikroppar med olika epitopspecificitet kan bidra till den skyddande effekten av Gam COVID-Vac-vaccination. Dessutom visar studien ett svar på en potentiellt konserverad peptid som kan användas för att skapa brett neutraliserande antikroppar.

cistanche tillägg fördelar-hur man stärker immunförsvaret

4. Material och metoder

4.1. Studera befolknings- och etikförklaring

Friska försökspersoner med (n {{0}}) eller utan (n=12) tidigare SARS-CoV-2-infektioner inkluderades i studien i december 2020 vid National Research Center Institute of Immunology of the Federal Medical Biological Agency of Russia (Etiknummer: #12-1, 29 december 2020). Alla deltagare lämnade skriftligt informerat samtycke. Tidigare SARS-CoV-2-infektion bekräftades antingen av ett tidigare positivt PCR-test och symtom på covid-19 eller av närvaron av SARS-CoV-2-specifika antikroppar riktade mot nukleokapsidantigen och/eller RBD och/eller S-antigen enligt beskrivning [13]. Alla försökspersoner immuniserades intramuskulärt med två doser av Sputnik-V (Gam-COVID-Vac, Biocard, Moskva, Ryssland) med ett intervall på tre veckor. Blodprov togs en dag före den första vaccinationen (TO, figur lA) och 80 till 85 dagar efter den första vaccinationen (T3, figur lA).

4.2. Detektion av SARS-CoV-2-specifika antikroppssvar

Immunoglobulinsvaret hos naiva och covid{{0}} konvalescenta försökspersoner bedömdes i plasmaprover före och efter immunisering med Sputnik-V (Figur 1A). Specifik IgG till en omfattande panel av SARS-CoV-2-proteiner och 46 peptider (25–30-merer) som spänner över S-proteinet mättes i 1:50 utspädda plasmaprover med mikroarray-chip-teknik som tidigare beskrivs [13]. Aminosyrasekvenserna, antalet aminosyror och molekylvikten för alla syntetiska peptider på det mikroarrayade chipet presenteras i Tabell 3. För peptiderna 12 och 32 och RBD uttryckt i Escherichia coli (E. coli) (ovikt) och i Human Embryonic Kidney 293 (HEK293) tillhandahålls celler (vikt) cirkulär dikroism (CD) spektra (Figur S1). Peptiderna 12 och 32 avslöjade ingen specifik sekundär struktur som bestämdes av cirkulär dikroism (CD) som visas i figur S1. I detalj aktiverades objektglas som innehöll mikroarrayer omgivna av en epoxiram (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Königshofen, Tyskland) med en aminreaktiv komplex organisk polymer, MCP-2 (Lucidant Polymers, Sunnyvale, CA , USA) för att underlätta bindningen av proteiner och peptider. SARS-CoV-2-antigener/peptider upptäcktes med en koncentration av 0,5–1 mg/ml i (75 mM Na2HPO4, pH=8.4) i tre exemplar med användning av en SciFlexArrayer S12 (Scienion AG, Berlin, Tyskland) [13]. Uttrycket och reningen av proteiner och peptidsyntes beskrivs i [13]. IgG-antikroppsreaktivitet mot mikroarray-antigener mättes genom att först tvätta mikroarrayerna i 5 minuter med fosfatbuffrad saltlösning med 0,5 % Tween 20 (PBST) och torka dem genom centrifugering med en Sigma 2–7-centrifug och MTP-11113 rotor (båda Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, Tyskland). Därefter tillsattes 35 µL alikvoter av 1:50 utspädda plasmaprover (provspädningsmedel, Thermofisher, Waltham, MA, USA) och inkuberades i 2 timmar vid 22 ◦C. Efter ytterligare ett tvättsteg applicerades 30 µL sekundära antikroppar (DyLight 550 (Pierce, Rockford, IL, USA) märkt anti-humant IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA)) och inkuberades i 30 minuter vid 22 ◦ C RT. Chips tvättades sedan, torkades och skannades därefter med användning av en konfokal laserskanner (Tecan, Männedorf, Schweiz). Bildanalys utfördes av MAPIX microarray bildinsamling och analysmjukvara (Innopsys, Carbonne, Frankrike) och konvertering av uppmätta fluorescensenheter till ISAC standardiserade enheter (ISU) utfördes enligt beskrivningen [13]. Specifika antikroppsnivåer uttrycks i ISAC-standardiserade enheter (ISU). S- och RBD-specifika IgG1–4-antikroppssvar mättes i plasmaprover (1:50 utspädda) i duplikat med ELISA som tidigare beskrivits [13] med en variation av<5% for their average values.

Tabell 3. Syntetiska SARS-CoV-2 spike protein-härledda peptider §.

4.3. Far UV Circular Dichroism (CD) Spectra

För peptider, P12 och P32 såväl som RBD uttryckt i E. coli och HEK293 celler utfördes CD-analys med användning av en Jasco J-180 spektropolarimeter (Japan Spectroscopic Co., Tokyo, Japan) som tidigare beskrivits [34]. CD-spektra av peptider och proteiner (Figur S1) mättes vid en koncentration av 0,1 mg/ml i 10 mM NaH2PO4 (pH 8,0), som användes för att spotta antigenerna.

4.4. Pseudovirusbaserad virusneutraliseringsanalys (PVT)

Virusneutraliseringsaktivitet i plasmaprover bestämdes genom pseudovirusbaserad virusneutraliseringsanalys som tidigare beskrivits [35]. För att producera SARS-CoV-2 spikvirusliknande partiklar (VLPs), samtransfekterades HEK293T-celler med 3 plasmider: lentiviral förpackningsplasmid pCMV∆8.2R (Addgene, Teddington, Storbritannien), pUCHR-GFP och en pCAGGS-S∆19-plasmid som kodar för SARS-CoV-2-spikproteinet av vildtyp (identiskt med referensen Wuhan-Hu-1- och WA1-isolaten) eller pCAGGS-S∆19-Om-plasmiden kodar för SARS-CoV-2 Omicron spikeprotein (vänlig gåva från Andrey Gorchakov, Laboratory of Immunogenetics, Institute of Molecular and Cellular Biology, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Ryssland). Före användning i pVNT titrerades VLP genom begränsande utspädning och inkuberades i 4 dagar med hACE2-transfekterade HEK293T-celler. En dos av virala partiklar som gav 50% grönt fluorescerande protein (GFP)-positiva celler valdes ut för användning i testet. För pVNT värmeinaktiverades alla plasmaprover i 30 minuter vid 56 ◦C före användning. På den 4:e dagen återsuspenderades celler efter infektion och andelen GFP-positiva celler mättes med flödescytometri. ID50-värden beräknades med användning av en sigmoidal kurva (GraphPad Prism 9.2.0 programvara, Sigmoidal, 4PL), rekonstruerad av procentandelen neutralisering vid de olika indikerade plasmakoncentrationerna.

4.5. Molecular Interaction Assay (MIA)

För att upptäcka förmågan hos plasmaprover av covid{0}} konvalescenta eller naiva patienter (tabell 1), före och efter Sputnik-V-immunisering, att hämma bindningen av 50 ng/ml av RBD-hu-1 till ACE2-receptor en molekylär interaktionsanalys (MIA) utfördes enligt beskrivning [13,36-39]. Denna analys kan mäta hämningen av märkt RBD till ELISA-plattbunden ACE2 av antikroppar eller annan förenings hämning av RBD-ACE2-interaktionen [38]. I korthet belades rekombinant ACE-2 (GenScript, Piscataway, NJ, USA) (2 µg/ml) över natten på NUNC Maxisorb 96-brunnars plattor (Thermofisher). Därefter genomfördes tre tvättcykler med tvättbuffert och sedan blockerades plattorna under 3 timmar vid RT med blockeringsbuffert. Serumprover späddes 1:2 i PBS, 0,05 % Tween 20, 1 % BSA och förinkuberades i 2 timmar med 50 ng His-märkt rekombinant RBD (GenScript). Sedan sattes de förinkuberade serumproverna till plattorna innehållande ACE-2 i 3 timmar och plattorna tvättades och inkuberades över natten med en 1:1000 utspädd mus monoklonal anti-His-tag-antikropp (Dianova, Hamburg, Tyskland) . Efter 3 tvättsteg tillsattes 1:1000 utspädd HRP-kopplad anti-mus IgG1-antikropp (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) under 2 timmar och detektion utfördes med ABTS. Medelvärden för optisk densitet (OD) motsvarande bunden RBD mättes vid 405 nm och 492 nm (referens) i en TECAN Infinite F5 ELISA-läsare med den integrerade programvaran i-control 2.0 (Tecan Group Ltd., Männedorf, Schweiz). Buffertkontrollen (överlagring utan RBD) subtraherades från varje resultat. Bestämningar utfördes i duplikat och resultaten visas som medelvärden med en variation av<5%.

cistanche tillägg fördelar-hur man stärker immunförsvaret

4.6. Visualisering av peptider i spikproteinstrukturen

Ytrepresentation av SARS-CoV-2 spikprotein genererades i PyMOL (PyMOL Molecular Graphics System, version 2.5.0a0, Schrödinger, LLC, New York, NY, USA) baserat på PDB-posten 6XR8.

4.7. Statistisk analys

Statistisk analys utfördes med GraphPad Prism (version 9.2.0 GraphPad Software, La Jolla California). Wilcoxon-testet (figur 1C, D och 3A), Mann-Whitney-test (figur 2B och S3) och Friedman-test (figur S2) användes för jämförelse mellan två eller flera grupper. p < 0.05 ansågs vara statistiskt signifikant. Korrelationen mellan de två grupperna bestämdes av Spearman rank test (Figur 2D). En normaliserad olinjär regression utfördes med GraphPad Prism-mjukvaran (Sigmoidal 4PL). Data presenteras som median ± IQR. Asterisker indikerar signifikanta skillnader mellan grupper, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, ns—inte signifikant.

5. Slutsatser

Sammanfattningsvis är vår studie den första som på djupet studerar epitop- och IgG-subklassspecificiteten för antikroppar inducerade av Gam-COVID-Vac och för att avslöja olika mekanismer för Gam-COVID-Vac-inducerad virusneutralisering av antikroppar. I synnerhet erhöll vi bevis för att antikroppar riktade mot en peptid (dvs peptid 12) belägen nära men utanför RBD i den N-terminala delen av S1 är associerade med virusneutralisering. Den potentiella virusneutraliserande aktiviteten hos peptidspecifika 12-antikroppar kan bero på deras förmåga att interferera med övergången av spikproteinets konformation före till efter fusion. Vi föreslår övervägande av inkluderingen av regionen som definieras av peptid 12 i en immunogen form i vacciner för att inducera antikroppar mot detta epitopområde och för att testa antikroppar inducerade av sådana vacciner för virusneutralisering. Om virusneutralisering av vacciner kan förbättras, kan inkluderingen av en immunogen peptid 12-epitoper förbättra effektiviteten av covid{14}}-vacciner. Dessutom kan man överväga att utveckla antikroppar mot den peptid-12-definierade epitopen för passiv immunisering. Eftersom den 12-definierade epitopen av peptiden är konserverad i för närvarande kända SARS-CoV-2-varianter, kan vacciner och antikroppar riktade mot peptid 12 korsskydda mot SARS-CoV-2-varianter. Vi tillhandahåller därför ny kunskap som kan vara till hjälp för utvecklingen av nya aktiva och passiva vaccinationsstrategier för covid-19.

Referenser

1. Rodriguez-Coira, J.; Sokolowska, M. SARS-CoV-2-kandidatvacciner – sammansättning, verkningsmekanismer och stadier av klinisk utveckling. Allergi 2021, 76, 1922–1924. [CrossRef] [PubMed]

2. Sharma, A.; Ahmad, FI; Lal, SK COVID-19: En recension om den nya evolutionen, överföringen, detektion, kontroll och förebyggande av coronavirusets sjukdom. Virus 2021, 13, 202. [CrossRef] [PubMed]

3. Arshad, B.; Iqbal, T.; Bhatti, KP Review-Insights in Off-Label terapeutiska strategier mot mild och svår covid-19-infektion. Pak. J. Pharm. Sci. 2021, 34, 1469–1484. [CrossRef] [PubMed]

4. Zaman, W.; Saqib, S.; Ullah, F. COVID-19: Fylogenetiska metoder kan hjälpa till att hitta resurser för ett naturligt botemedel. Phytother. Res. 2020, 34, 2783–2785. [CrossRef]

5. Rubio-Casillas, A.; Redwan, EM; Uversky, VN SARS-CoV-2 Intermittent virulens som ett resultat av naturligt urval. COVID 2022, 2, 1089–1101. [CrossRef]

6. Logunov, DY; Dolzhikova, IV; Zubkova, OV Säkerhet och immunogenicitet för ett rAd26- och rAd5-vektorbaserat heterologt prime-boost COVID-19-vaccin i två formuleringar: Två öppna, icke-randomiserade fas 1/2-studier från Ryssland. Lancet 2020, 396, 887–897, Korrigering i Lancet 2021, 397, 98. [CrossRef]

7. Folegatti, PM; Ewer, KJ; Aley, PK Säkerhet och immunogenicitet för ChAdOx1 nCoV-19-vaccinet mot SARS-CoV-2: En preliminär rapport från en fas 1/2, enkelblind, randomiserad kontrollerad studie. Lancet 2020, 396, 467–478, Rättelse i Lancet 2020, 396, 1884. [CrossRef]

8. Logunov, DY; Dolzhikova, IV; Shcheblyakov, DV Säkerhet och effekt av ett rAd26- och rAd5-vektorbaserat heterologt prime-boost COVID-19-vaccin: En interimsanalys av en randomiserad kontrollerad fas 3-studie i Ryssland. Lancet 2021, 397, 671–681, Rättelse i Lancet 2021, 397, 670. [CrossRef]

9. Jackson, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. Mekanismer för SARS-CoV-2 inträde i celler. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef]

10. Heinz, FX; Stiasny, K. Utmärkande egenskaper hos nuvarande covid-19-vacciner: Kända och okända antigenpresentationer och verkningssätt. NPJ Vaccines 2021, 6, 104. [CrossRef]

11. Lim, HX; Masomian, M.; Khalid, K.; Kumar, AU; MacAry, PA; Poh, CL Identifiering av B-cellsepitoper för att framkalla neutraliserande antikroppar mot SARS-CoV-2 spikproteinet genom bioinformatik och inriktning mot monoklonala antikroppar. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 4341. [CrossRef]

12. Moroy, G.; Tuffery, P. Peptide-Based Strategies Against SARS-CoV-2 Attack: An Updated In Silico Perspective. Främre. Läkemedel. Discov. 2022, 2, 899477. [CrossRef]

13. Gattinger, P.; Niespodziana, K.; Stiasny, K. Neutralization of SARS-CoV-2 kräver antikroppar mot konformationella receptorbindande domänepitoper. Allergy 2022, 77, 230–242. [CrossRef]

14. Niu, L.; Wittrock, KN; Clabaugh, GC Ett strukturellt landskap av neutraliserande antikroppar mot SARS-CoV-2-receptorbindande domän. Främre. Immunol. 2021, 12, 647934. [CrossRef]

15. Shan, S.; Mok, CK; Zhang, S. En potent och skyddande mänsklig neutraliserande antikropp mot SARS-CoV-2-varianter. Främre. Immunol. 2021, 12, 766821. [CrossRef]

16. Bajpai, P.; Singh, V.; Chandele, A. Neutraliserande antikroppar mot SARS-CoV-2 ger nya insikter i neutraliseringen av varianter och andra mänskliga coronavirus. Främre. Cell. Infektera. Microbiol. 2022, 12, 928279. [CrossRef]

17. Vishwakarma, P.; Yadav, N.; Rizvi, ZA Svårt akut respiratoriskt syndrom Coronavirus 2 Spike Proteinbaserade nya epitoper inducerar potenta immunsvar in vivo och hämmar viral replikering in vitro. Främre. Immunol. 2021, 12, 613045. [CrossRef]

18. Garrett, ME; Galloway, JG; Wolf, C. Omfattande karakterisering av antikroppssvaren mot SARS-CoV-2 Spike-protein hittar ytterligare vaccininducerade epitoper utöver de för mild infektion. eLife 2022, 11, e73490. [CrossRef]

19. Peng, M.; Dou, X.; Zhang, X. Skyddande antigena epitoper avslöjade genom immunsignaturer efter tre doser av inaktiverat SARS-CoV-2-vaccin. Främre. Immunol. 2022, 13, 938378. [CrossRef]

20. Polvere, I.; Parrella, A.; Zerillo, L. Humoral Immune Response Diversity to Different Covid-19-vacciner: Implikationer för "Green Pass"-policyn. Främre. Immunol. 2022, 13, 833085. [CrossRef]

21. Tukhvatulin, AI; Dolzhikova, IV; Shcheblyakov, DV En öppen, icke-randomiserad, fas 1/2-studie om säkerhet, tolerabilitet och immunogenicitet hos endosvaccin "Sputnik Light" för förebyggande av coronavirusinfektion hos friska vuxna. Lancet Reg. Hälsa Eur. 2021, 11, 100241. [CrossRef] [PubMed]

22. Gonzalez, S.; Olszevicki, S.; Salazar, M. Effektiviteten av den första komponenten av Gam-COVID-Vac (Sputnik V) på minskning av SARS-CoV-2 bekräftade infektioner, sjukhusvistelser och dödlighet hos patienter i åldern 60–79: En retrospektiv kohortstudie i Argentina. EClinicalMedicine 2021, 40, 101126. [CrossRef] [PubMed]

23. Gushchin, VA; Dolzhikova, IV; Shchetinin, AM Neutralizing Activity of Sera from Sputnik V-vaccinated People against Variants of Concern (VOC: B.1.1.7, B.1.351, P.1, B.1.617.2, B.1.617.3) och Moscow Endemic SARS -CoV-2 varianter. Vaccines 2021, 9, 779. [CrossRef] [PubMed]

24. Voko, Z.; Kiss, Z.; Surjan, G. Nationell effektivitet av fem SARS-CoV-2-vacciner i Ungern – HUN-VE-studien. Clin. Microbiol. Infektera. 2022, 28, 398–404. [CrossRef] [PubMed]

25. Jeewandara, C.; Fernando, S.; Pushpakumara, PD Immunsvar efter den första dosen av Sputnik V (Gam-COVID-Vac). Sci. Rep. 2022, 12, 1727. [CrossRef]

26. Ikegame, S.; Siddiquey, MNA; Hung, CT Neutraliserande aktivitet av Sputnik V-vaccinsera mot SARS-CoV-2-varianter. Nat. Commun. 2021, 12, 4598. [CrossRef]

27. Gushchin, VA; Tsyganova, EV; Ogarkova, DA Sputnik V skydd mot covid-19 hos personer som lever med HIV under antiretroviral terapi. EClinicalMedicine 2022, 46, 101360. [CrossRef]

28. Shamji, MH; Valentina, R.; Jardetzky, T. Rollen av allergenspecifik IgE, IgG och IgA vid allergisk sjukdom. Allergy 2021, 76, 3627–3641. [CrossRef]

29. Eckl-Dorna, J.; Weber, M.; Stanek, V. Två års behandling med det rekombinanta gräspollenallergivaccinet BM32 inducerar ett kontinuerligt ökande allergenspecifikt IgG4-svar. EBioMedicine 2019, 50, 421–432. [CrossRef]

30. Shamji, MH; Kappen, JH; Akdis, M. Biomarkörer för övervakning av klinisk effekt av allergenimmunterapi för allergisk rhinokonjunktivit och allergisk astma: An EAACI Position Paper. Allergy 2017, 72, 1156–1173. [CrossRef]

31. Tortorici, MA; Beltramello, M.; Lempp, FA Ultrapotenta humana antikroppar skyddar mot SARS-CoV-2-utmaning via flera mekanismer. Science 2020, 370, 950–957. [CrossRef]

32. Cia, G.; Pucci, F.; Rooman, M. Analys av den neutraliserande aktiviteten hos antikroppar riktade mot öppna eller stängda SARS-CoV-2 spikproteinkonformationer. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 2078. [CrossRef]

33. Meng, B.; Datir, R.; Choi, J. SARS-CoV-2 spik N-terminal domän modulerar TMPRSS2-beroende viralt inträde och fusogenicitet. Cell Rep. 2022, 40, 111220. [CrossRef]

34. Resch, Y.; Weghofer, M.; Seiberler, S. Molecular characterization of Der p 10: En diagnostisk markör för bred sensibilisering vid husdammskvalsterallergi. Clin. Exp. Allergy 2011, 41, 1468–1477. [CrossRef]

35. Byazrova, M.; Yusubalieva, G.; Spiridonova, A. Mönster för cirkulerande SARS-CoV-2-specifik antikroppsutsöndring och generering av minnes-B-celler hos patienter med akut covid-19. Clin. Transl. Immunol. 2021, 10, e1245. [CrossRef]

36. Gattinger, P.; Borochova, K.; Dorofeeva, Y. Antikroppar i serum från konvalescenta patienter efter mild covid-19 förhindrar inte alltid virus-receptorbindning. Allergy 2021, 76, 878–883. [CrossRef]

37. Gattinger, P.; Tulaeva, I.; Borochova, K. Omicron: En SARS-CoV-2 variant av verklig oro. Allergi 2022, 77, 1616–1620. [CrossRef]

38. Gattinger, P.; Ohradanova-Repic, A.; Valenta, R. Betydelse, tillämpningar och egenskaper hos analyser som mäter SARS-CoV-2 neutraliserande antikroppar. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24, 5352. [CrossRef]

39. Gattinger, P.; Kratzer, B.; Tulaeva, I.; Niespodziana, K.; Ohradanova-Repic, A.; Gebetsberger, L.; Borochova, K.; Garner-Spitzer, E.; Trapin, D.; Hofer, G.; et al. Ett vaccin baserat på veckad receptorbindande domän-PreS-fusionsprotein med potential att inducera steriliserande immunitet mot SARS-CoV-2-varianter. Allergy 2022, 77, 2431–2445. [CrossRef]