Distinkta toll-liknande receptorer genuttryck och glialrespons i olika hjärnregioner av naturlig scrapie del 2

2.2. Neuropatologiska egenskaper i Hippocampus hos får som är naturligt infekterade med Serapie

Hos de skrapieinfekterade fåren och kontrollfåren undersöktes de fyra följande hippocampusområdena mer i detalj för alla patologiska markörer: pyramidcellskikten CA1, CA3 och CA4 och SLM (Figur 3).

Nyligen genomförda studier har visat att pyramidcellskiktet spelar en viktig roll i minnet. Det pyramidformiga cellskiktet är neuronalt i hjärnan som huvudsakligen ansvarar för uppfattningen av den yttre miljön och minneslagring.

Under inlärning och minne frigör det pyramidformiga cellskiktet vissa signalsubstanser, vilket kan stimulera kommunikationen mellan neuroner och därigenom förbättra lagringen och hämtningen av minnet. Dessutom kan det pyramidformiga cellskiktet också screena och integrera information i inlärnings- och minnesprocessen, vilket hjälper oss att snabbt bemästra nya kunskaper och färdigheter.

Studier har också funnit att funktionen och hälsan hos pyramidcellskiktet har stor inverkan på minnets prestanda. Om pyramidcellskiktet är skadat eller kraftigt belastat kan minnet påverkas kraftigt. Därför måste vi vara uppmärksamma på hälsan och underhållet av pyramidcellskiktet för att upprätthålla goda inlärnings- och minnesförmåga.

Rekommendationer för hälsa och underhåll av pyramidcellskiktet inkluderar kost, motion och sömn. Till exempel kan en kost rik på fettsyror och antioxidanter bidra till att främja hälsan hos pyramidcellskiktet; regelbunden träning kan förbättra nervsystemets funktion och motståndskraft; och goda sömnvanor kan hjälpa till att minska stressen på pyramidcellskiktet och främja minneskonsolidering och återhämtning.

Kort sagt spelar pyramidcellskiktet en viktig roll för inlärning och minne. Vi bör vara uppmärksamma på hälsan och underhållet av pyramidcellskiktet för att förbättra vår inlärnings- och minnesförmåga.

Klicka på Vet korttidsminne hur du kan förbättra

Samtidigt bör vi undvika överdriven trötthet och stress, ge hjärnan tillräcklig vila och återhämtningstid och låta vårt minne kontinuerligt förbättras och fulländas.

Det kan ses att vi behöver förbättra vårt minne. Cistanche kan förbättra minnet avsevärt eftersom det har antioxidant-, antiinflammatoriska och anti-aging-effekter, vilket kan bidra till att minska oxidation och inflammatoriska reaktioner i hjärnan och därigenom skydda nervsystemets hälsa. Dessutom kan Cistanche också främja tillväxt och reparation av nervceller och därigenom förbättra anslutningen och funktionen hos det neurala nätverket.

Dessa effekter kan bidra till att förbättra minnet, inlärningsförmågan och tankehastigheten, och kan också förhindra uppkomsten av kognitiv dysfunktion och neurodegenerativa sjukdomar.

Figur 3. Fördelning av neuropatologiska lesioner (HE), PrPSc-deposition, astroglios (GFAP), och mikroglios (Iba1), i fyra olika hippocampusregioner i skrapieinfekterade får och kontrollfår: pyramidala cellskikt CornuAmmonis (CA) 1, 3 och 4 och stratum lacunosum-moleculare (SLM).

Grafer visar semikvantitativa bedömningsvärden för varje analyserad parameter. (A) Milda spongiforma förändringar observerades i alla analyserade hippocampusregioner. (B) Intraneuronalt PrPSc-mönster (L42) i CA1, CA3 och CA4 och utbrett fint granulärt PrPSc-mönster i SLM. (C) Ökad Iba1-färgning hos skrapieinfekterade kontra kontrollfår.

Förstorade bilder visar några av de observerade morfologiska skillnaderna. (D) Tecken på måttlig reaktiv astroglios hos skrapieinfekterade får jämfört med kontroller. Poäng varierar från 0 (negativ) till 5 (maximal intensitet).

Signifikanta skillnader bestämdes med hjälp av Students t-test eller Mann–Whitney U-test för normal- respektive icke-normalfördelade data. * p < 0.05, ** p < 0,01. Skalstång=200 µm.

Spongios i hippocampus var mycket mild och enstaka vakuoler observerades i CA1, CA3 och CA4 och SLM (Figur 3A). Denna begränsade neuronala förlust stod i kontrast till gles, men fokalt intensiv PrPSc-avsättning i CA1 och CA3 (Figur 3B).

Verymild PrPSc-färgning observerades i CA4 och SLM. Distinkta PrPSc-mönster observerades i dessa hjärnområden (Figur S2). Medan intraneuronala och neuropil-associerade PrPSc-mönster dominerade i CA1 och CA3, var intraglial deponering det mainmorfologiska mönstret som observerades i SLM.

Milda intraneuronala och neuropil-associerade PrPSc-mönster observerades konsekvent i CA4, även om intensiteten var lägre än den som observerades i CA1 och CA3. Iba1 uttrycktes konstitutivt och var sparsamt fördelad i kontrollproverna. Som kontrast observerades markant mikroglios i CA1, CA3 och CA4 och SLM i scrapie-infekterade får.

De mikrogliala morfologiska egenskaperna skiljde sig emellertid signifikant mellan dessa hjärnregioner. I CA1-pyramidskiktet visade de flesta mikrogliaceller korta processer med förstorade cellkroppar, karakteristiskt för den hypertrofiska morfologin.

I CA4 var mikrogliacellerna också hypertrofiska men visade längre och tunnare grenar än CA1 mikrogliacellerna. Samtidigt visade den hypertrofiska mikroglian i SLM korta och tunna processer med svullna cellulära kroppar. Däremot, i CA3, observerade vi ovannämnda stav-mikroglia-morfologi [42].

Dessa mikrogliaceller hade långsträckta cellkroppar, med en lång parallell primär process orienterad vinkelrätt mot CA3 pyramidalcellskiktet, och undergrenar som var kortare än de långa primära processerna.

GFAP-immunfärgning ökade signifikant i CA1- och CA3-pyramidalcellskikten från skrapieinfekterade kontra kontrollfår. Intressant nog var PrPSc-poängen högst i CA1 och CA3. Inga skillnader observerades i CA4-pyramidcellskiktet eller SLM.

2.3. Neuropatologi av skrapie-infekterade tg338-möss

Samma neuropatologiska markörer för spongios, PrPSc-avsättning, mikroglios och astroglios som analyserats hos får undersöktes i talamus hos kliniskt påverkade tg338-möss som hade infekterats intracerebralt med skrapie (Figur 4).

Jämfört med kontrollerna observerades signifikanta skillnader (p < 0.05) i spongios i thalamusof scrapie-infekterade möss, i vilka vakuolerna var begränsade till neuropilen.

PrPSc-avlagringar var brett distribuerade på nivån av cytoplasman och neuropilen. Bedömningen av glios avslöjade signifikanta skillnader i Iba1- och GFAP-immunfärgning mellan de scrapie-infekterade och kontrollmössen, med både astrocyter och mikroglia som uppvisade hypertrofiska morfologier.

PrPres-ackumuleringen utvärderades också av WB i alla scrapie-infekterade möss, vilket avslöjade ett konstant 19 kDa bandmönster (Figur 5). Intensiteten av PrPres-signalen i tg338-möss var mer homogen bland individer än hos får, som förväntat för experimentell infektion där dosen, inokuleringsåldern och tidpunkten för avlivning kontrollerades.

Ingen signal detekterades i kontrollmössen inokulerade med normalt hjärnhomogenat, vilket inte överensstämmer med de negativa IHC-resultaten.

Figur 4. Talamussnitt från skrapieinfekterade (intracerebral ympning) och åldersmatchade tg338 kontrollmöss immunfärgade för att bedöma spongios (hematoxylin-eosin), PrPSc-deposition (R486antikropp), astrocyter (glialfibrillärt surt protein; GFAP) och mikroglia -bindande adaptormolekyl-1; Iba1). (A, E) Allvarliga spongiforma lesioner lokaliserade huvudsakligen i neuropilen hos scrapie-infekterade kontra kontrollmöss. (B, F) Flera PrPSc-positiva neuroner är uppenbara i scrapie-infekterade möss, men frånvarande från kontroller. (C, G) Aktiverade mikroglia som visar mer intensiv immunfärgning och tjocka processer i scrapie-infekterade möss jämfört med kontroller. (D, H) Ökad astroglios med hypertrofiska cellkroppar och processer hos skrapieinfekterade möss jämfört med kontroller. Poäng varierar från 0(negativ) till 5 (maximal intensitet).

Signifikanta skillnader bestämdes med hjälp av Studentens t-testor Mann–Whitney U-test för normal- respektive icke-normalfördelade data. * p < 0.05,** p < 0,01. Skalstång=200 µm.

Figur 5. Western blot-detektion av PrPres-ackumulering i CNS hos kliniskt påverkade tg338-möss intracerebralt inokulerade med scrapie jämfört med matchade kontroller.

Ekvivalenta proteinkvantiteter laddades för adekvat jämförelse och immunoblots kördes med användning av SHA31 monoklonalantikropp. Molekylviktsmarkörer (kDa) är indikerade på vänster sida av immunblotten.

Uppregleringen av TLR-uttryck som svar på Prpsc har tidigare rapporterats i experimentella in vivo- och in vitro-förhållanden, därför, efter att ha karakteriserat närvaron av de viktigaste prioninducerade neuropatologiska förändringarna i CNS i samband med naturlig och experimentell sjukdom, undersökte vi om dessa förändringar korrelerade med förändringar i TLR-genuttryck.

För detta ändamål utförde vi qPCR med hjälp av prover från de fyra hjärnregionerna hos får för att bedöma uttrycket av MyD8g och Trif, de två huvudsakliga adapterproteinerna som är inblandade i TLR-signalering; CD36, en scavengerreceptor som samarbetar med TLR; och TLR-mRNA.

Dessutom mätte vi nivåerna av fyra pro- och anti-. inflammatoriska cytokiner i thalamus och hippocampus hos får för att ytterligare bedöma det inflammatoriska svaret. I tg338-möss mätte vi mRNA-nivåerna av MyD88 och TLR1-9 i thalamus.

Gener för vilka signifikanta skillnader observerades beträffande kontroller, och motsvarande veckändringar, visas i tabell $l, och ACt-värdena från kontroll- och skrapieinfekterade får är representerade i figur $3.

Antalet förändrade gener minskade i kaudal-rostral riktning. Medulla oblongata hos skrapie-infekterade får var den region där de största förändringarna i TLR-genuttryck observerades (Figur 6). I denna region var uttrycket av TLR2, 3, 4, 6,7, 8, 9 och CD36 signifikant högre (p < 0.01) hos de scrapie-infekterade jämfört med kontrolldjuren.
I thalamus var TLR6, MyD88 och CD36 signifikant uppreglerade i den skrapieinfekterade gruppen (p < 0.05), medan TLR2 och TLR3 visade en tendens till uppreglering (p < {{12} }.1). I frontal cortex (det mest rostrala området) var TLR4 och CD36 de enda överuttryckta generna (p < 0,05).

Anmärkningsvärt nog hittades kontrasterande uttrycksmönster i hippocampus hos det skrapieinfekterade fåret, där TLR2 och MyD88 var nedreglerade (p < 0.01) och TLR1 visade en tendens till nedreglering (p < 0,1) .

Dessutom var hippocampus det enda område där CD36-uttryck inte ökade. Totalt sett var TLR4 den gen som var mest uppreglerad hos scrapie-infekterade kontra kontrollfår i alla fyra hjärnregionerna, även om inga signifikanta skillnader observerades i thalamus eller hippocampus på grund av intraindividuell variabilitet.

Analysen av cytokinnivåer avslöjade överuttrycket av TGF-, IL-10 och IL-6 i thalamus hos skrapieinfekterade kontra kontrollfår, men inga förändringar i hippocampus (Figur 7).

Figur 6. Genuttryck av TLR 1-10, MyD88, Trif och CD36 i medulla oblongata (A), thalamus (B), frontal cortex (C) och hippocampus (D) hos kontroll- och scrapie-infekterade får .

Data representeras som genomsnittlig veckning ± SEM-ökning för kontrollfår (uttryckt som en poäng på 1). Medelpoäng jämfördes med studentens t-test eller Mann–Whitney U-test för normal respektive icke-normalfördelad data. # p < 0.1, * p < 0.05, ** p < 0,01.

Figur 7. Genuttryck av de antiinflammatoriska cytokinerna TGF- och IL-10, och de proinflammatoriska cytokinerna TNF- och IL-6, i thalamus (A) och hippocampus (B) av kontroll och naturligt skrapie -infekterade får.

Data representeras som medelvärdet ± SEM-faldig förändring avseende kontroller (uttryckt som en poäng på 1). Medelpoängen jämfördes med studentens t-test eller Mann–Whitney U-test för normal- respektive icke-normalfördelade data. * p < 0.

För att undersöka om förändringar i TLR-uttryck i CNS vid naturlig sjukdom är jämförbara med de som induceras i tg338-musmodellen efter intracerebral infektion med skrapie, utvärderades transkriptionsnivåerna av TLR och MyD88 i thalamus ofg338-möss (Figur 8). TLR1- och TLR2-mRNA-nivåerna ökade signifikant (p < 0.01) jämfört med kontroller, och det fanns en tendens till uppreglering av TLR7 (p< 0.1). The levels of TLR8 expression were undetected.

Figur 8. Genuttryck av TLR1-7, TLR9 och MyD88 i thalamus hos kliniskt påverkade tg338-möss intracerebralt inokulerade med scrapie-positivt inokulum kontra kontroller (scrapie-negativeinoculum). Resultaten uttrycks som medelvärdet ± SEM-faldig förändring avseende kontroller (uttryckt som en poäng på 1). Medelpoäng jämfördes med studentens t-test eller Mann–Whitney U-test för normal respektive icke-normalfördelad data. # p < {{10}}.1, ** p < 0,01.

2.5. Bedömning av TLR4-proteinnivåer bekräftar uppreglering upptäckt av qPCR inScrapie-infekterade får

För att bekräfta att den observerade ökningen av TLR4-mRNA översätts till förändringar i proteinnivåer, utvärderades TLR4 av WB i medulla oblongata, thalamus, hippocampus och frontala cortex hos fyra skrapieinfekterade får och fyra kontrollfår (Figur 9).

I överensstämmelse med qPCR-resultaten ökade TLR4-proteinnivåerna signifikant (p < 0.05) i alla fyra hjärnregionerna hos det skrapieinfekterade fåret.

Figur 9. TLR4-proteinuttryck i medulla oblongata (Mo), thalamus (Th), hippocampus (Hc) och frontal cortex (Fc) hos skrapieinfekterade får kontra kontrollfår (n=4 per grupp). -aktin användes som laddningskontroll.

Grafen visar densitometrivärden och indikerar en signifikant ökning av TLR4-uttryck i alla regioner hos skrapieinfekterade kontra kontrollfår. Data uttrycks som tema ± SEM. Medelpoäng jämfördes med studentens t-test. * p < 0.05.

3. Diskussion

Under de senaste åren har studiet av det neuroinflammatoriska svaret vid prionsjukdomar lett till en bättre förståelse av de bakomliggande mekanismerna och konsekvenserna.

Neuroinflammation involverar reaktiv mikroglios och astroglios [43], som båda kan upptäckas före uppkomsten av kliniska tecken och föregår spongios och neuronal förlust [7,8,18].

Huruvida mikroglialaktivering i prionsjukdomar är fördelaktigt eller skadligt förblir en fråga om debatt. Vissa författare hävdar att mikroglial aktivering och spridning bidrar till den neuroinflammatoriska processen och åtföljande neurodegeneration [8,18,44].

Andra pekar dock på en övergripande skyddande roll för mikroglia, och in vitro visar studier att mikroglia kan internalisera och degradera PrPSc [27,45]. I linje med dessa fynd har in vivoexperiment visat att mikroglial utarmning minskar överlevnadsperioden, troligen på grund av minskad PrPSc-clearance [46,47].

Därför är det troligt att flera reaktiva mikrogliala fenotyper existerar under sjukdomsprocessen, som utövar en neuroprotektiv effekt i tidiga sjukdomsstadier och, allt eftersom sjukdomen fortskrider, ger vika för en proinflammatorisk fenotyp som framkallar skadliga effekter [9,10]. En hypotes föreslår att TLR-signalering förmedlar gliacellsaktivering vid prionsjukdomar.

Mikrogliaupptaget av amyloidfibrer i Alzheimers sjukdom är känt för att främjas av TLR-aktivering [48,49]. Således, medan aktiveringen av TLRs på gliaceller kan spela en roll i elimineringen av aggregerade eller onormala proteiner (t.ex. prionprotein), kan kronisk aktivering vara skadligt för värden, vilket resulterar i neurotoxicitet och neuronal celldöd [50].

Hittills är data om TLRs roll i prionpatogenes mycket begränsade. Få studier har mätt förändringar i TLR-uttryck i CNS i murina modeller, och en har rapporterat förändringar i TLR-uttryck i blod från lamm, där alla fall använde djur experimentellt infekterade med prionsjukdom [22,26,30].

For more information:1950477648nn@gmail.com