Distinkta toll-liknande receptorer genuttryck och glialrespons i olika hjärnregioner av naturlig scrapie del 1

Abstrakt:

Prionsjukdomar är kroniska och dödliga neurodegenerativa sjukdomar som kännetecknas av ackumulering av sjukdomsspecifikt prionprotein (PrPSc), spongiforma förändringar, neuronal förlust och glios.

Prionsjuka, även känd som tempelsjuka, vaxätande sjukdom, etc., är en akut virusinfektion som orsakas av prioner. Sjukdomen överförs främst genom att äta rå mat som innehåller prioner. När det väl är infekterat med prioner kan det orsaka hjärninflammation och skador på nervsystemet, och symtom som huvudvärk, kräkningar och feber kan uppstå.

Men när vi möter en sådan situation kan vi inte förlora förtroendet för vårt minne på grund av förekomsten av prionsjuka. De flesta infekterade personer kan återhämta sig och återställa sitt minne efter behandling.

Ur ett förebyggande perspektiv kan vi förstås försöka äta mer lagad mat för att undvika prionsmitta. Samtidigt, om du känner några symtom, bör du också uppsöka läkare så snart som möjligt för att förhindra att sjukdomen förvärras.

I det dagliga livet kan vi prova lite enkel minnesträning, som att läsa, sammanställa listor, organisera händelser och information etc. för att förbättra vårt minne. Denna träning kräver inte mycket tid och energi, men de är mycket viktiga för att upprätthålla en sund hjärna och effektiv minnesfunktion.

Kort sagt, när vi stöter på sjukdomar som prionsjuka, bör vi möta det positivt, söka professionell medicinsk behandling och förebyggande åtgärder och uppmärksamma dagliga minnesövningar för att säkerställa vår fysiska hälsa och effektiva arbete. Det kan ses att vi behöver förbättra minnet, och Cistanche kan förbättra minnet avsevärt eftersom Cistanche är ett traditionellt kinesiskt läkemedelsmaterial med många unika effekter, varav en är att förbättra minnet. Effekten av Cistanche kommer från de olika aktiva ingredienser den innehåller, inklusive garvsyra, polysackarider, flavonoidglykosider etc. Dessa ingredienser kan främja hjärnans hälsa på olika sätt.

Klicka på vet sätt att förbättra hjärnans funktion

Växande bevis visar att det neuroinflammatoriska svaret är en nyckelkomponent i priondsjukdomar och bidrar till neurodegeneration.

Tullliknande receptorer (TLR) har föreslagits som viktiga mediatorer av medfödda immunsvar som utlöses i centrala nervsystemet i andra mänskliga neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom och amyotrofisk lateralskleros.

Lite är dock känt om rollen av TLR i prionsjukdomar, och deras inblandning i neuropatologin av naturlig scrapie har inte studerats. Vi utvärderade genuttrycket av får-TLR i fyra anatomiskt distinkta hjärnregioner hos naturliga scrapie-infekterade får och utvärderade de möjliga korrelationerna mellan genuttryck och de patologiska kännetecknen för prionsjukdom.

Vi observerade signifikanta förändringar i TLR-uttryck hos skrapie-infekterade får som korrelerar med graden av spongiosis, PrPSc-avsättning och glios i var och en av de studerade regionerna.

Anmärkningsvärt nog var TLR4 den enda genen som uppreglerades i alla regioner, oavsett svårighetsgraden av neuropatologi. I hippocampus observerade vi mildare neuropatologi associerad med distinkt TLR-genuttrycksprofil och närvaron av en märklig mikroglialmorfologi, kallad rodmicroglia, som beskrivs här för första gången i hjärnan hos skrapieinfekterade får.

Samtidigt av dessa egenskaper tyder på partiell neuroskydd av hippocampus. Slutligen avslöjade en jämförelse av fynden hos naturligt infekterade får kontra en överdimensionerad musmodell (tg338-möss) distinkta mönster av TLR-genuttryck.

Nyckelord: prion; skrapie; tollliknande receptorer; neuroinflammation; mikroglia; astrocyter.

1. Inledning

Överförbara spongiforma encefalopatier (TSE), eller prionsjukdomar, är en grupp av dödliga neurodegenerativa sjukdomar som inkluderar Creutzfeldt-Jakobs sjukdom (CJD) hos människor, skrapie hos får och getter, bovin spongiform encefalopati (BSE) hos nötkreatur och kroniska avfallssjukdomar hos nötkreatur. CWD).

Dessa TSE kännetecknas av omvandlingen av det värdkodade prionproteinet (PrPC) till en infektiös isoform, PrPSc, som företrädesvis ackumuleras i nervsystemet och lymforetikulära systemet (LRS), och en inflammatorisk immunreaktion i det centrala nervsystemet (CNS) [1 ,2].Prionsjukdomar, såsom scrapie, kan förvärvas naturligt genom oral exponering för PrPSc.

Efter att ha korsat tarmbarriären och genomgått primär replikation i lymfoida vävnader når PrPSc CNS via en process som kallas neuroinvasion. Infektionen sprider sig från ställen i mag-tarmkanalen via vagus och splanchnic nerver till hjärnans respektive ryggmärgen [3,4].

När PrPSc når CNS sprids från de kaudala torostrala regionerna, dvs via den rostrala hjärnstammen till cerebellum, diencephalon och frontalcortex [5]. Den anatomiskt stereotypa ansamlingen av PrPSc tyder på att dess spridning förmedlas av neuronal anslutning och/eller selektiv sårbarhet hos olika hjärnregioner.

Värdfaktorer såsom PrPSc-genotypen, rasen och åldern vid infektion bidrar till omfattningen av PrPSc-avsättningen och fördelningen av spongiforma lesioner.

Den molekylära grunden för värd-prion-interaktionerna som bestämmer den selektiva inriktningen av PrPSc till specifika hjärnregioner förblir dock okänd och utgör en av de mest spännande aspekterna av fenomenet prionstammar.

Ursprungligen antogs det att immunsystemet inte svarade på PrPSc på grund av naturlig tolerans, men tidsförloppsstudier avslöjade snabb aktivering och proliferation av mikroglia och astrocyter redan innan kliniska tecken och neuronal degeneration började [6-8].

Denna tidiga aktivering och spridning av mikroglia och astrocyter verkar spela en central roll i patogenesen av prionsjukdomar, även om de molekylära mekanismerna som är involverade i deras aktivering och den exakta rollen för både reaktiva astrocyter och mikroglia i sjukdomens patogenes förblir oklara [9,10].

Dessutom är det allmänt accepterat att mikroglia och astroglial distribution och fenotyp varierar mellan hjärnregioner och arter [11-14], vilket tillskriver inneboende egenskaper till varje region som påverkar sårbarheten för neurodegeneration [10,15,16].

Detta fenomen är särskilt uppenbart i det prekliniska skedet, under vilket både mikroglia och astroglia svarar på prioninfektion på ett regionspecifikt sätt.

Men allt eftersom sjukdomen fortskrider, börjar dock ett vanligare neuroinflammatoriskt svar att dominera, vilket späder ut de flesta av de regionala egenskaperna [17,18]. Under de senaste åren har rollen av Toll-like receptors (TLR) i mikroglial och astroglialreaktivitet rapporterats. i flera neurodegenerativa störningar, vilket understryker deras inflytande på utvecklingen av dessa sjukdomar [19-21].

Data om rollen av TLRsin prionsjukdomar är dock knappa. En delvis skyddande roll för TLRs har beskrivits inprionpatologi. Specifikt har det rapporterats att förlusten av TLR2 [22] och TLR4 [23] påskyndar prionpatogenesen, medan TLR9-stimulering bromsar sjukdomsprogression i musmodeller [24,25].

Hittills har de flesta studier av TLR i prionsjukdomar utförts in vitro eller med hjälp av musmodeller [8,22,26-29], och deras roll i naturligt infekterade djur och människor är fortfarande osäker. Såvitt vi vet utfördes en studie på nyfödda lamm oralt inokulerade med skrapie (dvs med användning av en naturlig, men inte naturligt infekterad värd) och rapporterade TLR2- och TLR4-överuttryck i blod i kliniska sjukdomsstadier [30].

Två studier har rapporterat förändrat TLR-genuttryck hos människor med sporadisk CJD (sCJD) [31,32]. Dysregleringen av gener involverade i immunsvaret inkluderade överuttrycket av TLR4 och TLR7 mRNA i lillhjärnan och frontala cortex hos sCJD MM1-patienter och av TLR7 i lillhjärnan hos sCJD VV2-patienter.

Dessutom har Areskeviciuteet al. [32] inkluderade TLR4 i de 40 bästa uppströmsregulatorerna som förutspåddes visa differentialexpression i sCJD kontra kontrollhjärnprover. Vi undersökte hur naturlig skrapieinfektion påverkar transkriptionsnivåerna av ovineTLRs och vissa cytokiner i fyra hjärnregioner med olika grader av prionkänslighet, baserat på tidigare resultat [18].

Kvantitativ PCR-analys (qPCR) avslöjade förändringar i ingen uttryck i den scrapie-infekterade gruppen jämfört med kontrollgruppen och ett hjärnregionsberoende svar.

Intressant nog visade hippocampus den mest distinkta lesionsprofilen, med specifik reaktiv mikroglia-morfologi och TLR-transkriptionsmönster. Med tanke på bristen på experimentella data om TLR-genuttryck hos möss som överuttrycker får PrP, utförde vi också experiment med tg338-möss intracerebralt inokulerade med skrapie.

Våra resultat avslöjar vissa likheter med tidigare studier med vildtypsmöss, men betydande skillnader när det gäller fynden i naturlig scrapie.

2. Resultat

2.1. Scrapie-neuropatologi hos naturligt infekterade får

Vi bekräftade först scrapie-neuropatologin hos de naturligt infekterade fåren som ingår i denna studie, som tidigare beskrivits [33-36]. Spongiosis, PrPSc-deposition och reactiveglia undersöktes i fyra regioner av de infekterade och kontrollfårshjärnorna: medullaoblongata (Mo), thalamus (Th), hippocampus (Hc) och frontal cortex (Fc).

Alla naturligt infekterade djur var i det kliniska stadiet av sjukdomen. Den kliniska statusen, baserad på frekvensen och svårighetsgraden av de kliniska tecknen, varierade dock mellan får, allt från begynnande till avancerade kliniska stadier (tabell 1).

Figur 1 visar representativa mikrofotografier för bedömning av vakuolering och immunfärgning för PrPSc, GFAP och Ibal, tagna i var och en av de utvalda regionerna hos infekterade och kontrolldjur.

Som väntat upptäcktes inga tecken på vakuolering eller PrPSc-avsättning i vävnadssnitt från kontrollfåret. Omvänt, hos de skrapieinfekterade fåren visade allneuroanatomiska områden spongios, PrPSc-avsättning och reaktiv glia (p < 0.05).

Intensiteten av vakuolation, PrPSc-avsättning och glios minskade från medulla oblongata till frontal cortex. Intressant nog, trots närheten till thalamus och hippocampus, observerades signifikanta skillnader i poängen för alla patologiska markörer.

Den största graden av spongios observerades i medulla oblongata och thethalamus, i motsats till den mycket spridda vakuolation som finns i hippocampus och frontal cortex.

Intraneuronal vakuolering var riklig i kärnorna medulla oblongata, vilket visas i den dorsala motorkärnan i vagusnerven, medan neuropil spongiosis dominerade i thalamus och frontala cortex (Figur 1A). Mycket få vakuoler hittades i neuropilen i hippocampus.

Figur 1. Representativ neuropatologi och immunhistokemisk bedömning av spongios, PrPScdeposition, mikroglios och astroglios i CNS hos kontroll- och scrapie-infekterade får i themedulla oblongata (Mo), thalamus (Th), hippocampus (Hc) och frontal cortex (Fc) .

Grafer visar semi-kvantitativa bedömningsvärden för varje analyserad parameter. (A) Hematoxylin-eosinfärgning visade spongiosförändringar i CNS från skrapieinfekterade får och en frånvaro av spongioskontrollfår. (B) Detektion av PrPSc med L42-antikropp i scrapie-infekterade fårhjärnregioner.

Noimmunmärkning påvisades i kontrollgruppen. (C) Immunfärgning av joniserad kalciumbindande adaptermolekyl-1(Iba1) visade ökad mikroglialreaktivitet hos skrapieinfekterade kontra kontrollfår.

(D) Immunfärgning av glialfibrillärt surt protein (GFAP) som visar ökad reaktiv astrogliosisin-skrapieinfekterad får jämfört med kontrollfår. (E) Statistiska jämförelser av spongiosis, PrPScdeposition, Iba1 och GFAP-intensitet mellan hjärnregioner.

Poäng varierar från 0 (negativ) till 5 (maximal intensitet). Signifikanta skillnader i spongiosis, PrPSc, Iba1 och GFAP bestämdes med hjälp av Students t-test eller Mann–Whitney U-test för normal- respektive icke-normalfördelade data.

Statistiska skillnader mellan hjärnområden bestämdes med hjälp av envägsvariansanalys (ANOVA) eller Kruskal-Wallis-testet för normal- respektive icke-normalfördelade data. * p < 0.05, ** p < 0,01. Skalstång=200 µm.

Alla scrapie-infekterade får visade utbredd PrPSc-ackumulering i de fyra CNS-regionerna som analyserades, förutom tre får som visade begynnande kliniska tecken och var PrPSc-negativa genom immunhistokemi (IHC) och Western blot (WB) fynd i frontal cortex (tabell 1).

Intensiteten av PrPSc-immunfärgning avslöjade en caudal till rostral-minskning, liknande den som observerats för spongiosis, med maximal intensitet i medullaoblongata och thalamus, de två regionerna med den största graden av vakuolation och lägre intensitet i hippocampus och frontal cortex (Figur 1B).

I hippocampus visade PrPScimmunofärgning en fokal och ojämn fördelning, i motsats till det homogena, spridda punktformiga mönstret som observerades i frontala cortexsektioner.

Vi observerade fyra större morfologiska mönster av PrPSc-avsättning, som tidigare beskrivits [36]: två intracellulära mönster, som inkluderade intraneuronal och intraglial (inklusive intra-astrocytisk och intramikroglial) deposition, och två cellmembran/extracellulära mönster, som inkluderade neuropil-associerade och gliacell- tillhörande deponering (Figur S1).

De intraneuronala och neuropilassocierade mönstren dominerade i alla hjärnområden. Anmärkningsvärt nog var djuptrycks- och glialmönstren drastiskt reducerade eller till och med frånvarande i frontala cortex och hippocampus jämfört med medulla oblongata och thalamus. Parallellt med IHC analyserade vi närvaron av proteasresistenta prioner (PrPres) av WB.

Hjärnproverna från skrapieinfekterade får visade det klassiska trebandiga PrPres-mönstret associerat med klassisk skrapie, med en molekylmassa av det icke-glykosylerade fragmentet på cirka 19 kDa (Figur 2).

Trots en viss grad av variation ökade PrPres-signalen med svårighetsgraden av de kliniska tecknen i alla hjärnregioner och var rikligare i kaudala hjärnområden.

WB för PrPres var positiv i medulla oblongata och thalamus hos alla scrapie-infekterade får. Däremot var proverna från hippocampus och frontala cortex inte positiva för PrPres hos alla infekterade djur.

Även om IHC var positivt för PrPres i hippocampus hos alla infekterade får, var 4/13 negativa av WB. I frontala cortex var 3/13 av fåren PrPres-negativa av IHC och 4/13 var PrPres-negativa av WB.

Förutom vakuolering och PrPSc-avsättning, har aktiveringen av gliaceller dokumenterats omfattande som en tidig händelse i patogenesen av proteinfelveckningssjukdomar.

För att karakterisera den reaktiva glia, utsattes alla hjärnområden för IHC med användning av anti-GFAP-antikroppar för att detektera astrocyter och anti-Iba1-antikroppar för att detektera mikroglia.

Iba1-immunfärgning, som detekterar både vilande och aktiverade mikroglia [37], ökade signifikant i alla hjärnregioner hos scrapie-infekterade kontra kontrollfår och visade markanta skillnader i mikroglialmorfologin bland hjärnregioner hos infekterade djur (Figur 1C).

Aktiveringsstatusen för mikrogliacellerna definieras baserat på tre huvudmorfologier: förgrenad, hypertrofisk och ameboid [38,39]. Mikrogliaceller i det "övervakande" eller relativt inaktiva tillståndet har en förgrenad morfologi, kännetecknad av en liten cellkropp med många fina processer, som observerats hos våra kontrolldjur.

Det aktiva tillståndet kännetecknas av en ameboid-morfologi, som vanligtvis förknippas med det fagocytiska tillståndet [38] och består av sfäriska, icke-förgrenade cellkroppar. Den hypertrofiska morfologin kännetecknas av mikroglia med en större cellkropp och kortare, tjocka processer, och är associerad med produktion och frisättning av inflammatoriska mediatorer [40,41].

Ameboidmorfologin var den vanligaste hos medulla oblongata av skrapieinfekterade får. I thalamus observerades ameboidmorfologin men dominerade inte: en mängd stora och tunna processer blandade med glesa, tjocka processer som härrör från långsträckta cellkroppar, motsvarande hypertrofiska mikroglia.

Morfologin för de proliferativa mikroglia i frontal cortex och hippocampus skilde sig markant från den för medulla oblongata och thalamus. I båda regionerna dominerade hypertrofiermikroglia och ameboidmikroglia var praktiskt taget frånvarande.

Anmärkningsvärt nog visade Cornu Ammonis 3 (CA3)-regionen i hippocampus de största skillnaderna mellan mikrogliamorfologi, uppvisande ett mikrogliamönster känt som stavmikrogliathat som inte observerades i någon annan hjärnregion.

Dessa markanta skillnader som observerades i bedömningen av hippocampus fick oss att utföra en detaljerad undersökning av subfälten CA1, 3, 4 och stratum lacunose-molecular (SLM).

Figur 2. Western blot-detektion av PrPres i CNS hos kontroll- och naturliga scrapie-infekterade får. Lika proteinmängder laddades för adekvat jämförelse, och immunoblots kördes med SHA31 monoklonal antikropp för analys av prover från (A) medulla oblongata, (B) ) thalamus, (C) hippocampus och (D) frontal cortex från scrapie-infekterade får med begynnande kliniska tecken (prov 1–5) och med avancerade kliniska tecken (prov 6–13). Rad 14 visar den negativa kontrollen och rad 15 ett prov av icke-infekterat fårhjärnhomogenat som inte utsatts för pK-nedbrytning.

GFAP-immunfärgning avslöjade markant astroglios hos scrapie-infekterade kontra kontrollfår (Figur 1D). Morfologiskt visade astrocyterna från infekterade får konsekvent hypertrofiska cellkroppar och processer, vilket bekräftar närvaron av reaktiv astroglios, medan kontrollfår uppvisade den typiska stjärnmorfologin för det icke-aktiverade tillståndet.

I medulla oblongata och thalamus var GFAP-immunfärgning mer intensiv, med uppkomsten av astrocytnätverk på grund av överlappande processer. I hippocampus och frontala cortex var astrocyterna jämnt fördelade, med närvaron av isolerade hypertrofiska stjärnkroppar.

For more information:1950477648nn@gmail.com