Dubbla modulerande effekter av diosmin på kalciumoxalat njurstensbildningsprocesser: Kristallisering, tillväxt, aggregation, kristallcellsvidhäftning, internalisering i njurrörsceller och invasion genom extracellulär matris
Mar 16, 2022
för mer information:ali.ma@wecistanche.com
Supaporn Khamchuna,b,c,1, Sunisa Yoodeea,1, Visith Thongboonkerda,*
aMedical Proteomics Unit, Office for Research and Development, Faculty of Medicine Siriraj Hospital, Mahidol University, Bangkok 10700, Thailand
bInstitutionen för medicinsk teknik, School of Allied Health Sciences, University of Phayao, Phayao 56000, Thailand
cUnit of Excellence in Integrative Molecular Biomedicine, School of Allied Health Sciences, University of Phayao, Phayao 56000, Thailand
Nyckelord: Bioaktiv förening, Flavonoid, Inhibitor, Modulator, Nephrolithiasis, Promoter, Urolithiasis
ABSTRAKT
Diosminär en naturlig flavonglykosid (bioflavonoid) som finns i frukt och växter med flera farmakologiska aktiviteter. Det har använts i stor utsträckning som kosttillskott eller terapeutiskt medel vid olika sjukdomar/störningar. Även om det rekommenderas, bevis på dess skyddande mekanismer motnjurestensjukdom (nephrolithiasis/urolithiasis), särskilt kalciumoxalat (CaOx) monohydrat (COM), som är den vanligaste typen, förblev oklart. I denna studie har vi alltså systematiskt utvärderat effekterna avdiosmin(vid 2,5–160 nM) på olika stadier avnjurestenbildningsprocesser, inklusive COM-kristallisation, kristalltillväxt, aggregering, kristallcelladhesion, internalisering i njurrörsceller och invasion genom extracellulär matris (ECM). Resultaten visade detdiosminhade dosberoende modulerande effekter på alla nämnda COM-njurstensprocesser.Diosminökade signifikant COM-kristallantal och massa under kristallisation, men minskade kristallstorlek och tillväxt. Medandiosminfrämjade kristallaggregering, det hämmade kristallcellsadhesion och internalisering i njurrörsceller. Slutligen främjade diosmin kristallinvasion genom ECM. Våra data ger bevis som visar både hämmande och främjande effekter av diosmin på COMnjurestenbildningsprocesser. Baserat på dessa dubbelmodulerande aktiviteter av diosmin är dess anti-urolitiasis-roll tveksam och försiktighet bör vidtas för dess användning injurestensjukdom.
1. Introduktion
Diosmin(3′,5,7-trihydroxi-4′-metoxiflavon-7-rhamnoglukosid) är en naturlig bioflavonoid som vanligen finns i olika växter och frukter, främst Citrus spp. [1,2]. Det kan syntetiseras eller härledas från den andra flavonoiden, hesperidin [1,2]. Diosmin ensamt eller i kombination med hesperidin används i stor utsträckning som ett flebotropiskt läkemedel för behandling av venösa och lymfatiska störningar såsom kronisk venös insufficiens och hemorrojder [3,4]. Dessutom uppvisar diosmin flera andra biologiska och farmakologiska aktiviteter, inklusive antioxidant- och antiinflammatoriska aktiviteter [5,6], anti-mutagena och antineoplastiska egenskaper [7,8], antibiotiska effekter [9], antihyperglykemiska egenskaper [ 10], och skyddande effekter mot skador på flera organ, dvs.
kardiovaskulär [11], retinal [12],njure, lever- och hjärnskada [13].
Njurestensjukdom (eller nefrolithiasis/urolithiasis) orsakas av den fasta stenstenen som utvecklats och deponeras inuti njuren och drabbar människor i alla delar av världen med en hög återfallsfrekvens [14–17]. Bland alla olika orsakande kristaller är kalciumoxalat (CaOx), särskilt monohydratform (COM), den mest patogena och vanligaste kristallina komponenten som finns i stenbildarna (patienter med njursten) [18]. Mekanistiskt har COM-kristaller den mest potenta vidhäftningsförmågan och de flesta cytotoxiska effekterna på njurtubulära epitelceller [19,20]. Under stenpatogenesen har både Randalls plackmodell och intratubulära hypotes gemensamma drag för COM-stenbildningsprocesserna, inklusive COM-kristallisering, tillväxt, aggregering, retention genom ytvidhäftning på njurrörsceller eller njurbäcken, internalisering i cellerna och invasion i cellerna. renalt interstitium genom extracellulär matris (ECM) [21,22].
På senare tid har många studier fokuserat på läkemedelsupptäckten med hjälp av medicinalväxter/frukter och deras bioaktiva föreningar i syfte att förhindra ny och/eller återkommande stenbildning. Ett antal tidigare rapporter har visat att vissa bioaktiva föreningar, särskilt fenolföreningar (polyfenol, flavonoid, flavonglykosid, etc.) utvunna från flera medicinalväxter/frukter, har förebyggande effekter mot de patogena mekanismerna hosnjurestensjukdom både in vitro och in vivo [23–25]. Bland dessa fördelaktiga ämnen har några rapporter föreslagit att diosmin kan förhindra avsättning av CaOx-kristaller inuti njurvävnad i djurmodeller [26,27]. Dess exakta modulerande roll (hämning eller främjande) och mekanismer (stadier eller stenbildningsprocesser) i COM-njurstensbildning hade dock inte undersökts. Den föreliggande studien utvärderade således systematiskt effekterna avdiosmin(vid 2,5–160 nM) på olika stadier avnjurestenbildningsprocesser, inklusive kristallisering, kristalltillväxt, aggregering, kristallcelladhesion, internalisering i njurrörsceller och invasion genom ECM.
Klicka tillCistanche tubulosa dosering för njurfunktion
2. Material och metoder
2.1. Diosminberedning
Diosmin(Tokyo Chemical Industry; Tokyo, Japan) löstes med 100 procent dimetylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) och arbetsalikvoter gjordes vid slutkoncentrationerna 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 och 160 nM för att undersöka dess effekter på COM-kristaller. Dessutom användes 100 procent DMSO som negativ kontroll i alla experiment.
2.2. Cell kultur
MDCK renal tubulär epitelcellinje härledd från distalt tubulärt segment av nefronen (ATCC; Manassas, VA) förökades i Eagle's minimum essential medium (MEM) (Gibco; Grand Island, NY) kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum (FBS), 60 U/ml penicillin G (Sigma-Aldrich) och 60 ug/ml streptomycin (Sigma-Aldrich). Cellerna hölls i en fuktad inkubator med 5 procent CO2 vid 37 ◦C.
2.3. COM-kristallisationsanalys
COM-kristallisering utfördes som beskrivits tidigare [28,29]. Kortfattat tillsattes 500 ul 10 mM CaCl2⋅2H2O i kristallisationsbuffert (innehållande 10 mM Tris-HCl och 90 mM NaCl) (pH 7,4) till varje brunn på 24-brunnsplattan (Corning Inc.; Corning, NY). En lika stor volym (4 ul) kristallisationsbuffert (blankkontroll), DMSO (negativ kontroll) ellerdiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 eller 160 nM) blandades med CaCl2. Slutligen tillsattes sedan 500 ul 1,0 mM Na2C2O4 i kristallisationsbufferten för att göra slutkoncentrationerna av CaCl2 och Na2C2O4 till 5 mM respektive 0,5 mM. Blandningen inkuberades vid 25 ◦C under 1 timme och undersöktes sedan. Kristallbilder togs slumpmässigt från minst 15 högeffektfält (HPF) under Nikon Eclipse Ti-S inverterat faskontrastljusmikroskop (Nikon; Tokyo, Japan). Kristallstorlek och antal mättes från minst 15 HPF för varje prov med NIS Element D-programvara version 4.11 (Nikon). Kristallmassan beräknades från minst 100 kristaller i 15 HPF med följande formel: Kristallmassa (µm2/HPF)=Genomsnittlig kristallstorlek i varje fält (µm2) × Antal kristaller i varje fält (/HPF) ( 1)
2.4. COM-kristalltillväxtanalys
Kristalltillväxtanalys utfördes som beskrivits tidigare [30,31].
Kortfattat blandades en lika stor volym (500 ul) av 10 mM CaCl2⋅2H2O och 1,0 mM Na2C2O4 i kristallisationsbuffert (1:1) (v/v) i varje brunn i { {12}}brunnsplatta. Blandningen inkuberades vid 25 ◦C under 1 timme för att tillåta fullständig kristallisation. Vid denna punkt (T0), en lika stor volym (4 ul) kristallisationsbuffert (blankkontroll), DMSO (negativ kontroll) ellerdiosmin(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 eller 160 nM) sattes till varje brunn och blandningen inkuberades ytterligare under 60 minuter (T60). Vid T0 och T60 togs kristallbilder slumpmässigt från minst 15 HPFs under Nikon Eclipse Ti-S inverterat faskontrastljusmikroskop. Kristallstorlekar vid T0 och T60 mättes med NIS Element D mjukvaruversion 4.11 (Nikon), medan kristalltillväxt (representerad av Δ Kristallstorlek) beräknades från minst 100 kristaller i 15 HPF med följande formel: Δ Kristallstorlek (µm2)=Kristallstorlek vid T60 − Kristallstorlek vid T0 (2)
2.5. COM-kristallaggregationsanalys
Kristallaggregationsanalys utfördes som beskrivits tidigare [32,33]. COM-kristaller genererades som nämnts ovan i kristalltillväxtanalysen men med en större volym i ett 50-ml koniskt rör (Corning Inc.) och skördades sedan genom centrifugering vid 2000 g under 5 min. Supernatanten kasserades, medan COM-kristaller tvättades tre gånger med metanol. Efter ytterligare en centrifugering vid 2000 g under 5 minuter kasserades metanol och kristallerna lufttorkades över natten vid 25 ◦C. COM-kristaller (1000 µg torrvikt) återsuspenderades i 1 ml kristallisationsbuffert i varje brunn på 6-brunnsplattan (Corning Inc.). En lika stor volym (4 ul) kristallisationsbuffert (blankkontroll), DMSO (negativ kontroll) ellerdiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 eller 160 nM) sattes till COM-kristallsuspensionen i varje brunn. Plattan skakades kontinuerligt i en skakande inkubator (Zhicheng; Shanghai, Kina) vid 150 rpm och 25 ◦C under 1 timme. Därefter undersöktes bildandet av COM-kristallaggregat (definierat som "en sammansättning av tre eller flera individuella COM-kristaller som tätt sammanfogade" [32]) och avbildades under Nikon Eclipse Ti-S inverterat faskontrastljusmikroskop. Antalet COM-kristallaggregat räknades från minst 15 slumpmässiga HPF:er per brunn.
2.6. COM-kristallcellvidhäftningsanalys
Kristallcelladhesionsanalys utfördes som beskrivits tidigare [34,35]. Kortfattat genererades COM-kristaller som nämnts ovan i ett 50-ml koniskt rör och skördades sedan genom centrifugering vid 2000 g under 5 min. Supernatanten kasserades, medan COM-kristaller tvättades tre gånger med metanol. Efter ytterligare en centrifugering vid 2000 g under 5 minuter kasserades metanol och kristallerna lufttorkades över natten vid 25 ◦C. Kristallerna dekontaminerades med UV-ljusstrålning under 30 minuter innan ingrepp med cellerna.
MDCK-celler (vid en densitet av 2 × 105 celler/brunn) såddes och odlades i varje brunn på 6-brunnsplattan (Corning Inc.) under 48 timmar för att erhålla sammanflytande monolager. Odlingsmediet uppdaterades sedan innan COM-kristaller tillsattes (100 µg torrviktskristaller per ml odlingsmedium). En lika stor volym (4 ul) kristallisationsbuffert (blankkontroll), DMSO (negativ kontroll) ellerdiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 eller 160 nM) tillsattes till varje brunn. Cellerna inkuberades ytterligare i en fuktad inkubator med 5 procent CO2 vid 37 ◦C under 1 timme. Därefter tvättades cellerna kraftigt med PBS fem gånger och avbildades under Nikon Eclipse Ti-S inverterat faskontrastljusmikroskop. Antalet av de återstående COM-kristallerna vidhäftade på njurens tubulära cellyta räknades från minst 15 slumpmässiga fält per brunn.
Cistanche för njurfunktion
2.7. COM-kristallinternaliseringsanalys
De fluorescensmärkta COM-kristallerna genererades som beskrivits tidigare [36,37]. Sammansättningar/koncentrationer av kemikalier som användes för kristallisation var desamma som nämnts ovan för de vanliga (icke-märkta) kristallerna, men 0,1 µg/ml fluorescein-isotiocyanat (FITC) (Thermo Scientific Pierce; Rockford, IL) var tillsätts till CaCl2⋅2H2O-lösning innan den blandas med Na2C2O4. De efterföljande stegen (kristallisation och skörd) utfördes som nämnts ovan, men i mörker.
För att utvärdera kristallinternalisering i renala tubulära epitelceller, såddes MDCK-celler (med en täthet av 2 × 105 celler/brunn) och odlades i varje brunn på 6-brunnsplattan (Corning Inc.) under 48 timmar för att erhålla sammanflytande monolager. Cellmonoskiktet inkuberades med FITC-märkta COM-kristaller (1000 µg kristall/ml medium) i en fuktad inkubator med 5 procent CO2 vid 37 ◦C under 1 timme. Därefter tvättades cellerna med PBS och inkuberades med trypsin-EDTA-lösning för att eliminera icke-internaliserade (både vidhäftande och icke-vidhäftande) kristaller. Procentandelen av cellerna med internaliserade kristaller kvantifierades från totalt 10 000 förvärvade händelser med hjälp av en flödescytometer (BD Accuri C6) (BD Biosciences, San Jose, CA). Cellerna inkuberade med vanliga (omärkta) COM-kristaller användes för att förinställa bruset och tröskeln för den positiva fluorescenssignalen. Cellerna med positiva fluorescenssignaler räknades sedan och användes för sådan procentuell beräkning.
2.8. COM-kristallinvasion genom ECM-analys
COM-kristaller framställdes såsom beskrivits ovan för kristallaggregering och kristall-celladhesionsanalyser. Kristallinvasion analys utfördes enligt protokoll etablerat tidigare [38,39]. Kortfattat, totalt 20 µg COM-kristaller belagda med kristallisationsbuffert (blank kontroll), DMSO (negativ kontroll), albumin (Sigma-Aldrich) (positiv kontroll) ellerdiosmin(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 eller 160 nM) tillsattes till 200 ul MEM. Därefter blandades 200 ul av 0,3 pM Lys-plasminogen (Fitzgerald Industries international; Acton, MA) i PBS och inkuberades med kristall-proteinkomplexet vid 37 ◦C under 1 timme. Det obundna plasminogenet kasserades genom centrifugering vid 2000 g under 5 minuter och pelleten tvättades med PBS en gång. Därefter blandades 100 ul av 0,15 pM urokinasplasminogenaktivator (uPA) (Fitzgerald Industries International) i PBS med kristall-protein-plasminogen/plasmin-komplexet. Blandningen tillsattes sedan ovanpå matrisgelen inuti ECM-migreringskammaren och inkuberades vid 37 ◦C. Efter 24-h inkubation avlägsnades lösningen kvar på den övre delen av migreringskammaren med hjälp av en gasväv eller silkespapper. De invaderade COM-kristallerna inuti matrisgelen avbildades sedan med ett ljusmikroskop med differentiell interferenskontrast (DIC) läge (Nikon H600L). Kristallinvasionsavståndet mättes och medelvärdet beräknades från minst 15 lågeffektfält (LPF) inom samma kammare med hjälp av NIS Element D-programvaruversion 4.11 (Nikon).
2.9. Statistisk analys
Alla ovanstående experiment utfördes i tre exemplar (tre oberoende experiment) och de kvantitativa data rapporteras som medelvärde ± SEM. Flera jämförelser utfördes med användning av envägsvariansanalys (ANOVA) med Tukeys post-hoc-test. Pearson korrelationstest utfördes för att fastställa sambandet mellan variabler. Alla statistiska analyser gjordes med hjälp av SPSS-mjukvara (version 18) (IBM SPSS; Armonk, NY). P-värde mindre än 0.05 ansågs vara statistiskt signifikant.
3. Resultat
3.1. Effekt av diosmin på COM-kristallisation
Kristallisering är ett av de viktigaste tidiga stegen injurestenbildningsprocesser av alla slag. Efter 1-h kristallisering med eller utandiosminvid olika koncentrationer (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 eller 160 nM), mättes COM-kristallstorlek och antal och kristallmassan beräknades. Kristallisationsbuffert och utspädningsmedlet DMSO fungerade som blank respektive negativ kontroll. Data visade att alla doser (2,5–160 nM) av disomin minskade signifikant kristallstorleken men ökade kristallantal på ett dosberoende sätt jämfört med blanka och negativa kontroller (Fig. 1A–1C). I enlighet med kristalltalet ökade kristallmassan dosberoende (Fig. 1D). Sammantaget indikerar dessa data att diosmin främjar COM-kristallisation (neokristaller).
3.2. Effekt av diosmin på COM-kristalltillväxt
Den modulerande effekten avdiosminpå COM utvärderades kristalltillväxt genom att mäta förändring i kristallstorlek (Δ Kristallstorlek) efter 60-min ytterligare inkubation efter fullbordandet av det initiala kristalliseringssteget, när neokristaller var frånvarande. Resultaten visade att alla doser (2,5–160 nM) av disomin signifikant reducerade Δ-kristallstorleken på ett dosberoende sätt jämfört med de tomma och negativa kontrollerna (Fig. 2). Dessa fynd indikerar att diosmin hämmar COM-kristalltillväxt.
3.3. Effekt av diosmin på COM-kristallaggregation
Förutom kristalltillväxt är aggregering av enskilda kristaller som fäster tätt tillsammans ett annat viktigt steg undernjuresten patogenes. Den höga graden av kristallaggregation kan i slutändan leda till stenförstoring och obstruktion av små njurrörformiga lumen. Jämföra med tomma och negativa kontroller,diosminvid 10–160 nM dosberoende ökat antal COM-kristallaggregat (Fig. 3). Dessa resultat indikerar att diosmin främjar COM-kristallaggregation.
Cistanche för njurfunktion
3.4. Effekt av diosmin på COM-kristallcellvidhäftning
Retention av de orsakande kristallerna är ett av de avgörande stegen förnjurestenbildning och kan induceras av kristall-cellvidhäftning som förhindrar att kristallerna stöter ut tillsammans med urinutflödet. Vi utvärderade således den modulerande aktiviteten avdiosminpå COM-kristallcellvidhäftning. Data avslöjade att diosmin vid 5–160 nM signifikant minskade vidhäftningsförmågan hos COM-kristaller på renala tubulära celler på ett dosberoende sätt jämfört med blanka och negativa kontroller (Fig. 4). Dessa data indikerar att diosmin hämmar COM-kristall-celladhesion.
3.5. Effekt av diosmin på COM-kristallinternalisering i njurrörsceller
Efter vidhäftning kan vissa COM-kristaller internaliseras i njurens tubulära celler och orsaka flera efterföljande cellulära svar [37,40]. Kristallinternalisering utvärderades genom att använda FITC-märkta COM-kristaller och kvantifierades med flödescytometri. Vanliga COM-kristaller (utan märkning) användes för att subtrahera tekniskt brus och för att säkerställa att fluorescensintensiteten kom från FITC-signalen. Jämfört med blanka och negativa kontroller minskade procentandelen av cellerna med internaliserade kristaller signifikant meddiosminvid 10–160 nM på ett dosberoende sätt (Fig. 5). Fynden indikerar att disomin hämmar COM-kristallinternalisering i njurrörsceller.
3.6. Effekt av diosmin på COM-kristallinvasion genom ECM
Kristallinvasion genom ECM är en patogen/destruktiv process undernjurestenpatogenes som kan utlösa olika inflammatoriska reaktioner och kaskader och därigenom förvärra sjukdomsmekanismerna. Vi undersökte detta fenomen genom att använda ett etablerat protokoll baserat på plasminogen-plasminaktiviteten hos kristall-proteinkomplexet [38,39]. Resultaten visade att alla doser av disomin (2,5–160 nM) signifikant förbättrade COM-kristallinvasion genom ECM på ett dosberoende sätt (Fig. 6). Intressant,diosminvid 160 nM skulle kunna främja COM-kristallinvasion jämförbar med albumin, som är den kända potenta promotorn för COM-kristallinvasion [41] (Fig. 6). Dessa resultat indikerar att diosmin starkt främjar COM-kristallinvasion genom ECM.
Fig. 1. Effekt avdiosminpå COM-kristallisation. Kristallisationsanalys utfördes med en lika stor volym (4 ul) kristallisationsbuffert (blankkontroll), DMSO (negativ kontroll) eller diosmin (2,5–160 nM). (A): Kristallmorfologi i varje tillstånd efter 1-h kristallisation. Ursprunglig förstoring var 400× för alla paneler. (B): Kristallstorlek. (C): Kristallnummer. (D): Kristallmassa (se formel 1 i "Material och metoder") analyserades från minst 100 kristaller i 15 HPF. Varje stapel representerar medelvärde ±SEM av data härledda från 3 oberoende experiment. *=sid< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" dmso.="">
Fig. 2. Effekt avdiosminpå COM-kristalltillväxt. Kristalltillväxtanalys utfördes efter att kristalliseringen var klar (för att förhindra nykristallisering) med en lika stor volym (4 ul) kristalliseringsbuffert (blankkontroll), DMSO (negativ kontroll) eller diosmin (2,5–160nM). (A): Kristallmorfologi i varje tillstånd vid T0 och T60. Ursprunglig förstoring var 400 × för alla paneler. (B)-(J): Histogram av kristallstorlekar mätta från individuella kristaller vid TO och T60 i varje grupp. (K): Δ Kristallstorlek (se formel 2 i "Material och metoder") analyserades från minst 100 kristaller i 15 HPF. Varje stapel representerar medelvärde ± SEM för data härledda från 3 oberoende experiment. *= p < 0,05="" vs.="" tom="" kontroll;="" #="p">< 0,05="" vs.="">
Fig. 3. Effekt avdiosminpå COM-kristallaggregation. Kristallaggregationsanalys utfördes med en lika stor volym (4 ul) kristallisationsbuffert (blankkontroll), DMSO (negativ kontroll) eller diosmin (2,5–160 nM). (A): Mikrobilder av de aggregerade COM-kristallerna (märkta med prickade cirklar). Ursprunglig förstoring var 400 × för alla paneler. (B): Antalet kristallaggregat räknades från minst 15 slumpmässiga HPF:er i varje brunn. Varje stapel representerar medelvärde ± SEM för data härledda från 3 oberoende experiment. *=sid< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="" dmso.="">
Fig. 4. Effekt avdiosminpå COM-kristallcellvidhäftning. Kristallcellvidhäftningsanalys utfördes med en lika stor volym (4 ul) kristallisationsbuffert (blankkontroll), DMSO (negativ kontroll) eller diosmin (2,5–160 nM). (A): Mikrofotografier av de återstående kristallerna som fastnade tätt på cellmonoskiktet efter att de obundna kristallerna avlägsnats genom kraftiga tvättningar med PBS. Ursprunglig förstoring var 200 × för alla paneler. (B): Antalet vidhäftade kristaller räknades från minst 15 slumpmässiga fält i varje brunn. Varje stapel representerar medelvärde ±SEM av data härledda från 3 oberoende experiment. *= sid<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p"><0.05 vs.="">
Fig. 5. Effekt avdiosminpå COM-kristallinternalisering i njurrörsceller. Kristallinternaliseringsanalys utfördes med användning av FITC-märkta COM-kristaller (FITC-COM), medan de vanliga (icke-märkta) COM-kristallerna användes för subtraktion av bakgrund/brus. Analysen utfördes med en lika stor volym (4 ul) kristallisationsbuffert (blank kontroll), DMSO (negativ kontroll) eller diosmin (2,5–160nM). (A): Flödescytometrisk dot-plot-analys av storlek (y-axel) och FITC-fluorescensintensitet (x-axel) av cellerna efter avlägsnande av icke-internaliserade kristaller med 0,1 procent trypsin/2,5 mM EDTA. (B): Andel av cellerna med internaliserade FITC-märkta COM-kristaller. Varje stapel representerar medelvärde ± SEM för data härledda från 3 oberoende experiment. *= sid<0.05 vs.="" fitc-com="" +="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" fitc-com="" +="" dmso.="">
Fig. 6. Effekt avdiosminom COM-kristallinvasion genom ECM. Kristallinvasion genom ECM-analys utfördes med användning av COM-kristaller belagda med kristalliseringsbuffert (blank kontroll), DMSO (negativ kontroll), albumin (positiv kontroll) eller diosmin (2,5–160 nM). (A): Mikrobilder av COM-kristallerna invaderade eller migrerade genom ECM-migreringskammaren. Ursprunglig förstoring var 100 × för alla paneler. (B): Kristallinvasionsavstånd mättes från minst 15 slumpmässiga LPF i varje kammare. Varje stapel representerar medelvärde ±SEM av data härledda från 3 oberoende experiment. *= sid<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="">
4. Diskussion
Njurstenssjukdom orsakas av bildning av stenar inutinjureoch pelvocalycealsystemet. Vanliga njurstensbildningsprocesser inkluderar COM-kristallisering, tillväxt, aggregation, retention genom kristallcelladhesion och invasion genom njurinterstitium rik på ECM [21,22]. Det finns flera försök att förhindra denna sjukdom med hjälp av en mängd olika mediciner och/eller kosttillskott. Många rader av nya bevis har rapporterat att flavonoider, flavonglykosider och andra föreningar extraherade från citrusfrukter kan ha förebyggande effekter på njurstenssjukdom och andra störningar [23–25]. Bland dessa,diosmin, ett naturligt derivat av flavonglykosid och hesperidin som huvudsakligen finns i citrusfrukter [1,2], har föreslagits spela en förebyggande roll mot skador och skador pånjurevävnad [13,42]. Dessutom har dess anti-urolitiasis roll rapporterats i några tidigare studier med djurmodeller [26,27]. Ändå förblev de fördelaktiga effekterna och underliggande mekanismerna av diosmin i förebyggande av njursten disig. Vi undersökte således den modulerande aktiviteten av diosmin på COM-kristaller. De systematiska analyserna gjordes på olika stadier av COMnjurestenbildning, inklusive kristallisering, kristalltillväxt, aggregering, kristallcellsadhesion, internalisering i njurrörsceller och invasion genom ECM.
Efter oralt intag avdiosmin, varierar dess plasmanivå hos människor från {{0}},5 till 200 ng/ml (eller 0,8–300 nM) [43,44]. Den maximala plasmakoncentrationen (Cmax) är cirka 50 ng/ml (eller 85 nM) [43,44]. Därför var doserna av diosmin som användes i vår nuvarande studie (2,5–160 nM) i det farmakologiskt relevanta intervallet för dess farmakokinetik. Eftersom DMSO användes som spädningsmedel för att helt lösa upp diosmin enligt rekommendation, användes DMSO som negativ kontroll i denna studie utöver blankkontrollen för att säkerställa att det inte fanns några effekter från själva spädningsmedlet som skulle kunna störa datatolkningen. I alla analyser visade data att det inte observerades några signifikanta effekter från DMSO och alla kvantitativa data som härrörde från den negativa kontrollen var jämförbara med de från blankkontrollen.
COM-kristallisationsanalys visade att alla koncentrationer avdiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 och 160 nM) skulle kunna minska COM-kristallstorleken, men å andra sidan ökade antalet kristaller. Eftersom kristallmassa är slutprodukten av både kristallstorlek och antal och är mer relevant för att återspegla graden av COM-kristallisering, utvärderade vi sedan om diosmin påverkade detta kristallindex. Data visade att alla koncentrationer av diosmin hade den främjande effekten på COM-kristallmassa, i överensstämmelse med data om kristallantal. Efter kristallisering kan COM-kristaller växa ytterligare till den större storleken för nästa stegnjurestenbildning.
I motsats till kristallisation uppvisade diosmin vid alla koncentrationer den hämmande effekten på COM-kristalltillväxt på det dosberoende sättet. Vissa tidigare studier har rapporterat att lösligheten av CaOx-kristaller kan ökas av derivat av hydroxiantrakinoner med glykosylering [45]. Dessutom kan närvaron av sockerarter i sådana bioaktiva föreningar binda till fri kalciumjon, möjligen på grund av hydroxylgrupperna i molekylstrukturen, och därigenom hämma bildningen av CaOx-kristaller [45,46]. Diosmin kan också påverka övergången av de solubiliserade kalcium- och oxalatjonerna till de kristallina COM-partiklarna i renal tubulär vätska i processen för COM-kristallisation baserat på denna mekanism.
Ändå främjades COM-kristallaggregation med 10–160nMdiosmin, vilket implicerar förmågan hos diosmin att fungera som en länk eller adhesiv molekyl för att rekrytera individuella kristaller för att binda samman för att bilda kristallaggregaten. Denna bindning resulterar också i utvecklingen av adhesiva broar mellan enskilda kristaller och kan inducera den stora strukturbildningen av COM-kristaller, som lätt bidrar till avsättningen av stennidus inutinjure[32].
COM-kristallretention genom vidhäftning av kristaller på njurrörformiga cellytor har fastställts som ett annat viktigt steg för njurstensbildning [47]. Våra data avslöjade att diosmin kunde minska den vidhäftande förmågan hos COM-kristaller att binda till apikala ytor av MDCK-njurrörsceller. Vissa tidigare studier har visat att glykosaminoglykaner (polysackaridföreningar) belagda på CaOx-kristaller eller uttryckta på njurrörsceller kan störa vidhäftningsförmågan hos CaOx-kristaller på tubulära njurceller [48]. Dessutom är uttrycket av kristallreceptorer på renala tubulära celler en av de avgörande mekanismerna som bestämmer kristallcellsadhesion [21]. Medan CaOx-kristaller inducerar skador på apikala membran, särskilt mikrovilli, kan vissa polyfenoler såsom epigallokatechingallat (EGCG) förhindra kristallcellvidhäftning och cellskada [49]. Dessutom har flavonoidsubstans i olika växtextrakt tidigare rapporterats öka urinens pH-nivå, vilket leder till hämning av kristallcellsvidhäftning [50,51]. Kanske,diosminkan också dämpa sådan cellulär skada inducerad av COM, och därigenom minska kristallcellvidhäftningen.
COM-kristallinternalisering har visats främst uppträda genom endocytos via aktincytoskelettförmedlad makropinocytosväg [40]. Flavonoider som quercetin har rapporterats påverka aktincytoskelett som krävs för makropinocytos [52,53]. Våra resultat visade att diosmin signifikant minskade förmågan hos MDCK-celler att internalisera COM-kristaller. Sådan hämmande effekt av diosmin kan vara associerad med montering eller organisering av aktincytoskelett inuti cellerna som direkt påverkar makropinocytosvägen [54,55].
Efter internalisering bröts COM-kristallerna ned av endolysosomer vilket resulterade i ökningar av fria kalcium- och oxalatjoner i njurinterstitium [37]. Sådana ökningar av kalcium- och oxalatjoner kan leda till COM-neokristallisering i det renala interstitium [56,57]. Dessutom kan närvaron av interstitiell COM-kristaller vara från defekter av täta förbindelser och paracellulära adhesionsbarriärer, vilket resulterar i ökad paracellulär permeabilitet och kristalltranslokation [58-60]. Dessa kristaller kan sedan invadera det renala interstitium genom ECM och därefter utlösa flera inflammatoriska svar och vävnadsskador [58–60]. I denna studie observerade vi att invasionen av COM-kristaller genom ECM-migreringskammaren inducerades av alla koncentrationer av diosmin. Diosmin kan binda till COM-kristallytorna och interagera med plasminogen-plasminsystemet som drev kristallmigreringen i ECM-migreringskammaren [38,39].
Cistanche för njure
Därför attdiosmininducerade både hämmande och främjande effekter på olika processer av COM-stenbildning, bestämde vi därför deras förhållande med Pearsons korrelationstest. Korrelationsanalysen avslöjade att kristallantal omvänt korrelerade med både kristallstorlek och kristalltillväxt (A Kristallstorlek) (Fig. 7A och B). Kristallstorleken var starkt korrelerad med kristalltillväxt (Fig. 7C) men omvänt korrelerad med kristallmassa (Fig. 7D). Slutligen korrelerade kristallmassan starkt med både kristallantal och kristallaggregation (fig. 7E och F). Från korrelationsanalysen indikerar data att kristallantal och kristallmassa är mer relevanta för att återspegla kristallisation än kristallstorlek (fig. 7A, D och E). Dessutom är storleken på neokristaller under kristallisation relaterad till tillväxten av de förformade kristallerna (Fig. 7C), medan graden av kristallisation (som återspeglas av kristallantal och kristallmassa) är nära relaterad till graden av kristallaggregation (Fig. 7E och F). Emellertid är dessa korrelationer mest sannolikt specifika för diosmineffekterna, medan effekter från andra modulatorer kan ha samma korrelationer eller inte. Till exempel minskar fibronektin kristallmassa och hämmar kristalltillväxt, men främjar kristallaggregation [31]. Dessutom ökar intakt livskraftig Escherichia coli kristallstorlek och massa men har inga effekter på kristallantal [33]. Dessa data indikerar att korrelationerna mellan olika COM-kristallanalyser inte är universella för alla modulatorer.
Slutligen har vi sammanfattat resultaten från olika analyser och integrerat dem med de patogena mekanismerna förnjurestensjukdom (se scheman i fig. 8). Från korrelationsanalysen främjar diosmin kristallisation (Fig. 8A). Mellan kristallisation och kristalltillväxt,diosminhåller en bra balans genom att främja kristallisation men, å andra sidan, hämma kristalltillväxt (fig. 8B). När det gäller alla effekter på COM-kristaller enbart (utan hänsyn till celler och ECM som också ingriper), är den främjande aktiviteten av diosmin mer framträdande än dess hämmande aktivitet på COM-kristaller eftersom det främjar både kristallisation och kristallaggregation, men hämmar endast kristalltillväxt ( Fig. 8C). Även om kristallisationen ökar, minskar kristallstorleken och är associerad med tillväxthämningen (Fig. 7C). Dessa data överensstämmer med resultaten som rapporterats av Kavanagh et al. [61–63], vilket visar att ökningen av kristallisation leder till minskningen av övermättnad av kalcium- och oxalatjoner i lösningen, vilket minskar tillväxten. Emellertid är kristalltillväxt inte den enda faktorn som avgörnjurestenpatogenes [64], särskilt när kristallmassan överväldigas och är associerad med ökningen av kristallaggregering (fig. 7F) som kan öka risken för att kristallmaterial fastnar i små rörformiga segment (i den intratubulära hypotesen), och därigenom ökar risken för stenbildning. Dessutom har en tidigare studie visat att data överensstämmer med våra fynd, vilket indikerar att ökningen av kristallantal är associerad med ökningen av kristallaggregation och stenförstoring [63].
Fig. 7. Korrelationsanalys. (A)–(F): Korrelationer mellan COM-kristallnummer, kristallstorlek, Δ Kristallstorlek, kristallmassa och ett antal kristallaggregat analyserades med Pearsons korrelationstest.
Fig. 8. Schema som sammanfattar de modulerande effekterna avdiosminpå COMnjurestenbildningsprocesser. (A): Effekter av diosmin på COM-kristallisation. (B): Effekter av diosmin på COM-kristallisation och kristalltillväxt. (C): Effekter av diosmin på COM-kristallisation, tillväxt och aggregation. (D): Effekter av diosmin på hela COM njurstensbildningsprocesser.
När interaktioner med renala tubulära celler och ECM beaktas, den globala bilden av de dubbla effekterna avdiosminpå COM blir njurstensbildningen mycket tydligare (Fig. 8D). Diosmin hämmar vidhäftning av kristaller och minskar därigenom kristallinternalisering i cellerna. Detta kan förklaras att den mindre storleken på COM-kristaller har mindre vidhäftande förmåga att binda njurens tubulära celler jämfört med de större som rapporterats i vår senaste studie [34] och tidigare studie av en annan grupp [65]. Den mindre vidhäftningsförmågan hos de mindre COM-kristallerna beror på deras mindre vidhäftningskraft till cellytan och färre antal COM-kristallreceptorer bundna till dem, vilket bestäms av atomkraftsmikroskopi respektive proteomanalys [34]. Diosmin hämmar också kristallinternalisering. Observera att internaliseringsprocessen är ett tveeggat svärd som kräver noggrann tolkning. Internalisering eller endocytos i en av de försvarsmekanismer som celler används för att eliminera kristaller av endolysosomer. Men nedbrytning av de intakta kristallerna genererar fria kalcium- och oxalatjoner som kan flytta från intracellulärt utrymme till det renala interstitium, där de kan generera neokristaller [56,57]. Å andra sidan främjar diosmin kristallinvasion genom ECM, vilket är en av de mekanismer som är viktiga för njurstenspatogenes (särskilt i Randalls plackmodell) [58–60]. Sammantaget sammanfattar Fig. 8D alla de dubbla modulerande effekterna av diosmin på COMnjurestenbildningsprocesser. Det bör noteras att balansen mellan dessa främjande och hämmande effekter inte kan beräknas exakt (till skillnad från en matematisk ekvation). Dessutom finns det flera andra endogena och exogena faktorer som också kan ingripa i stenbildningsprocesserna. Slutligen uppvisar diosmin också flera indirekta effekter på bildning av njursten, inklusive dess antioxidant- och antiinflammatoriska egenskaper [5,6] som bör beaktas. Därför är det slutliga resultatet av dessa dubbla modulerande effekter avdiosminpå COMnjurestenbildning behöver ytterligare undersökningar in vivo och prospektiv studie med stor kohort.
5. Slutsatser
Sammanfattningsvis rapporterar vi här de dubbla effekterna av diosmin på COM-kristallmodulering på ett dosberoende sätt. Även om det hämmar COM-kristalltillväxt, kristallcellvidhäftning och internalisering i njurrörsceller,diosminfrämjar COM-kristallisering, aggregering och invasion genom ECM. Därför är dess anti-urolitiasis roll tveksam och försiktighet bör vidtas för dess användning vid njurstenssjukdom.
CRediT författarskapsbidragsförklaring
Supaporn Khamchun: konceptualisering, metodik, programvara, validering, formell analys, undersökning, datakurering, skrivande – originalutkast, visualisering, Sunisa Yoodee: konceptualisering, metodik, programvara, validering, formell analys, utredning, datakurering, skrivande – originalutkast, Visualisering, besök Thongboonkerd: konceptualisering, metodik, programvara, validering, resurser, skrivande – granskning & redigering, handledning, projektadministration, finansieringsförvärv.
Uttalande av intressekonflikt
Författarna förklarar INGEN intressekonflikt.
Erkännanden
Vi är tacksamma för Kittiya Suwannakuds tekniska hjälp. Detta arbete stöddes av Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council (NXPO) genom PMU-B och Thailand Research Fund (IRN60W0004). VT stöds också av "Chalermphrakiat"-stipendiet, Fakulteten för medicin Siriraj Hospital.
Referenser
[1] A. Bogucka-Kocka, M. Wozniak, M. Feldo, J. Kockic, K. Szewczyk,Diosmin– isoleringstekniker, bestämning i växtmaterial och farmaceutiska formuleringar och klinisk användning, Nat. Driva. Commun. 8 (2013) 545–550.
[2] Y. Zheng, R. Zhang, W. Shi, L. Li, H. Liu, Z. Chen, L. Wu, Metabolism och farmakologiska aktiviteter av den naturliga hälsofrämjande föreningen diosmin, Food Funct. 11 (2020) 8472–8492.
[3] MR Cesarone, G. Belcaro, L. Pellegrini, A. Ledda, G. Vinciguerra, A. Ricci, A. Di Renzo, I. Ruffini, G. Gizzi, E. Ippolito, F. Fano, M. Dugall , G. Acerbi, U. Cornelli, M. Hosoi, M. Cacchio, Venoruton vs Daflon: utvärdering av effekter på livskvalitet vid kronisk venös insufficiens, Angiology 57 (2006) 131-138.
[4] KA Lyseng-Williamson, CM Perry, Mikroniserad renad flavonoidfraktion: en genomgång av dess användning vid kronisk venös insufficiens, venösa sår och hemorrojder, Drugs 63 (2003) 71–100.
[5] AS Shalkami, M. Hassan, AG Bakr, Anti-inflammatorisk, antioxidant och anti-apoptotisk aktivitet av diosmin vid ättiksyra-inducerad ulcerös kolit, Hum. Exp. Toxicol. 37 (2018) 78–86.
[6] M. Berkoz, Diosmin undertrycker de proinflammatoriska mediatorerna i lipopolysackarid-inducerade RAW264.7 makrofager via NF-kappaB och MAPKs signalvägar, Gen. Physiol. Biophys. 38 (2019) 315–324.
[7] M. Rajasekar, K. Suresh, K. Sivakumar, Diosmin inducerar apoptos genom modulering av STAT-3-signalering i 7,12 dimethylbenz(a)antracene-inducerad harmster buckal pouch carcinogenesis, Biomed. Pharm. 83 (2016) 1064–1070.
[8] A. Lewinska, J. Adamczyk-Grochala, E. Kwasniewicz, A. Deregowska, M. Wnuk, Diosmin-inducerad senescens, apoptos och autofagi i bröstcancerceller med olika p53-status och ERK-aktivitet, Toxicol. Lett. 265 (2017) 117–130.
[9] AC Pushkaran, V. Vinod, M. Vanuopadath, SS Nair, SV Nair, AK Vasudevan, R. Biswas, CG Mohan, Kombination av återanvänt läkemedel diosmin med amoxicillin-klavulansyra orsakar synergistisk hämning av mykobakteriell tillväxt, Sci. Rep. 9 (2019) 6800.
[10] CC Hsu, MH Lin, JT Cheng, MC Wu, Antihyperglykemisk verkan av diosmin, en citrusflavonoid, induceras genom endogent beta-endorfin i typ I-liknande diabetiska råttor, Clin. Exp. Pharm. Physiol. 44 (2017) 549–555.
[11] O. Senthamizhselvan, J. Manivannan, T. Silambarasan, B. Raja,Diosminförbehandling förbättrar hjärtfunktionen och undertrycker oxidativ stress i råtthjärta efter ischemi/reperfusion, Eur. J. Pharm. 736 (2014) 131–137.
[12] N. Tong, Z. Zhang, Y. Gong, L. Yin, X. Wu, Diosmin skyddar råttnäthinnan från ischemi/reperfusionsskada, J. Ocul. Pharm. Ther. 28 (2012) 459–466.
[13] AE Elhelaly, G. AlBasher, S. Alfarraj, R. Almeer, EI Bahbah, MMA Fouda, SG Bungau, L. Aleya, MM Abdel-Daim, Skyddseffekter av hesperidin och diosmin mot akrylamid-inducerad lever, njure, och oxidativ skada på hjärnan hos råttor, Environ. Sci. Förorena. Res. Int. 26 (2019) 35151–35162.
[14] C. Thongprayoon, AE Krambeck, AD Rule, Determining the true burden ofnjurestensjuka, Nat. Rev. Nephrol. 16 (2020) 736–746.
[15] K. Bishop, T. Momah, J. Ricks, Nephrolithiasis, Prim. Care 47 (2020) 661–671.
[16] A. Viljoen, R. Chaudhry, J. Bycroft, Renal stones, Ann. Clin. Biochem 56 (2019) 15–27.
[17] PM Ferraro, R. Marano, A. Primiano, J. Gervasoni, M. Bargagli, G. Rovere, PF Bassi, G. Gambaro, Stensammansättning och vaskulära förkalkningar hos patienter med nefrolitiasis, J. Nephrol. 32 (2019) 589–594.
[18] G. Schubert, Stenanalys, Urol. Res. 34 (2006) 146–150.
[19] A. Vinaiphat, S. Aluksanasuwan, J. Manissorn, S. Sutthimethakorn, V. Thongboonkerd, Response of renal tubular cells to differential types and doses of calcium oxalate crystals: integrative proteome network analysis and functional research, Proteomics 17 (2017) ), 1700192.
[20] P. Peerapen, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Proteinnätverksanalys och funktionella studier av kalciumoxalatkristallinducerad cytotoxicitet i renala tubulära epitelceller, Proteomics 18 (2018), 1800008.
[21] KP Aggarwal, S. Narula, M. Kakkar, C. Tandon, Nephrolithiasis: molekylär mekanism för bildning av njursten och den avgörande roll som modulatorer spelar, Biomed. Res. Int. 2013 (2013), 292953.
[22] VN Ratkalkar, JG Kleinman, Mechanisms of stone formation, Clin. Rev. Bone Miner. Metab. 9 (2011) 187–197.
[23] X. Zeng, Y. Xi, W. Jiang, Protective roles of flavonoids and flavonoid-rich plantextract against urolithiasis: a review, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 59 (2019) 2125–2135.
[24] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi, MH Farzaei, S. Zingue, SM Nabavi, A. Bishayee, Dietary plants for the prevention and management ofnjurestenar: prekliniska och kliniska bevis och molekylära mekanismer, Int. J. Mol. Sci. 19 (2018) 765.
[25] S. Ahmed, MM Hasan, H. Khan, ZA Mahmood, S. Patel, The mechanistic insight of polyphenols in calcium oxalate urolithiasis mitigation, Biomed. Pharm. 106 (2018) 1292–1299.
[26] VV Prabhu, D. Sathyamurthy, A. Ramasamy, S. Das, M. Anuradha, S. Pachiappan, Utvärdering av skyddande effekter av diosmin (en citrusflavonoid) vid kemiskt inducerad urolithiasis hos experimentella råttor, Pharm. Biol. 54 (2016) 1513–1521.
[27] A. Noorafshan, S. Karbalay-Doust, F. Karimi,Diosminminskar kalciumoxalatavsättning och vävnadsdegeneration vid nefrolitiasis hos råttor: en stereoologisk studie, koreanska J. Urol. 54 (2013) 252–257.
[28] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Chutipongtanate, Faktorer som bestämmer typer och morfologier av kalciumoxalatkristaller: molära koncentrationer, buffring, pH, omrörning och temperatur, Clin. Chim. Acta 367 (2006) 120–131.
[29] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Sinchaikul, ST Chen, Proteomisk analys av kalciumoxalatmonohydratkristallinducerad cytotoxicitet i distala renala tubulära celler, J. Proteome Res. 7 (2008) 4689–4700.
[30] P. Amimanan, R. Tavichakorntrakool, K. Fong-ngern, P. Sribenjalux, A. Lulitanond, V. Prasongwatana, C. Wongkham, P. Boonsiri, WJ Umka, V. Thongboonkerd, Förlängningsfaktor Tu on Escherichia coli isolerad från urin från patienter med njursten främjar tillväxt och aggregation av kalciumoxalatkristaller, Sci. Rep. 7 (2017) 2953.
[31] S. Khamchun, K. Sueksakit, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Modulatory effects of fibronectin on calcium oxalate crystallization, growth, aggregation, adhesion on renal tubular cells, and invasion through extracellular matrix, J. Biol. Inorg. Chem. 24 (2019) 235–246.
[32] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Definiera och systematiska analyser av aggregationsindex för att utvärdera graden av kalciumoxalatkristallaggregation, Front. Chem. 5 (2017) 113.
[33] R. Kanlaya, O. Naruepantawart, V. Thongboonkerd, Flagellum är ansvarig för att främja effekterna av livskraftiga Escherichia coli på kalciumoxalatkristallisation, kristalltillväxt och kristallaggregation, Front. Microbiol 10 (2019) 2507.
[34] P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Differentiella bundna proteiner och adhesiva egenskaper hos kalciumoxalatmonohydratkristaller med olika storlekar, Int. J. Biol. Macromol. 163 (2020) 2210–2223.
[35] K. Fong-ngern, K. Sueksakit, V. Thongboonkerd, Surface heat shock protein 90 fungerar som en potentiell receptor för kalciumoxalatkristaller på apikala membranet hos renala tubulära epitelceller, J. Biol. Inorg. Chem. 21 (2016) 463–474.
[36] S. Chaiyarit, S. Mungdee, V. Thongboonkerd, Icke-radioaktiv märkning av kalciumoxalatkristaller för undersökningar av kristall-cell-interaktion och internalisering, Anal. Metoder 2 (2010) 1536–1541.
[37] S. Chaiyarit, N. Singhto, V. Thongboonkerd, Kalciumoxalatmonohydratkristaller internaliserade i njurrörsceller bryts ned och löses upp av endolysosomer, Chem. Biol. Påverka varandra. 246 (2016) 30–35.
[38] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, En ny analys för att utvärdera främjande effekter av proteiner på kalciumoxalatkristallinvasion genom extracellulär matris baserad på plasminogen/plasminaktivitet, Talanta 101 (2012) 240–245.
[39] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Kalciumoxalatkristaller ökade enolas-1-utsöndringen från njurrörsceller som därefter förstärkte kristall- och monocytinvasion genom njurinterstitium, Sci. Rep. 6 (2016) 24064.
[40] R. Kanlaya, K. Sintiprungrat, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Makropinocytos är huvudmekanismen för endocytos av kalciumoxalatkristaller in i njurrörsceller, Cell Biochem. Biophys. 67 (2013) 1171–1179.
[41] S. Sassanarakkit, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, StoneMod: en databas förnjurestenmodulerande proteiner med experimentella bevis, Sci. Rep. 10 (2020) 15109.
[42] G. Eraslan, ZS Sarica, LC Bayram, MY Tekeli, M. Kanbur, M. Karabacak, Effekterna av diosmin på aflatoxin-inducerad lever- och njurskada, Environ. Sci. Förorena. Res. Int. 24 (2017) 27931–27941.
[43] R. Russo, D. Chandradhara, N. De Tommasi, Comparative bioavailability of twodiosminformuleringar efter oral administrering till friska frivilliga, Molecules 23 (2018) 2174.
[44] JQ Silveira, TB Cesar, JA Manthey, EA Baldwin, J. Bai, S. Raithore, Pharmacokinetics of flavanone glycosiders after intake of single doses of fresh-presse-pressed apelsinjuice kontra kommersiellt bearbetad apelsinjuice i friska människor, J. Agric . Food Chem. 62 (2014) 12576–12584.
[45] A. Frackowiak, P. Skibinski, W. Gawel, E. Zaczynska, A. Czarny, R. Gancarz, Syntes av glykosidderivat av hydroxyantrakinon med förmåga att lösa upp och hämma bildningen av kristaller av kalciumoxalat. Potentiella föreningar i njurstensterapi, Eur. J. Med. Chem. 45 (2010) 1001–1007.
[46] F. Grases, J. Perello, B. Isern, RM Prieto, Studie av en myo-inositol-hexafosfatbaserad kräm för att förhindra dystrofisk calcinosis cutis, Br. J. Dermatol. 152 (2005) 1022–1025.
[47] V. Thongboonkerd, Proteomics of crystal-cell interactions: a model for kidney sten research, Cells 8 (2019) 1076.
[48] CF Verkoelen, Kristallretention vid njurstenssjukdom: en avgörande roll för glykosaminoglykanen hyaluronan? J. Am. Soc. Nephrol. 17 (2006) 1673–1687.
[49] K. Fong-ngern, A. Vinaiphat, V. Thongboonkerd, Microvillar injury in renal tubular epitelial cells induced by calcium oxalate crystal and the protective role of epigallocatechin-3-gallate, FASEB J. 31 (2017) 120 –131.
[50] J. Zhou, J. Jin, X. Li, Z. Zhao, L. Zhang, Q. Wang, J. Li, Q. Zhang, S. Xiang, Totalt antal flavonoider av Desmodium styracifolium dämpar bildningen av hydroxi- L-prolin-inducerad kalciumoxalat urolithiasis hos råttor, Urolithiasis 46 (2018) 231–241.
[51] J. Manissorn, K. Fong-ngern, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Systematisk utvärdering för effekter av urinens pH på kalciumoxalatkristallisation, kristallcellsadhesion och internalisering i njurrörsceller, Sci. Rep. 7 (2017) 1798.
[52] S. Cui, J. Qian, P. Bo, Hämmande effekt på fagocytos av Candida albicans inducerad av förbehandling med quercetin via aktincytoskelettinterferens, J. Tradit. Haka. Med. 33 (2013) 804–809.
[53] S. Cui, Q. Wu, J. Wang, M. Li, J. Qian, S. Li, Quercetin hämmar LPS-inducerad makrofagmigration genom att undertrycka iNOS/FAK/paxillin-vägen och modulera cytoskelettet, celladhes . Migr. 13 (2019) 1–12.
[54] Y. Li, WG Gonzalez, A. Andreev, W. Tang, S. Gandhi, A. Cunha, D. Prober, C. Lois, ME Bronner, Macropinocytosis-medierad membranåtervinning driver neural crest-migrering genom att leverera F- aktin till lamellipodium, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 117 (2020) 27400–27411.
[55] H. Inaba, K. Yoda, H. Adachi, F-aktinbindande RapGEF GflB krävs för effektiv makropinocytos i Dictyostelium, J. Cell Sci. 130 (2017) 3158–3172.
[56] A. Khan, Prevalens, patofysiologiska mekanismer och faktorer som påverkar urolithiasis, Int. Urol. Nephrol. 50 (2018) 799–806.
[57] AP Evan, EM Worcester, FL Coe, J. Williams Jr., JE Lingeman, Mechanisms of human kidney stone formation, Urolithiasis 43 (Suppl 1) (2015) 19–32.
[58] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Mitokondriell dysfunktion ochnjurestensjuka, Front. Physiol. 11 (2020), 566506.
[59] SR Khan, Histologiska aspekter av "fixed-particle"-modellen för stenbildning: djurstudier, Urolithiasis 45 (2017) 75–87.
[60] VY Bird, SR Khan, Hur bildas stenar? Är det möjligt att förena teorier om stenbildning? Båge. Esp. Urol. 70 (2017) 12–27.
[61] JP Kavanagh, Metoder för studier av kalciumoxalatkristallisation och deras tillämpning på urolithiasisforskning, Scanning Microsc. 6 (1992) 685–704, diskussion 704-5.
[62] JP Kavanagh, L. Jones, PN Rao, Kalciumoxalatkristallisationskinetik vid olika koncentrationer av mänsklig och artificiell urin, med ett konstant förhållande mellan kalcium och oxalat, Urol. Res. 27 (1999) 231-237.
[63] NK Saw, PN Rao, JP Kavanagh, A. nidus, kristalluri och aggregering: nyckelingredienser för stenförstoring, Urol. Res. 36 (2008) 11–15.
[64] A. Borissova, GE Goltz, JP Kavanagh, TA Wilkins, Reverse engineering the kidney: modellering av kalciumoxalatmonohydratkristallisation i nefronen, Med. Biol. Eng. Comput. 48 (2010) 649–659.
[65] LA Thurgood, ES Sorensen, RL Ryall, Effekten av intrakristallint och ytbundet osteopontin på bindningen av kalciumoxalatdihydratkristaller till Madin-Darby hundnjure (MDCK) celler i ultrafiltrerad mänsklig urin, BJU Int. 109 (2012) 1100–1109.
