Effekt av Cistanche Tubulosa-extrakt på manlig fortplantningsfunktion hos streptozotocin-nikotinamid-inducerade diabetesråttor-Ⅱ

3.2. In vivo analys

3.2.1. Effekter av CTE på kroppsvikt och kaloriintag

Efter 6 veckors experimentering visade diabetikergruppen (HFD-DM) högre kroppsvikt än kontrollgruppen. HFD-DME4-gruppen visade en lägre kroppsvikt än HFD-DM- och HFD-DMER-grupperna (Figur 7a). Kontrollgruppens kaloriintag var signifikant lägre än i de andra grupperna. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan kaloriintaget för de andra fem grupperna (Figur 7b).

3.2.2. Oralt glukostoleranstest (OGTT) för att bestämma framgångsrik induktion av diabetes

Det orala glukostoleranstestet (OGTT) används som ett lovande verktyg för att upptäcka diabetes mellitus. Ökade nivåer av glukos i blodet indikerar diabetestillståndet. Som visas i figur 8a var plasmaglukosnivån lägre i CTE-grupperna än i DM-gruppen vid 0, 30, 90 och 120 min. Vidare visade arean under kurvan (AUC) för plasmaglukoskoncentrationen att i CTE- och RSG-grupperna ökade blodglukosupptagningshastigheten (Figur 8b).

3.2.3. Totalt innehåll av plasmaglukos, kolesterol och triglycerider

Blodsockernivån i plasma var högre i DM-gruppen och lägre i DME2-gruppen (förutom kontroll) än i andra. Det fanns ingen signifikant skillnad i det totala kolesterolet mellan grupperna förutom DME4-gruppen. I DME4-gruppen var kolesterolnivån lägre än de andra. Nivån av triglycerider var högre i DM-gruppen och lägre i DME4-gruppen och triglyceridhalten minskade med en ökning av koncentrationen av CTE (tabell 2). Resultaten visar att nivån av plasmaglukos, kolesterol och triglycerider var högre i DM-gruppen och nivån minskade signifikant vid behandling med CTE.

3.2.4. Plasmainsulinnivåer, plasmaleptinnivåer och homeostasmodellbedömning – insulinresistens (HOMA-IR) värden

Nivåerna av plasmainsulin, leptin och HOMA-IR-värden visas i tabell 3. DM-gruppen hade högre plasmainsulin- och plasmaleptinnivåer än kontrollgruppen. HOMA-IR-indexet var också signifikant högre i DM-gruppen. Plasmainsulin-, leptin- och HOMA-IR-värdena minskade med en ökning av koncentrationen av CTE. Plasmaleptin reducerades signifikant i CTE-grupper men RSG-läkemedelsgruppen (DMR) visade ingen signifikant skillnad från DM-gruppen.

3.2.5. Effekt av CTE på plasma LH och testosteronnivåer hos diabetesråttor

Som visas i tabell 4 minskade koncentrationerna av testosteron hos diabetiska råttor (DM) signifikant, medankoncentrationerna av testosteron ökade signifikantvid olika doser av CTE. Vidare visade resultaten en liten minskning av nivån av LH i DM-gruppen jämfört med DMR, DME1, DME2 och DME4. LH-produktionen var högre i DME4-gruppen.

3.2.6. Effekt av CTE på spermaparametrarna hos diabetesråttor

De experimentella resultaten visade att DM-gruppen hade en signifikant minskning i spermieantal och rörlighet än kontrollgruppen, medan spermieavvikelsen ökade signifikant i DM-gruppen. Intressant nog förbättrades spermienumret, spermiemotiliteten och spermieabnormalitetsfrekvensen för DMR-gruppen, men spermiemotiliteten når inte en signifikant nivå jämfört med DME4. DME2 visade bättre spermieantal än alla och rörligheten ökade signifikant i DME4-gruppen. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan antalet onormala spermier mellan RSG- och CTE-behandlade grupper (tabell 5).

3.2.7. Effekt av CTE på morfologin hos seminiferösa tubuli hos diabetesråttor

Figur 9 visar H&E-färgningen av testikelsektionen. Den svarta pilen betecknar Leydig-cellen och den vita pilen betecknar Sertoli-cellen. Både Leydig-cellen och Sertoli-cellen i DM-gruppen visade signifikant atrofi och en kavitet sågs i lumen. Strukturen av Leydig-celler och Sertoli återställdes i CTE- och RSG-behandlade grupper. Tjockleken på seminiferösa tubuli var högre i CTE- och RSG-grupperna än i DM-gruppen.

3.2.8. Effekt av CTE på KiSS1, GPR54, SOCS-3 och SIRT1 MRNA i hypotalamus hos diabetiska råttor

Uttrycket av KiSS1 (Figur 10a), GPR54 (Figur 10b), SOCS-3 (Figur 10d) och SIRT1 (Figur 10c) visades i Figur 10. mRNA-uttrycket av KiSS1 och receptor GPR54 i diabetiska råttor var betydligt lägre än i kontrollgruppen. KiSS1- och GPR 54-mRNA-expressionsnivåerna i DMR, DME1, DME2 och DME4 ökade signifikant. I synnerhet ökade GPR54-mRNA-uttrycket signifikant i DME4 och var nästan likt kontrollgruppen.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR SKYDDA PRODUKTIONEN AV TESTOSTERON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Detta experiment undersökte ytterligare mängden SOCS-3 och SIRT1-mRNA i hypotalamus hos råttor. Uttrycket av SOCS-3-mRNA hos diabetiska råttor ökade signifikant, vilket tyder på att leptinimpedansen var allvarligare. DMR-, DME1-, DME2- och DME4-grupperna visade signifikanta förbättringar jämfört med diabetikergruppen. SIRT1-mRNA-uttrycket i DM-gruppen minskade signifikant och ökade signifikant i DME1- och DME4-grupperna.

3.2.9. Effekt av CTE på antioxidantenzymer i plasma och testiklar hos diabetesråttor

Tabell 6 visar att plasma SOD-aktiviteten, GPx-aktiviteten och katalasaktiviteten hos diabetiska råttor minskade signifikant och aktiviteterna ökade i CTE- och RSG-behandlade grupper. Utöver detta visade DME4 signifikanta förbättringar i GPx-aktivitet än andra. Resultaten visade att SOD- och katalasaktiviteten hos diabetiska råttor minskade signifikant efter sex veckor. SOD- och katalasaktiviteten för DMR-gruppen når inte en signifikant nivå. De CTE-behandlade grupperna visade signifikanta förbättringar i SOD- och katalasaktiviteten. De ökade aktiviteterna av katalas och SOD i CTE-grupper sågs också i testiklarna (tabell 7). Den högsta aktiviteten av SOD och katalas observerades i DME1-gruppen respektive DME2-grupperna.

3.2.10. Effekter av CTE på oxidativ stress och inflammation i plasma och testiklar hos diabetesråttor

Kväveoxidproduktion (NO) i plasma (Figur 11a) och testikel (Figur 11b) visades i Figur 11. Produktionen av NO i DM-gruppen ökade signifikant både i testiklarna och plasma jämfört med kontrollgruppen. En gradvis minskning av NO-produktionen observerades i grupperna DME1, DME2 och DME4 (i plasma). DMR-gruppen visade också en signifikant minskning av NO-produktionen. I fallet med testiklarna observerades en liten minskning av NO-produktionen i CTE-grupper, medan DMR-gruppen inte signifikant minskade NO-produktionen.

Som visas i figurerna 12 och 13 ökade nivåerna av TNF- och IL-6 signifikant hos diabetiska råttor (både i plasma och testiklar), vilket indikerar att inflammationen är allvarligare. I plasma är nivån av TNF- liknande i de CTE- och RSG-behandlade grupperna (Figur 12a). CTE-grupperna reducerade signifikant (särskilt DME2) nivån av TNF- i testiklarna (Figur 12b). Nivån av IL-6 reducerades signifikant i plasman från CTE- och RSG-grupper (Figur 13a). I testiklarna fanns en trend till en minskning av nivån av IL-6, men detta nådde inte en signifikant nivå (Figur 13b).

3.2.1.1. Effekter av CTE på oxidativ stress och inflammation i spermier från diabetesråttor orsakade av fettrik kost

Figur 14 visar superoxidanjoninnehållet i råttspermier. Resultaten visade att superoxidanjonproduktionen i spermier från diabetiska råttor ökade signifikant och ingen signifikant förbättring observerades i DMR-gruppen. DME1- och DME4-grupper visade signifikant minskad produktion av superoxidanjon.

3.2.12. Effekter av CTE på lipidperoxidation i spermier hos diabetiska råttor inducerad av fettrik kost

Studier har visat att lipidperoxidationen ökade hos både typ 1 och typ 2 diabetespatienter [19]. Malondialdehydnivån (MDA) i plasma, spermier och testiklar visas i Tabell 8. MDA-nivån i plasma, testiklar och spermier i DM-gruppen var signifikant högre och behandlingen med CTE och RSG minskade produktionen av MDA. En signifikant minskning observerades i DME4- och DMEI-grupperna i plasma. Denna studie fann att diabetiska råttor inte bara ökade graden av lipidperoxidation i plasma utan också ökade i testiklar och spermier. Signifikant förbättring observerades vid olika doser av CTE.

4. Diskussion

Diabetes är en kronisk sjukdom som förknippas med en hög nivå av socker i blodet. Obalansen mellan antioxidant- och ROS-nivåer kommer att leda till tillståndet som kallas oxidativ stress. Superoxid, hydroxylradikal, väteperoxid, kväveoxid och singlettsyre är några av exemplen på ROS som kommer att bidra till diabetestillstånd via oxidativ stress [20].Cistanche tubulosaär en ökenväxt som innehåller aktiva komponenter som t.expolysackarider, oligosackarider, fenyletanoidglykosider (echinakosid, verbaskosid)palmitinsyra, linolsyra, iridoider, alditoler och lignaner. Denna växt är kapabel att producera antiinflammatoriska, neuroprotektiva, antibakteriella, antivirala, antioxidativa, antitumör- och immunmodulerande effekter [21]. Litteraturstudier visar att fenyletanoidglykosiderna från Cistanche tubulosa är huvudorsaken till antioxidantaktiviteten [22]. Resveratrol (RES) och rosiglitazon (RSG) togs som positiv kontroll för in vitro- respektive in vivo-studier. RSG är en kraftfull insulinsensibilisator och har en affinitet till isoformen av peroxisomproliferatoraktiverad receptor (PPARc). Det kontrollerar hyperglykemi hos diabetespatienter [23]. RES har naturlig antioxidantaktivitet och fungerar som en vasodilator, reglerar lipoproteinmetabolism, hämmar trombocytaggregation och förebygger cancer [24,25]. Vår undersökning indikerade att ECH visar bättre radikalfångande aktivitet än CTE och RES (Figur 1). Det är också underförstått att ECH inte orsakar någon signifikant toxicitet för LC-540 och TM3 Leydig-celler (Figur 2).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FÖR MANLIG SEXUELL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

AGEs användes för att inducera stresstillstånd i Leydig-celler. Produktionen av AGE, inflammation, oxidativ stress och diabetes är sammankopplade. Det hyperglykemiska tillståndet vid diabetes främjar cellskador genom produktion av AGE och oxidativ stress. AGEs inducerar celltoxicitet, vilket ytterligare främjar immuncellrekrytering och celldöd. En förhöjd nivå av AGE främjar uttrycket av två typer av receptorer som kallas RAGE och AGER1 [26]. Droppet och efterföljande överföring av en elektron från den mitokondriella andningskedjan till molekylärt syre under oxidativ stress resulterar i bildandet av en superoxidanjon. Våra resultat visar att produktionen av superoxidanjon inducerad av AGE ökade i kontrollgruppen och ytterligare förbättringar observerades med både ECH- och RES-behandlingar. Enligt vår studie förstod man att produktionen av superoxid (Figur 3) och H2O2 (Figur 4) inducerad av AGE minskade i närvaro av ECH och RES.

NF-KB är känd som den viktiga mediatorn av inflammation i samband med diabetes [27]. Uttrycket av NF-KB leder till celldysfunktion och celldöd. Aktiveringen av NF-KB genom oxidativ stress stimulerar det pro-inflammatoriska svaret, uppreglering av endotelin och apoptos [28]. Uttrycket av RAGE och NF-KB ökade i AGE-stimulerade grupper och den efterföljande minskningen observerades i ECH- och RES-behandlade celler (Figur 5).

Testosteronär en anabol steroid och primärmanligt könshormonsyntetiseras från kolesterol. Processen börjar med den oxidativa klyvningen av kolesterolets sidokedja av kolesterolsidokedjans klyvningsgen (CYP11A). Denna gen är lokaliserad i mitokondriella membranet och omvandlar kolesterolet till pregnenolon. Därefter tar CYP17A1-genen från det endoplasmatiska retikulum bort två extra kolatomer och producerar flera C19-steroider. Utöver detta oxideras pregnenolonet för att bilda androstenedion/progesteron av hydroxisteroiddehydrogenas (3- -HSD). Slutligen produceras testosteron genom reduktion av ketogruppen i den 17:e kolpositionen av androstenedion av 17-beta-hydroxisteroiddehydrogenas (17- -HSD). Leydig-celler är involverade i den huvudsakliga produktionen av testosteron. Överföringen av kolesterol till det inre mitokondriella membranet kräver verkan av steroidogent akut regulatoriskt protein (StAR). Nuvarande studier visar att uttrycket av StAR, CYP11A1, CYP17A1 och HSD17 3 minskade i AGE-behandlade celler (kontroll) och en enorm ökning visades i ECH- och RES-behandlade celler (Figur 6) . Således visar resultaten att produktionen avtestosteron ökade i de ECH- och RES-behandlade grupperna. 

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA SEXPOWER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Under ett diabetestillstånd är transporten av glukos till organ begränsad och som ett resultat ökar glukosnivåerna [29]. Därför är det hyperglykemiska tillståndet en av de viktiga markörerna för att upptäcka diabetes. Våra studier visar att plasmaglukosnivån ökade i diabetikergrupper och AUC för DM-gruppen var signifikant högre än de andra grupperna (Figur 8). Tillsammans med plasmaglukos ökade det totala kolesterol- och triglyceridinnehållet signifikant i DM-gruppen (tabell 2). Åderförkalkning underlättas av en ökad nivå av kolesterol och triglycerider [30]. Nivån av kolesterol och triglycerider minskade dock i CTE- och RSG-behandlade grupper. Triglyceridhalten i DME4-gruppen nådde nästan liknande värden som kontrollgruppen.

Insulin är ett hormon som produceras av cellerna i bukspottkörteln och funktionaliseras för att kontrollera blodsockernivåerna i kroppen medan leptin är ett hormon som produceras av adipocyterna som kan reglera födointag och energianvändning. Studier visade att leptin är involverat i patofysiologin för fetma och det finns en positiv interaktion mellan leptin och insulin [31]. Våra studier visar att nivån av plasmainulin och leptin var högre i DM-gruppen och insulinnivån minskade med en ökning av koncentrationen av CTE. RSG-gruppen visar ingen signifikant skillnad mot DM-gruppen. Insulinresistensen och cellfunktionen bedömdes med HOMA-IR-metoden. HOMA-IR-värdet ökade i DM-gruppen och skilde sig signifikant från andra grupper (tabell 3).

DM påverkar reproduktionsfunktionen via den hormonella växlingen i HPG-axeln och studier visade att insulinuttrycket i testiklarna också påverkas av diabetes. Det kännetecknas av Sertoli-cellvakuolisering, ökad DNA-fragmentering, försämrad spermatogenes och ökad utarmning av könsceller. Oxidativ stress bidrar också till avvikelser i reproduktionsfunktionen [32]. Processen för bildning av spermier i det manliga reproduktionsorganet (testiklarna) kallas spermatogenes. Testis är sammansatt av tätt lindade tubuli som kallas seminiferous tubuli. Sertoli-celler ses i väggarna av seminiferous tubuli och ger näring till de omogna spermierna. Undersökningen av spermieparametrar visade att antalet spermier och rörlighet minskade och avvikelserna ökade i DM-gruppen (tabell 5). En motsatt effekt observerades i de CTE- och RSG-behandlade grupperna. Både Leydig-cellen och Sertoli-cellerna i DM-gruppen visade signifikant atrofi och kaviteten sågs i lumen. Tjockleken på seminiferous tubuli minskade också i DM-gruppen. Ett förbättrat resultat observerades i CTE- och RSG-behandlade grupper (Figur 9). Utöver detta minskade nivån av LH och testosteron i DM-gruppen och nivåerna ökade i CTE-behandlade grupper (tabell 4). Hos män var lågt serumtestosteron och lägre LH-pulsfrekvens ofta associerade med fetma och diabetes mellitus typ 2 [33].

Kisspeptiner som kodas av KiSS1-genen är kända som den potenta stimulatorn av HPG-axeln och varje mutation i kisspeptingenen kommer att leda till låga nivåer av könssteroider och gonadotropin. Studier visar att hos STZ-inducerade diabetiska råttor minskade Kiss1-mRNA-nivåerna [33]. Initieringen och upprätthållandet av infertilitet hos däggdjur är kopplade till G-proteinkopplad receptor 54 (GPR54). Mutationen i GPR 54 kännetecknas av frånvaron av sexuell mognad och låga nivåer av gonadotropa hormoner (LH och FSH). Pro-inflammatoriska cytokiner som IL-6 och TNF-uppreglerar uttrycket av suppressorn av cytokinsignalering 3 (SOCS3) inblandad i inflammationsmedierad insulinresistens i levern och adipocyterna [34]. SIRT 1 är en gen associerad med reglering av flera åldrande sjukdomar. Denna gen uttrycks tydligt i cellerna i bukspottkörteln och reglerar insulinutsöndringen och förhindrar apoptos. Aktuella studier indikerade att uttrycket av KiSS1, GPR54 och SIRT1 minskade i DM-gruppen, men uttrycket ökade i CTE-behandlade grupper (Figur 10). En ökning av SOCS-3-uttrycken i DM-gruppen indikerar det inflammatoriska tillståndet. Den första molekylära kopplingen som identifierades mellan fetma och inflammation var TNF-. Därför är en ökad nivå av TNF- en indikator på inflammation. Den minskade nivån av pro-inflammatoriska cytokiner såsom TNF- och IL-6 sågs i CTE-behandlade grupper (figur 12 och 13).

Obalansen mellan ROS och antioxidanter leder till diabetestillståndet. Superoxiddismutas (SOD), katalas (CAT) och glutationperoxidas (GPX) är kända som de primära antioxidanter som ansvarar för att upprätthålla den optimala ROS-nivån [35]. Av resultaten visade det sig att aktiviteten av antioxidanter var betydligt lägre i DM-gruppen. CT-behandlade grupper visade förbättringar i produktionen av antioxidanter. Den RSG-behandlade gruppen visade inga signifikanta förbättringar i antioxidantaktivitet (tabell 6 och 7).

Kväveoxid (NO) är känt som en viktig ROS som bidrar till inflammation. Våra studier pekar på att nivån av NO minskade i CTE-behandlade grupper (Figur 11). Resultaten visade att superoxidanjoninnehållet i spermier från diabetiska råttor ökade signifikant och det fanns ingen signifikant förbättring efter administrering av RSG. Produktionen av superoxid minskade i CTE-grupper.

Bestämningen av MDA är mycket användbar för att utvärdera lipidperoxidation. Lipidperoxidation är processen för oxidation i lipider och resulterar slutligen i cellskador. MDA produceras som ett resultat av lipidperoxidation av fleromättade fettsyror. Studier visar att MDA-nivån är korrelerad med ålder och fastande blodsockernivå [36]. Den aktuella studien visade att CTE förbättrar lipidperoxidation i plasma, testiklar och spermier (tabell 8).

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FÖR ATT FÖRBÄTTRA SEXUELL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

5. Slutsatser

Den oxidativa stressen under diabetiska tillstånd stör det manliga reproduktionssystemet genom försämring av spermier och gonadal dysfunktion. Cistanche tubulosa är en ökenväxt som är allmänt accepterad inom kinesisk medicin på grund av dess farmakologiska effekter.Echinacoside (ECH)är huvudbeståndsdelen i CTE som är ansvarig för dess antioxidant- och antiinflammatoriska aktiviteter. Våra in vitro-resultat indikerade att ECH återställde testosteronsyntesvägen och sänkte nivån av NF-KB och RAGE-proteinuttryck. ECH hämmade effektivt produktionen av superoxidanjon och H2O2 i Leydig-celler. In vivo-studierna visade att ECH minskade nivåerna av kolesterol, triglycerider, TNF- och IL-6. Utöver detta förbättrades mRNA-uttrycken i hypotalamus hos diabetiska råttor signifikant. Det är också anmärkningsvärt att ECH minskade lipidperoxidation och förbättrade insulinresistens hos diabetiska hanråttor. Antioxidantaktiviteten ökade både i plasma och testiklar. Därför antydde våra studier att ECH gav ett effektivt skydd mot reproduktiv dysfunktion hos STZ-inducerade diabetiska hanråttor.