Effekt av Shenkang på njurfibros och aktivering av njurinterstitiell fibroblaster genom JAK2/STAT3-vägen
Feb 27, 2022
Bakgrund
Kronisk njursjukdom (CKD) är resultatet av en mängd olika sjukdomar som irreversibelt skadar njuren och orsakar olika typer av komplikationer hos patienter [1]. För dialyspatienter påverkas livskvaliteten kraftigt och medicinska kostnader är mycket höga [2]. Den primära patologiska processen avnjurskadaleder till det normalanjur-parenkymförstöring och progressiv ärrvävnadsbildning, vilket i slutändan leder till fibros. Njurfibros inkluderar tubulär interstitiell fibros och glomeruloskleros [3], vilket leder till förstörelse avrenal vävnad och funktionsförlust.Njurtubulointerstitiell fibros är den typiska vägen för den progressiva utvecklingen av nästan alla kroniska kroniska sjukdomar och den huvudsakliga patologiska grunden för slutstadietnjursjukdom,som kännetecknas av tubulär epitelcellatrofi, inflammatorisk cellinfiltration, avvikande aktivering och tillväxt avnjur-fibroblaster och överdriven extracellulär matrix (ECM) ackumulering [4, 5]. Effektorcellerna, -slätmuskelaktin ( -SMA)-positiva myofibroblaster, syntetiserar och utsöndrar ECM. Aktiveringen av interstitiell fibroblaster till myofibroblaster kan hjälpa till att reparera skadad vävnad. Men när denna reparationsprocess är onormal och överdriven ECM utsöndras, uppstår irreversibla njurskador. Följaktligen kan signalvägen som förmedlar myofibroblastaktivering vara ett mål för att lindra processen mednjur-fibros.
CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR-/NJÖRSJUKDOMAR
Janus-kinas/signalomvandlaren och transkriptionsaktivatorn (JAK/STAT)-vägen är en pleiotrop signalkaskad för multipla tillväxtfaktorer och cytokiner [6] som förmedlar en mängd olika cellulära funktioner, inklusive cellöverlevnad och cellproliferation [7]. STAT3 aktiveras av tyrosin (Tyr) fosforylering vid Tyr705 genom Janus kinas som svar på en mängd olika tillväxtfaktorer och cytokiner, inklusive transformerande tillväxtfaktor (TGF-) [8]. Fosforylerad STAT3 bildar dimerer, som sedan överförs till kärnan, där de direkt binder till DNA-sekvensen och reglerar uttrycket av målgener [9]. Aktiveringen av STAT3 och JAK2 ökar i fibrogena njurinterstitiell fibroblaster inducerad av unilateral ureterobstruktion (UUO) [10, 11]. En ökning av STAT3-fosforylering har också observerats i TGF- -behandlade NRK-49F-celler [12].
Nuvarande allmänt använda behandlingar för CKD åtföljs ofta av mindre än tillfredsställande effekter [13] och vanliga biverkningar. Det är således av stor betydelse att utreda och identifiera effektiva behandlingsåtgärder för att förebygga och kontrollera förekomsten och utvecklingen av kronisk nyck-sjukdom för att förbättra patienters prognos. Shenkang (SK) är en vanlig örtformel som innehåller rabarber (Rheum palmatum L. eller R. tanguticum Maxim. ex Balf.), röd salvia (Salvia miltiorrhiza Bunge), safflor (Carthamus tinctorius L.) och astragalus (Astragalus mongholicus) Bunge). Sedan 1990-talet har SK använts i Kina för att behandla CKD och relaterade sjukdomar, inklusive diabetisk nefropati (DN), kronisknjursvikt, glomerulonefrit, kronisk nefrit ochnjur-insufficiens. Med sina uppenbara terapeutiska effekter och få biverkningar kan SK fördröja utvecklingen avnjur-dysfunktion vid CKD. I en klinisk prövning av 2200 personer, effektiviteten av SK för att skydda mot kroniskanjur-misslyckande och symtom associerade med CKD efter behandling med traditionell kinesisk medicin var 73,05 respektive 98,00 procent. Dessutom förblev kreatininclearance-hastigheten och serumkreatininnivån (SCr) stabila, vilket visar att SK har god effekt och är säker för behandling av kronisk nyck-sjukdom [14]. Det har verifierats att SK kan lindra CKD ochnjur-fibros genom att lindra fibros, inflammation [15] och apoptos [16]. De flesta av de befintliga studierna i ämnet var dock inte tillräckligt omfattande och fokuserade huvudsakligen på TGF- och relaterade vägar. UUO-modellen är erkänd som en experimentell modell för att undersöka njurfibros. I den aktuella studien studerade vi effekterna av SK på NRK-49F fibroblastcellaktivering och njurfibros hos UUO-möss. Vi visade vidare att dessa botande effekter av SK kan ha uppnåtts genom att rikta in JAK2/STAT3-vägen i odlade NRK-49F-celler och en UUO-musmodell.
Nyckelord:Shenkang, kronisk njursjukdom, njurfibros, UUO, njurfibroblastaktivering, JAK2/STAT3-väg
Metoder
Kemikalier och reagens SK köptes från Shijishenkang Pharmaceutical Company, Ltd. (Xi'an, Kina). Losartan-kaliumtabletter köptes från Merck Sharp & Dohme Pharmaceutical Company, Ltd. (Hangzhou, Kina).
Cell kultur
Råttnjurens fibroblastcellinje (NRK-49F) erhölls från American Type Cell Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). NRK-49F-celler odlades i komplett medium, dvs. Dulbeccos modifierade Eagles medium (Invitrogen, CA, USA) innehållande 5 procent fetalt bovint serum, 1 procent penicillin och streptomycin i en atmosfär av 5 procent CO 2 och 95 procent luft vid 37 grader. Därefter behandlades cellerna med eller utan TGF- 1 (10ng/ml) (Novoprotein, Shanghai, Kina), en angiotensinreceptorblockerare (ARB) (1 mg/ml) och gradientkoncentrationer av SK efter vidhäftning, och cellviabilitet utvärderades.
Analyser av cellviabilitet
Viabiliteten för NRK-49F-celler bestämdes med hjälp av Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kyushu, Japan) enligt satsens instruktioner. NRK-49F-celler ströks ut med en densitet av 5 ×10 4 celler per brunn i 96-brunnsplattor. Det fanns 5 replikat för varje behandling. Efter 24 eller 48 timmars odling ersattes mediet i varje brunn med 100 μL serumfritt medium innehållande CCK-8 (10:1), och cellerna inkuberades i en inkubator i ytterligare 2 timmar. Absorbansen mättes vid en våglängd av 450 nm. Effekten av behandlingen beräknades som procentandelen levande celler i förhållande till levande kontrollceller behandlade endast med vehikel.
Djur
De experimentella procedurerna som används i denna studie godkändes av Animal Care and Ethics Committee vid Beijing University of Traditional Chinese Medicine (nr BUCM{{{{30}}}},018,{ {39}}60,419-2023) och överensstämmer med internationellt erkända principer för användning och skötsel av försöksdjur. Trettiosex 8-veckor gamla C57BL/6-hanmöss köptes från Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (SYXK (Jing), 2017–0{ {51}}33). Mössen placerades i ett speciellt patogenfritt djurlaboratorium i ett luftkonditionerat rum (ljus: 12-h ljus/mörkercykel; rumstemperatur: 25±1 grad; relativ fuktighet: 50± 10 procent) och slumpmässigt uppdelad i följande sex grupper: skengruppen, UUO-gruppen, ARB-gruppen och SK-grupperna med hög, måttlig och låg dos. UUO inducerades hos mössen i UUO-gruppen, ARB-gruppen och SK-grupperna med hög, måttlig och låg dos enligt en tidigare etablerad procedur. Anestesi inducerades med 2 procent isofluran och upprätthölls med 1,5 procent isofluran. Ett längsgående snitt från 1- till 2- cm gjordes i vänster mellandel, och den vänstra urinledaren separerades trubbigt, ligerades på två ställen och skars sedan mellan de två ligationerna. Därefter stängdes bukhålan, varefter analgesi gavs i 3 dagar. Mössen i skengruppen genomgick liknande kirurgiska ingrepp, inklusive pre- och postoperativ anestesi, laparotomi och trubbig separation av urinledaren, utan ureterligering och skärning. Från den andra dagen efter obstruktion administrerades losartan intragastriskt till mössen i ARB-gruppen i en dos av 0,13 mg/10 g (0,15 ml/10 g). SK i en hög dos på 0,08g/10g (0,13mL/10g), en måttlig dos på 0,04g/10g (0,13 ml/10g) eller en låg dos på 0,02g/10g (0,13mL/10g) gavs för att möss i SK-gruppen via svansvenen i 14 dagar efter ureterligering. Saltlösning (0,13 ml/10 g) gavs via svansvenen till mössen i sken-, UUO- och ARB-grupperna och koksaltlösning (0,15 ml/10 g) gavs via sondmatning till mössen i sken-, UUO- och SK-grupperna för att reducera partiskhet. Efter MRT samlades blod från mössen genom hjärtpunktion vid avlivning under djup bedövning (inducerad och bibehållen med 2 procent isofluran) på den 14:e dagen, och njurvävnad samlades upp. Serum erhölls från helblod genom centrifugering vid 1000 (× g) (4 grader) under 10 minuter. Nivåer av ureakväve i serum (BUN), SCr och cystatin C (Cys-C) mättes med den kolorimetriska metoden. Hematoxylin och eosin (HE) färgning och Sirius röd färgning utfördes för detektering av histopatologi och kollagen i stromala strukturer av den drabbade njuren, respektive. För HE-färgning blötlades skivorna i destillerat vatten efter avvaxning, blötlades i hematoxylinfärgningslösning (Solarbio Science & Technology, Kina) följt av 1 procent saltsyraalkohollösning för färgseparering, tvättades med kranvatten, blev blå och färgades med eosinfärgämne. De färgade skivorna tvättades med destillerat vatten, dehydrerades, rensades och förseglades med neutralt gummi. För Sirius röd färgning avvaxades skivorna, färgades med Harris hematoxylin, tvättades, färgades med Sirius rött (Solarbio Science & Technology, Kina), separerades direkt och dehydrerades med absolut etanol, rengjordes med xylen och förseglades. Fem synfält avnjur-cortex och proximal tubuli area valdes slumpmässigt ut för varje mus. ImageJ-programvaran användes för att beräkna det röda området, och det genomsnittliga röda området beräknades för att bestämma det rödfärgade området Sirius.
In vivo MRT för att utvärdera graden av njurfibrosMöss genomgick MRT på den 13:e dagen efter SK-administrering med ett 7T smådjurs MRI-system (Agilent 7T MRI-system) och kroppsspiral. Anestesi inducerades med 2 procent isofluran och upprätthölls med 1,5 procent isofluran. Mössen placerades i liggande position med buken centrerad i förhållande till mitten av radiofrekvensspolen och kopplades till en respiratorsensor för att övervaka andningen. Ett RAPID Rat Head System användes för radiofrekvensexcitering och signaldetektering. Alla skanningar utfördes under fri andning. Bilder togs med hjälp av diffusionstensoravbildningssekvenser (DTI) och parametrarna var följande: riktningar=30 (b=1004.7s/mm 2 ) plus noll (b=0s/mm 2), Δ=4ms och δ=16ms. Bildinsamlingsparametrarna var följande: TR/TE=3000ms/50,73ms, =60 grader, matris=128×128, FOV=2×2 cm och bildsnittstjocklek =1mm. Den totala varaktigheten för diffusionsberedningen var 4ms. En skanningsfördröjning på 16 ms applicerades mellan skanningarna och två b=0s/mm 2 skanningar införlivades för att begränsa effekterna av T1-avslappning. Den totala skanningstiden var cirka 1 timme. På grund av hydronefrosnjur-sstrukturella abnormiteter orsakade av ureteral obstruktion utvärderades endast den yttre cortexen och den yttre medullan av råttnjurvävnad för bildanalys. Fractional anisotropy (FA) kartor erhölls och beräknades med hjälp av VNMRJ4.0 programvara. För att noggrant mäta MRT-signalintensiteten och bestämma graden av fibros mellan olika grupper valdes fem skanningsplan ut för varje njurprov och tre små intressanta regioner valdes slumpmässigt ut för varje skanningsplan.
CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR-/NJURFUKTIONEN
Western blot-analysTotalt protein extraherades från celler med 5 00 μL RIPA-proteinlysbuffert (Solarbio, Peking, Kina). Efter centrifugering vid 10 000 (× g) i 10 minuter användes ett Bradford-proteinanalyskit (Applygen, Peking, Kina) för proteinkvantifiering. Ekvivalenta mängder protein (40 ug) denaturerades vid 100 grader i 10 minuter i laddningsbuffert (Applygen, Peking, Kina), separerades genom elektrofores på 8–10 procent SDS-PAGE-geler enligt relativ molekylvikt och överfördes till 0.{{ 10}}μm polyvinylidendifluoridmembran (Millipore, Bedford, MA, USA). Sedan blockerades membranen i blockeringsbuffert (Nacalai Tesque, Japan) vid 25±5 grader och inkuberades med primära antikroppar, inklusive -aktin (Proteintech Group, USA, 1:5000), -SMA (Proteintech Group, USA, 1: 1000), kollagen III (kol I) (Abcam, Storbritannien, 1:5000), STAT3 (Proteintech Group, USA, 1:2000), p-STAT3 (Tyr705) (Cell Signaling Technology, USA, 1:2000), JAK2 (Cell Signaling Technology, USA, 1:1000), p-JAK2 (Cell Signaling Technology, USA, Tyr1007) (1:1000) och Peroxiredoxin 5 (Prdx5) (Proteintech Group, USA, 1:800), kl. 4 grader över natten. Efter att ha tvättats i TBST inkuberades membranen med sekundär antikropp (Cell Signaling Technology, USA, 1:10000) under 1 timme vid rumstemperatur och tvättades sedan igen med TBST. Därefter användes ECL-detektionskit för exponering. Sedan avlästes den optiska densiteten för proteinbanden och analyserades med Image Lab™-mjukvara för kvantitativ analys. De densitometriska värdena normaliserades till densiteten för -aktinbandet.
Kvantitativ realtids-PCRTotalt RNA extraherades från celler ellernjur-vävnad med Monarch® Total RNA Miniprep Kit enligt tillverkarens instruktioner. Sedan användes GoScript Reverse Transcription System för att syntetisera första-strängs cDNA enligt manualen. Kvantitativ omvänd transkriptions-PCR i realtid utfördes i en 20-μL reaktion. Genetargeting-primers designades baserat på mRNA-sekvenser publicerade av NCBI och är listade i tabell 1. Relativ mRNA-förekomst bestämdes på basis av förhållandet mellan specifikt mRNA-uttryck och -aktin-mRNA-uttryck i samma prov, och veckändringen i förhållande till det i mössen i skengruppen eller cellerna i 0ng/mL TGF- 1-gruppen beräknades med 2 -ΔΔCt-metoden.
Statistisk analysAlla data från minst tre oberoende experiment uttrycks som medelvärdet ± standardfelet för medelvärdet (SEM). Statistisk analys utfördes med programpaketet SPSS 20.0. Normalitetstester och homogenitetstester för varians utfördes. Om data var normalfördelade användes Students t-test för att jämföra skillnaderna mellan de två grupperna, och envägsvariansanalys (ANOVA) (LSD-test för jämna varianser och Dunnetts test för ojämna varianser) användes för att jämföra skillnader mellan grupper. Om data inte var normalfördelade användes det icke-parametriska Mann-Whitney U-testet för att jämföra skillnaderna mellan två grupper, och det icke-parametriska Kruskal-Wallis-testet användes för att jämföra skillnaderna mellan fler än två grupper. P<0.05, p=""><0.01 or="" p="" <="" 0.001="" indicates="" a="" significant="">
Resultat
Effekt av SK på NRK-49F-cellviabilitet efter TGF- 1-behandling
TGF- är en fibrogenetisk nyckelcytokin involverad i njurfibros. Vi använde först olika doser av TGF- 1 (0, 10,20, 40 och 80ng/mL) för att stimulera tillväxten av NRK- 49F-celler. Behandling med TGF - 1 under 24 timmar ökade cellviabiliteten på ett dosberoende sätt (Fig. 1a), vilket överensstämmer med tidigare fynd som erhållits via MTT-analysen [17]. Gradientkoncentrationer av SK (1, 2, 4 och 8 mg/ml) reducerade signifikant förbättringen av livsduglighet inducerad av 10 ng/ml TGF- 1 (Fig. 1b) och effekten av behandling i 48 timmar var tydligare än behandlingen i 24 timmar. Detta resultat indikerade att SK kan undertrycka TGF- 1-inducerad njurfibroblasttillväxt och förbättring av viabiliteten in vitro.
SK hämmade TGF- -inducerat uttryck av -SMA och avsättning av ECM-komponenter i NRK-49F-cellerMyofibroblaster är aktiva fibroblaster som kännetecknas av uttryck av -SMA och ECM-avsättning. TGF- 1 är ett viktigt cytokin involverat i ECM-produktion av myofibroblaster och fibros [18]. Såsom visas i fig. 2a och b, både -SMA och kol. III uttrycktes i hög grad i NRK-49F-celler efter TGF- 1-behandling, vilket indikerar att de odlade cellerna omvandlades till aktiverade myofibroblaster när de administrerades TGF- 1. För att ytterligare undersöka om SK kunde undertrycka aktiveringen av njurinterstitiell fibroblaster, undersökte vi effekten av SK på -SMA och kollagen III-uttryck i NRK-49F-celler. SK-administration minskade markant uttrycket av -SMA (på ett dosberoende sätt) (Fig. 2 och 3a) och kol. III (Fig. 2), vilket tyder på att SK direkt kunde undertrycka TGF- 1-inducerad aktivering av NRK-49F-celler. Det fanns en tendens till att effekten av 4ng/ml SK för att minska det TGF- 1-inducerade uttrycket av -SMA och avsättningen av ECM-komponenter var överlägsen den för losartan (1 mg/L).
SK hämmade TGF- 1-inducerad STAT3, JAK2-aktivering och Prdx5-uttryck i NRK-49F-cellerFör att utforska de möjliga mekanismerna genom vilka SK hämmar fibroblastaktivering, upptäckte vi ytterligare STAT3- och JAK2-genuttryck och proteinnivåer i NRK-49F-celler med RT-qPCR respektive Western blotting. NRK-49F-celler uttryckte högre nivåer av STAT3- och JAK2-mRNA efter TGF- 1-stimulering än före behandling. SK inhiberade dramatiskt TGF-- 1--inducerat STAT3- och JAK2-mRNA-uttryck vid 24 timmar (Fig. 3b och c). Fosforylering av STAT3 vid Tyr705 och JAK2 vid Tyr1007 ökade i närvaro av TGF- 1. SK undertryckte också fosforyleringen av dessa två molekyler (Fig. 2). Prdx5, en JAK2/STAT3-vägregulator, uppreglerades i närvaro av TGF - 1, och denna uppreglering omvändes också av SK-behandling (Fig. 2). Nästan alla effekter, förutom den på fosforyleringen av JAK2 och uttrycket av kol. III, var mer robusta i högdos-SK-gruppen än i lågdos-SK-gruppen. Följaktligen verkar det klart att SK kan hämma TGF- 1-inducerad aktivering av NRK-49F-fibroblaster genom att reglera JAK2/STAT3-aktivering. Vid 2 ng/ml eller 4 ng/ml hade SK en bättre effekt för att förbättra TGF-- 1--inducerad STAT3- och JAK2-aktivering och Prdx5-uttryck än losartan.
SK lindrade UUO-inducerad njurdysfunktion och njurmorfologiska förändringarEn musmodell för njurfibros etablerades genom att inducera UUO. Figur 4 a, b, c visar njurdysfunktionsindexen för skengruppen, UUO-gruppen, ARB-gruppen och SK-grupperna med hög, måttlig och låg dos efter 14 dagars behandling. Den höga dosen av SK reducerade signifikant Cys-C-nivån (P Mindre än eller lika med 0.05; Fig. 4a) och SCr-nivåerna (P Mindre än eller lika med {{12} }.01; Fig. 4c), och SK minskade markant BUN-nivån vid alla doser (P Mindre än eller lika med 0,05 eller P Mindre än eller lika med 0,01; Fig. 4b). Ovanstående resultat antydde att SK förbättrade nedsatt njurfunktion och njurfibros och att effekterna av SK liknade effekterna av losartan. Renal HE-färgning visade att ackumulering av ECM, infiltration av inflammatoriska celler, dilatation och/eller atrofi av njurtubuli, degeneration och nekros av njurtubuli-epitelceller utan uppenbara förändringar i glomerulär struktur i UUO-gruppen (Fig. 4d). Nedsatt njurfunktion lindrades i olika grad i de olika behandlingsgrupperna jämfört med UUO-gruppen; den måttliga dosen och den höga dosen av SK uppnådde de bästa effekterna, även om graden av njurfunktion i skenoperationsgruppen inte uppnåddes i någon av behandlingsgrupperna.
SK minskade det fibrosrelaterade FA-värdet som upptäckts med DTISåsom illustreras av fig. 5 bestämdes FA-värdet som har ett linjärt samband med graden av fibros i verklig vävnad av in vivo DTI. Jämfört med det i skengruppen ökade FA-värdet i UUO-gruppen signifikant (P<0.01). the="" increase="" in="" in="" the="" fa="" value="" in="" the="" presence="" of="" ureteral="" obstruction="" conditions="" was="" significantly="" reversed="" in="" the="" arb="" and="" high-,="" moderate-,="" and="" low-dose="" sk="" groups="" compared="" to="" the="" uuo="" group="">< 0.01="" or="" p=""><0.001), with="" moderate-dose="" sk="" having="" the="" most="" significant="" effect="" (p=""><>
SK hämmade fibroblastaktivering och avsättning av ECM-komponenter i UUO-mössDessutom utvärderade vi uttrycket av fibroblastaktiveringsmarkören -SMA, fibroblastspecifikt protein -1 (FSP-1) och de klassiska ECM-komponenterna fibronektin (FN), kol. III och kollagen I (col I) i sken-, UUO- och SK-grupperna med måttlig dos med användning av realtids-PCR. Eftersom den måttliga dosen av SK är lika med den kliniskt rekommenderade dosen och eftersom den totala förbättringen i gruppen med måttlig dos var överlägsen den i grupperna med hög och låg dos, användes en måttlig dos av SK för att bedöma mRNA-uttryck. Såsom visas i fig. 7a och b, mildrade SK med måttlig dos signifikant ökningarna av -SMA, FSP, FN, kol. III och kol. Jag nivåer. Dessa resultat överensstämde med Siriusred-färgningsresultaten, som visade att det röda området av fibros i den drabbade njuren i ARB-gruppen och SK-gruppen med måttlig och låg dos var signifikant mindre än i den obehandlade gruppen (P<0.05) (fig.="" 6),="" indicating="" that="" sk="" decreased="" the="" number="" of="" col-="" lagen="" bundles="" in="" the="" affected="">
Effekt av SK på STAT3-, JAK2- och TGF-mRNA-nivåer och uttrycket av regulatoriska molekyler och suppressorn av cytokinsignaleringsproteiner (SOCS) SOCS1 och SOCS3 i UUO-mössSåsom visas i Fig. 7c var mRNA-nivåerna av TGF-, JAK2 och STAT3 signifikant förhöjda i UUO-gruppen jämfört med skengruppen på den 14:e dagen. Jämfört med skenmöss visade SK-behandlade UUO-möss med måttlig dos en markant minskning av JAK2- och TGF-mRNA-nivåer på den 14:e dagen efter obstruktion, men SK minskade inte signifikant STAT3-mRNA-nivåer efter UUO. Detta resultat antydde att effekten av SK på njurfibros och fibroblastaktivering i UUO-möss kan inträffa genom reglering av JAK2- och STAT3-aktivering utan förändringar i totalt STAT3-mRNA-uttryck. Nivån av TGF-, nedströmsmolekylen av STAT3, sänktes också av SK i samband med ureterligering. SOCS-proteiner anses vara avgörande för den negativa regleringen av JAK/STAT-signalering [19]. Som svar på UUO ökade SOCS1- och SOCS3-nivåerna signifikant och minskade signifikant med i SK-gruppen jämfört med modellgruppen (Fig. 7d). Detta resultat tyder på att SK skulle kunna undertrycka JAK/STAT-vägen för att minska uttrycket av dess negativa regulatoriska molekyler som återkoppling.
CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR-/NJÄRSMÄRTA
Diskussion
Renal tubulointerstitiell fibros är den ultimata vanliga vägen för njursjukdom i slutstadiet. Myofibroblaster, som härrör från en mängd olika celler, inklusive epitelceller, endotelceller och pericyter, genom epitelial-mesenkymal transdifferentiering (EMT) eller endotelial-mesenkymal transdifferentiering (EndoMT), kan hjälpa till att reparera skadad vävnad genom att producera ECM och -SMA generera kontraktil spänning [20]. Bland dessa olika celltyper är aktiverade interstitiell fibroblaster de huvudsakliga källorna till myofibroblaster, som står för 50 procent av dessa celler [21]. Förutom -SMA uttrycker aktiverade fibroblaster också specifikt FSP-1. TGF- definieras som en viktig drivkraft för njurfibros och har visat sig vara aktiverad i olika njursjukdomsmodeller och njurceller. Aktiverad TGF- binder till TGF-receptorn och inducerar nedströms signalmolekyler, inklusive molekyler och transkriptionsfaktorer relaterade till EMT, EndoMT, fibroblastaktivering, ECM-produktion och hämning av ECM-nedbrytning, genom Smad-inklusive TGF- [23], STAT3 aktiveras av Tyr-fosforylering vid Tyr705 genom Janus-kinaser. Det aktiverade STAT3-proteinet kommer in i kärnan i form av en dimer och binder till målgenen. Dessutom inducerar STAT3 TGF-signaltransduktion [24]. Faktum är att i UUO-modellen ökas aktiveringen av STAT3 vid Tyr705 i njurinterstitiell fibroblaster, tillsammans med histopatologiska lesioner och fibroblastaktivering, från den första dagen, toppar vid 7 dagar och stiger till 14 dagar [25]. STAT3 är sannolikt involverat i många typer av njursjukdomar genom reglering av uttrycket av målgener, särskilt de transkriptionsfaktorer som är involverade i utvecklingen av CKD. I den aktuella studien, den 14:e dagen efter obstruktion, ökade mRNA-nivåerna av -SMA, JAK2 och STAT3 signifikant med ökad grad av njurfibros.
Enligt tidigare forskning har SK och dess komponenter visat sig minska patologisk skada, hämma proliferation av endotelceller, lindra proteinuri och glomeruloskleros, skydda kvarvarande njurfunktion och sakta ner sjukdomsprogression, och därmed ingripa i CKD och progression av njurfibros; dock har det inte funnits några rapporter om fibroblastaktivering. Enligt tidigare studier och våra CCK-8-resultat användes 10 ng/mL TGF- 1 för att aktivera fibroblaster; 1, 2 och 4 mg/ml valdes ut som låga, måttliga och höga doser av SK; och 48 timmar valdes som interventionstid i denna studie. Uppreglering av -SMA och morfologiska förändringar åtföljda av cellproliferation och aktivering, vilket manifesterade sig som ökningar i cellviabilitet och ECM-produktion, inträffade i NRK-49F-celler efter TGF- 1-stimulering [26, 27]. I denna studie bekräftades det att TGF- 1 reglerade genuttrycket av -SMA och ECM genom att aktivera uppströms JAK2/STAT3-vägen. Våra data visade att SK direkt hämmade TGF- 1-inducerad NRK-49F-cellaktivering och ECM-produktion in vitro. Dessutom visade vi att SK kunde dämpa njurfibros i UUO-möss in vivo, vilket minskade interstitiell ECM-ackumulering på den 14:e dagen efter obstruktion. Dessa resultat indikerade att SK markant kunde dämpa njurfibros genom att hämma interstitiell fibroblastaktivering och minska -SMA-uttryck. Den potentiella mekanismen för den antifibrotiska effekten av SK är hämning av fibroblastaktivering genom reglering av JAK2/STAT3-signalvägen både in vitro och in vivo. Måttlig dos SK vände också signifikant uppregleringen av TGF- 1 inducerad av UUO, vilket tyder på att effekten av SK är relaterad till TGF-. Eftersom TGF- och STAT3 interagerar med varandra kan SK hämma STAT3 genom att rikta in sig på TGF-, nedreglera TGF- genom att rikta in sig på STAT3 eller hämma båda. Vår tidigare systemfarmakologistudie förutspådde STAT3 som en av de möjliga målmolekylerna för SK [28], och detta fynd verifierades i den aktuella studien. Vi använder losartan, en ARB
kan avsevärt dämpa njurfibros och njurtubulär cellapoptos genom att hämma fosforylering av signalproteinet STAT3 i en råttmodell av UUO [29], som ett positivt kontrollläkemedel. De tidigare resultaten överensstämmer med våra uppgifter. Peroxiredoxiner är en familj av merkaptanberoende peroxidaser som kan minska oxidativ stress genom att katalysera reduktionen av väteperoxid. Nivån av Prdx5 i råttnjuren minskade den första dagen efter UUO. Det har observerats att uttrycket av Prdx5 gradvis ökar fram till 5 dagar efter TGF-behandling. Överuttryck av Prdx5 visades hämma den TGF- -inducerade fosforyleringen av STAT3 och minska TGF-inducerad -SMA och FN-uttryck i NRK-49F-celler, vilket indikerar att Prdx5 negativt reglerar TGF- - inducerad STAT3-aktivering och fibros i NRK-49F-celler [12]. Den huvudsakliga regleringsmekanismen bakom endogen STAT3-signalering involverar SOCS-proteinfamiljen. Efter att STAT3 har aktiverats av cytokiner, transporteras STAT3-dimeren till nedströms målgener av nukleär induktion, inklusive SOCS [30]. Specifikt kan den kinashämmande regionen av SOCS1 direkt binda kan avsevärt dämpa njurfibros och njurtubulär cellapoptos genom att hämma fosforylering av signalproteinet STAT3 i en råttmodell av UUO [29], som ett positivt kontrollläkemedel. De tidigare resultaten överensstämmer med våra uppgifter. Peroxiredoxiner är en familj av merkaptanberoende peroxidaser som kan minska oxidativ stress genom att katalysera reduktionen av väteperoxid. Nivån av Prdx5 i råttnjuren minskade den första dagen efter UUO. Det har observerats att uttrycket av Prdx5 gradvis ökar fram till 5 dagar efter TGF-behandling. Överuttryck av Prdx5 visade sig hämma den TGF- -inducerade fosforyleringen av STAT3 och minska TGF- -inducerad -SMA och FN-uttryck i NRK-49F-celler, vilket indikerar att Prdx5 negativt reglerar TGF{{ 38}}inducerad STAT3-aktivering och fibros i NRK-49F-celler [12]. Den huvudsakliga regleringsmekanismen bakom endogen STAT3-signalering involverar SOCS-proteinfamiljen. Efter att STAT3 har aktiverats av cytokiner, transporteras STAT3-dimeren till nedströms målgener av nukleär induktion, inklusive SOCS [30]. Specifikt kan den kinashämmande regionen av SOCS1 binda direkt
till JAK2 och hämmar STAT3-fosforylering [31]. UUO-inducerad JAK/STAT-aktivering orsakar SOCS-uttryckshöjning [32]. Efter stimulering med 10 ng/mL TGF- 1 under 48 timmar ökade Prdx5-proteinuttrycket i NRK-49F-celler signifikant, vilket överensstämmer med tidigare resultat. SK (4 mg/ml) minskade signifikant Prdx5-proteinnivåerna efter 48 timmars intervention. På den 14:e dagen efter UUO var nivåerna av SOCS1 och SOCS3 mRNA i den påverkade njuren signifikant uppreglerade i UUO-gruppen jämfört med kontrollgruppen, vilket indikerar att aktiveringen av STAT3-signalering efter UUO inducerade uttrycket av SOCS1 och SOCS3 till negativt reglera den överaktiverade STAT3-signalen. Efter 14 dagars SK-intervention minskade nivåerna av SOCS1 och SOCS3 mRNA signifikant. Dessa resultat visade att istället för att direkt höja negativa regulatorer för att hämma JAK2/STAT3-signalering, hämmade SK JAK2/STAT3, vilket resulterade i nedreglering av de negativa regulatorerna Prdx5, SOCS1 och SOCS3. Således kan JAK2/STAT3 vara ett direkt terapeutiskt mål för SK för njurfibros.
MRT är en mycket säker metod för att bedöma strukturella och fysiologiska förändringar i njuren utan användning av intravenöst kontrastmedel [33, 34]. Diffusion-weighted imaging (DWI) är en välkänd MRT-metod som används för att avbilda molekylär rörelse eller diffusion som reflekterar förändringar i mikrostrukturen hos biologiska vävnader [35]. DTI är en ny avbildningsteknik utvecklad baserad på diffusionsviktad bildbehandling (DWI) som kan beskriva inte bara hastigheten på vattenmolekyler utan också riktningen för deras rörelse, nämligen anisotropi. Jämfört med DWI är DTI mer känslig och exakt när det gäller att återspegla förändringen i vattenspridning. DTI kan också ge ytterligare information om diffusionsriktningen och mängden uppmätt på basis av FA. Hueper et al. [36] visade att hos DN-råttor var FA relaterad till glomeruloskleros, interstitiell fibros och njurtubulär skada. Yan et al. [37] fann att FA kan vara en biomarkör för tidig DN. Kaimori et al. [38] observerade ett linjärt samband mellan FA-värdet och graden av verklig vävnadsfibros i en UUO-råttmodell. I denna studie har vi optimerat parametrarna för att minska skanningstiden, anestesitiden och förbrukningen av experimentella resurser. DTI-resultaten överensstämde med Sirius röd färgning när det gäller graden av njurfibros orsakad av UUO och förmågan hos SK att lindra njurfibros. Till viss del avslöjade dessa fynd att SK har en verklig effekt på njurfibros in vivo. I denna studie visade vi mekanismen genom vilken SK reglerar njurinterstitiell fibros både in vivo och in vitro. I framtida studier krävs användning av inhibitorer eller siRNA för att hämma JAK2/STAT3 för att ytterligare verifiera denna mekanism.
Slutsatser
Sammanfattningsvis tyder våra data på att SK effektivt kan hämma njurfibroblastaktivering och njurfibros hos UUO-möss genom att reglera JAK2/STAT3-signalvägen. Våra resultat ger en god förståelse för mekanismen för SK vid behandling av njursjukdom. De detaljerade molekylära mekanismerna för SK-behandling vid njurfibros kräver dock ytterligare utforskning.