Effekt av Sucrier-bananskalextrakt på hämning av melanogenes genom ERK-signalvägen
Apr 25, 2023
Abstrakt
Hyperpigmentering är en typ av pigmentstörning inducerad av överuttryck av melanininnehåll aktiverade allvarliga estetiska problem såsom melasma, fräknar, efelid, lentigo och andra former på mänsklig hud. Flera blekningsmedel har begränsad användning på grund av deras biverkningar eller stabilitet, såsom kojinsyra, askorbinsyra och hydrokinon kan fungera som cytotoxiska substanser associerade med dermatit och hudcancer. För att hitta en säker substans syftade denna studie till att hitta förmågan hos flera komponenter i Sucrier bananskalsextrakt (SBP) att hämma melanogenesprocessen genom p38-signalvägen i B16F10-musmelanomceller. Tyrosinasaktiviteten och det cellulära melanininnehållet var dosberoende sätt som minskade efter SBP-behandling. Dessutom minskade SBP uttrycket av melanogenesrelaterade proteiner som en mikroftalmiassocierad transkriptionsfaktor (MITF) och tyrosinasprotein efter 24 timmars inkubation med -melanocytstimulerande hormoner (MSH) stimulerande. Fynden visade att SBP innehöll ett effektivt medel för hyperpigmenteringshämmare genom p38-signalvägar utan någon effekt på ERK-vägen, och därefter nedreglerar MITF-uttryck och produktion av tyrosinasenzymfamiljen.
Enligt relevanta studier,cistancheär en vanlig ört som är känd som "mirakelörten som förlänger livet". Dess huvudkomponent ärcistanosid, som har olika effekter som t.exantioxidant, antiinflammatorisk, ochfrämjande av immunförsvaret. Mekanismen mellan cistanche och blekning av huden ligger i antioxidanteffekten av cistancheglykosider.Melanini mänsklig hud produceras genom oxidation av tyrosin katalyserad av tyrosinas, och oxidationsreaktionen kräver deltagande av syre, så de syrefria radikalerna i kroppen blir en viktig faktor som påverkar melaninproduktionen.Cistancheinnehåller cistanosid, som är en antioxidant och kan minska genereringen av fria radikaler i kroppen, alltsåhämmar melaninproduktionen.
Klicka på Var kan jag köpa Cistanche
För mer information:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
Nyckelord:sucrier bananskal; fenoliska föreningar; tyrosinas; mikroftalmi-associerad transkriptionsfaktor; melanogenes
Introduktion
Melanin produceras i melanosomen som är en viktig organell inuti melanocytcellerna. Melanocyt är belägen i det basala lagret av hudens epidermis. Efter produktionsprocessen är melanin pigmentet som ansvarar för hud-, hår- och ögonfärgning som fungerar som en naturlig antioxidant, avgiftningsmedel och kraftfull katjonkelator och som också kan fungera som universellt skydd mot UV-skador [1]. Onormal melaninproduktion kan orsaka pigmentstörningar som hypopigmentering och hyperpigmentering. Hypopigmentering orsakar vitiligo, albinism och onormala hårproblem medan hyperpigmentering orsakar fräknar, melasma, åldersfläckar och postinflammatorisk hyperpigmentering. Genetisk predisposition, hormonella förändringar, särskilt östrogen, även andra såsom leversjukdom, tumör, cancer, undernäring eller oregelbunden funktion av hypofysen är de inneboende faktorerna inklusive yttre faktorer som UV-exponering, och toxiska ämnen är den främsta orsaken till hyperpigmentering [2] .
Tyrosinas är ett hastighetsbegränsande stegenzym som inriktar sig på processen att både stimulera och hämma melaninproduktionsprocessen. Melaninstimulering används som garvningsmedel eller hårdepigmenteringsbehandling. Tyrosinasuttryck kontrolleras av mikroftalmiassocierad transkriptionsfaktor (MITF) som är en melanocytspecifik transkriptionsfaktor som kontrollerade melanocytdifferentiering, proliferation och överlevnad [3, 4]. MITF:s ansvar för melanogenes är att öka tyrosinasexpression genom att binda till DNA i strukturen av homodimer eller heterodimer med MiT-protein, dessa bindningsställen involverar E-Box och M-Box som flankerar tymidinnukleotid som stimulerar de kontinuerliga stegen till produktion av melanogen enzym. såsom tyrosinasrelaterat protein 1 (TRP-1), tyrosinasrelaterat protein-2 (TRP-2) och dopakromtautomeras. Reglering av MITF startar från signaltransduktion efter att -MSH binder till MC1R-receptorn som stimulerar mitogenaktiverat proteinkinas (MARKs) som är serin/treoninkinas och inkluderar även extracellulärt signalreglerat kinas (ERK) och även p38. Flera studier fann att melaninsyntesen kontrolleras av flera signalvägar såsom fosfotidylineasital-3-kinas (PI3K/AKT) kan undertryckas av naturliga substanser som innehåller polyfenolgrupper genom ERK-signalvägen från B16F10 musmelanomceller [5,6 ].
Denna studie syftade till att hitta effekten av melanogeneshämning från Sucrier bananskal (SBP) extrakt. SBP kan innehålla flera typer av polyfenoliska föreningar som fungerar som tyrosinashämmare såsom katekin, procyanidin, ferulsyra och gallussyra som detekteras genom uttryck av ERK-signalvägar som påverkar produktionen av melanogena enzymer som TRP-1 och TRP-2 [7-10].
Material och metoder
Kemikalier och material
Rivade (7 dagar efter skörd) skal av Sucrier banan (Musa spp.) från Kampangpetch-provinsen, Thailand. Tvättade bananskal med vatten och sedan solbakade tills de är helt torkade, malda med mixer och extraherade genom blötläggning med 60 procent metanol i 24 timmar (MW24), centrifugerade med 95 procent etanol i 10 minuter vid 4 grader (E4), kokande i DI vatten vid 60 grader i 20 minuter (W60) och koka i 95 procent metanol vid 60 grader i 20 minuter (M60). Nästa steg var att minska volymen med en rotationsindunstare vid 40 grader och att torka med frystork Christ Alpha- 4 LD plus.
Cell kultur
B16F10 musmelanomceller odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum vid 37 grader i ett inkuberat med 5 procent CO2. Efter 24 timmars inkubation, bytte sedan mediet till serumfritt medium med olika koncentrationer av Sucrier bananskal (SBP) extrakt med -MSH-stimulering. Sedan skördades celler genom trypsinisering för nästa experiment.
Cellviabilitetsanalys
Cytotoxicitet för SBP-extrakt mättes med MTT-analys. Cellerna (5 ×10 3) såddes till plattor med 96 brunnar och odlades i DMEM under 24 timmar vid 37 grader i en inkuberad med 5 procent CO2 och bytte sedan mediet till serumfritt medium med olika koncentrationer av SBP-extrakt för 48 timmar. Efter behandling, kasserade mediet och tvättades två gånger med kall PBS, sattes 100 ul MTT-lösning (5 mg/ml) till varje brunn, inkuberades vid 37 grader i 4 timmar och mättes sedan med ELISA-läsaren vid 420 nm.
Analys av melanininnehåll
Skördade celler lyserades i kall lyseringsbuffert (20 mM natriumfosfat pH 6,8, 1 procent tritonX-100, 1 mM PMSF och 1 mM EDTA) och centrifugerades sedan 1 200 rpm vid 4 grader i 10 minuter för att separera supernatanten medan melaninpellets löstes i 200 ul IN NaOH under 60 minuter vid 80 grader. ELISA-läsare användes för att mäta absorbansen vid 415 nm. och beräknat jämfört med proteininnehållet från bicinchoninsyra (BCA) proteininnehållsanalys (Pierce Biotechnology, Packford, IL, USA).
Western blot-analys
Supernatant som separerades under fortskridandet av celllys togs för att fraktioneras på SDS-PAGE och överfördes sedan till Hybond-förstärkt kemiluminescensnitrocellulosamembran (Amersham, Little Chalfont, Storbritannien) och sond med primär antikropp mot tyrosinas (Santa Cruz, Biotechnology, Santa Cruz , CA, USA), MITF (Merck Millipore Darmstadt, Tyskland), ERK (Merck Millipore Darmstadt, Tyskland), P38 (Merck Darmstadt Millipore, Tyskland) och monoklonala antikroppar mot B-Actin (AC-15, Sigma Aldrich ). Från och med då, inkubera membranet med pepparrotsperoxidas-konjugerad sekundär antikroppskomplexvisualisering och kvantifierade signalerna med ImageJ-programvara.
Statistisk analys All information analyserades med medel ± standardavvikelse (SD). Envägs ANOVA-testet används för att mäta skillnaderna mellan varje uppsättning information. Ett P-värde mindre än 0.05 ansågs vara statistiskt signifikant.
Resultat
Fenolförening
Syftet med detta experiment var att mäta effektiviteten av de lösningsmedel som används för extraktion och även en metod som kan extrahera fenolföreningar så mycket som möjligt. De flesta fenolföreningar löser sig mycket bra när de extraheras med högpolära lösningar som vatten, metanol (MeOH), etanol (EtOH), aceton, etylacetat, propanol, ättiksyra eller deras blandning i olika portioner [11]. Figur 1A visar att W60 kan extrahera fenolföreningar så mycket som 16,24 µg/ml följt av M60, E4 och MW24 med totalt fenol 13,89, 9,21 respektive 8,38 µg/ml. Cytotoxicitet hos SBP experimenterades med MTT-reduktionsanalys som mätte reduktionsmiljön från den mitokondriella funktionen hos levande celler genom att mäta formazanbildningen för att komma åt cytotoxiska effekter. Resultatet fann att SBP vid indikerade koncentrationer (upp till 500 µg/ml) med 48 timmars inkubation. Cytotoxicitet visar ingen signifikant effekt efter SBP-behandling (Fig. IB).
Effekterna av SBP på enzymaktivitet och melanininnehåll i B16F10-celler
För att testa undertryckande av melanogenes av SBP var det första steget att testa förmågan att hämma svamptyrosinasenzym jämfört med kojinsyra som är ett kommersiellt blekningsmedel. SBP (MW24) har högre effekt än Kojic acid och andra extraktioner vid samma koncentration (100-500 µg/ml). MW24 har den högsta andelen tyrosinasinhibering (66.39-77.05 procent) medan kojinsyra endast har en procentandel av tyrosinasinhibering vid 44.68-59.93 procent som visas i Fig. 1C. Från och med då valdes MW24 med den högsta andelen tyrosinasinhibering för anti-melanogenesmätning genom melaninproduktion från B16F10-celler. Melaninhalten i B16F10-celler reducerades efter SBP (MW24)-behandling (Fig. 2A). Mängden melaninhalt i B16F10-celler minskar signifikant efter stimulering med -MSH och behandlad med SBP (MW24) under 24 timmar på ett dosberoende sätt som visas i Fig. 2B.
Effekter av SBP (M24) på proteinuttrycksnivåerna av tyrosinas och MITF
Western blot-analys användes för tyrosinas- och MITF-aktivitet genom att mäta proteinuttrycksnivåer efter att ha behandlats med SBP (MW24) under 24 timmar. Reglering av melanogena enzymer såsom TRP-1 och TRP-2 resulterade från transkriptionseffekten av MITF och tyrosinasproteinnivå. Resultaten visar att SBP (MW24) kunde dosberoende nedreglera både tyrosinas- och MITF-proteinuttryck som visas i fig 3.
Effekt av SBP (M24) på melanogeneshämning genom mitogenaktiverat proteinkinas (MAPK) signalväg
I melanogenes är MAPKs kinasfamilj, särskilt ERK och p38, direkt relaterade till denna procedur [12]. ERK-signaleringen kommer att nedregleras medan p38-signaleringen kommer att uppregleras under förekomsten av melaninproduktion. Emellertid kommer fosforylering av ERK och p38 att ha en omvänd procedur för melaninproduktion. Resultaten visade en tydlig effekt efter SBP (MW24)-behandling med -MSH aktiverad genom immunoblotting till MAPK-signalvägen. SBP (MW24) minskade något p38-proteinuttryck och uppreglerade fosforylering av p38. Detta resultat visade sättet att hämma melanogenesprocessen genom p38-vägen utan någon effekt på ERK men fosforylering av ERK-proteinnivån minskade något efter -MSH och SBP (MW24) behandling som visas i Fig. 4.
Diskussion
Sucrier bananskal är jordbruksavfall som har ett överflöd av många aktiva ingredienser, särskilt i gruppen fenolföreningar och karotenoider som är den sekundära metabolit som växter skapar för självförsvarsmekanismer [7]. Dessa ämnen kan hittas i löv, bark, frukter, skal och frön av nästan alla växter. Fenolföreningar och karotenoider är fytokemiska ämnen som har goda egenskaper för människors hälsa. Ämnena består av antiinflammatoriska, antivirala, analgetiska, antioxidanter, anti-cancerframkallande, etc [13]. I allmänhet kan fenolföreningar lösas väl i högpolära lösningsmedel. För experimentet bör extraktion av MW24 kunna extrahera fenolföreningarna mest på grund av proceduren för extraktion från Folin-Cicualteu-analysen. Lågpolära föreningar extraherades först och följt av högpolära ämnen beroende på det slutliga blandningsförhållandet av lösningsmedel i proceduren. Resultaten visar att W60 kan extrahera fenolföreningar mest, möjligen på grund av en temperatur på 60 grader Celsius som kan vara den lämpliga temperaturen för att extrahera fenolföreningar [11]. Man kan också anta att SBP kan innehålla högpolära ämnen som löser sig väl i vatten. Vid jämförelse av mängden totala fenolföreningar som visas i Fig. 1A, W60, M60, E4 och MW24 visades möjligheten till substanslöslighet, signifikant.
Efter att den totala mängden fenolförening var känd, kan vi gå vidare med att fastställa typen och mängden av flavonoid- och karotenoidämnen. Vi fann SBP (MW24)-extrakt innehåller så högt ferulsyra som 906,62 mg/100g och fann även en liten mängd lutein och -karoten som kategoriserades i karotenoidgruppen till 1,23 respektive 2,37 mg/100g. SBD (MW24) har fortfarande en hög andel tyrosinashämning. Därför valdes SBP (MW 24) ut för vidare studier.
Från cytotoxicitetstestning hittades ingen signifikant cytotoxisk från SBP även om mängden användningskoncentration var upp till 500 µg/ml. möjligen för att den lilla mängden karotenoid i extraktion har förmågan att skydda celler. Ämnen i denna grupp har antioxidantegenskaper som kan avsluta gift genom Cytokrom P-450, särskilt -karoten som har en stimulerande roll i immunfunktioner genom att interagera med Reaction Oxygen Species (ROS). Detta kommer att stödja effektiviteten av en fenolisk förening som har ROS-rensande effekt för att minska inflammatoriskt cytokin [14]. Så, SBD (MW24) har inte bara ingen toxisk effekt, den har också rollen som cellskydd.
Vår studie fann också att SBP (MW24) har förmågan att hämma melanogenesen av B16F10-celler. Uttrycket av tyrosinas och MITF reducerades efter SBP (MW24)-behandling i båda bedömda med svamptyrosinas och Western blot-analys på ett dosberoende sätt. Detta test indikerade att SBP (MW24) kan undertrycka skapandet av melanin genom att nedreglera p38-signalvägen och uppreglera fosforylering av p38 som aktiverar MITF-proteinnedbrytning och sedan effekt för att minska uttrycket av melanogen enzymfamilj som tyrosinas. Suppression av p38 minskar funktionerna i cAMP Response Binding Protein (CREB), vilket är en viktig transkriptionsfaktor som fungerar med PAX3 och SOX10 som fäster till M-BOX av MITF-genen för att aktivera MITF-proteinuttryck som påverkar melaninproduktionsprocessen och cellernas överlevnadsaktivitet [15 ]. Generellt sett leder aktivering av ERK till fosforylering av MITF vid serin 73, vilket orsakar ubiquitination och så småningom nedbrytning. De flesta naturliga föreningar kan hämma melanogenes genom stimuleringsprocessen av ERK-signalvägen, men SBP (MW24) påverkades inte signifikant ERK-signalvägen [16].
Många forskning fann att fenolföreningar och karotenoider kan hämma produktionen av melaninpigment eftersom betakaroten har förmågan att absorbera UVB-fotoner samtidigt som det har egenskapen hos den lipidlösliga antioxidanten och fenolföreningar kan aktivera Nrf2, blockera ROS-receptorer, minska inflammatorisk cytokinproduktion och inducerar y-GSC-uttryck som stödjer vår studie men på det olika sättet för melanogeneshämning [17]. Annat än att ferulsyra som finns i SBP (MW24) var huvudämnet inom gruppen av fenolföreningar, bekräftat av flera studier att den har egenskapen anti-melanogenes eftersom den kan modulera uttryck av vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF), inducerar kväveoxid syntas, fungerar som tumörsuppressorgen och relaterar även till förfarandet för produktion av melaninpigment. I SBP (MW24)-lösning kan ferulsyra öka effektiviteten när den blandas med karotenoid eller andra fosfolipider eftersom vattenlösligheten, lipidlösligheten och biotillgängligheten kommer att öka vilket resulterar i att melanogeneshämningen av B16F10-celler förbättras [18]. Innebörden av alla resultat drar slutsatsen att SBP (MW24) kan reducera melanogenes effektivt.
Förkortningar
MITF: mikroftalmi-associerad transkriptionsfaktor; -MSH: -melanocyter stimulerande hormon; MC1R: melanokortin-1-receptor; TRP1: tyrosinasrelaterat protein 1; TRP2: tyrosinasrelaterat protein 2; MAPK: mitogenaktiverat proteinkinas.
Erkännanden
Detta arbete stöddes av anslag från Royal Golden Jubilee Ph.D.: RGJPHD. Thailand. (PH.D./0017/2558).
Författarbidrag
RH, KT, KS och UP utformade och designade experimenten; RHCHL och MC utförde experimenten; RH och MC och CHL analyserade data; RH bidrog med reagens/material/analysverktyg; RH och CHL skrev tidningen.
Konkurrerande intressen
Författarna har förklarat att det inte finns något konkurrerande intresse.
Referenser
1. Regnault MR, Gadaud N, Boulinguez S, Tournier E, Lamant L, Gladieff L, et al. Kemoterapirelaterad retikulerad hyperpigmentering: en fallserie och genomgång av litteraturen. Dermatologi 2015; 231: 312-8.
2. Ali A. Dermatology A Pictorial Review. McGraw Hill Education 2010. ISBN978-0-07-179323-0.
3. Garraway LA, Widlund R, Rubin MA, Getz G, Berger AJ, Ramaswamy S, Beroukhim R, et al. Integrativa genomiska analyser identifierar MITF som en onkogen för överlevnadslinje förstärkt i malignt melanom. Nature 2005; 436: 117–22.
4. Busca R, Ballotti R. Cyclic AMP en nyckelbudbärare i regleringen av hudpigmentering. Pigment Cell and Melanoma Research 2000; 13: 60-9.
5. Zhou J, Ren T, Li Y, Cheng A, Xie W, Xu L, et al. Oleoyletanolamid hämmar melanocytstimulerande hormonstimulerad melanogenes via ERK, Akt och CREB signalvägar i B16 melanomceller. Oncotarget 2017; 8: 56868-79.
6. Onkoksoong T, Jeayeng S, Poungvarin N, Limsaengurai S, Thamsermsang O, Tripatara P, Akarasereenont P, Panich U. Thai herbal antipyretic 22 formula (APF22) hämmar UVA-medierad melanogenes genom aktivering av Nrf2-reglerad antioxidant försvar. Fytoterapiforskning 2018; 32: 1546-54.
7. Singh B, Singh JP, Kaur A, Singh N. Bioaktiva föreningar i banan och deras associerade hälsofördelar - En recension. Livsmedelskemi 2015; 1: 1-11.
8. Leerach N, Yakaew S, Phimnuan P, Soimee W, Nakyai W, Luangbudnark W, Viyoch J. Effekt av thailändsk banan (Musa AA-grupp) för att minska ansamlingen av oxidationsslutprodukter i UVB-bestrålad mushud. Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology 2017; 168: 50-58.
9. Hung BY, Kim SY, Jung JM, Won CH, Choi JH, Lee MW. Det antimykotiska medlet clotrimazole hämmar melanogenes genom att accelerera ERK och PI3K-/Akt-medierad tyrosinasnedbrytning. Experimentell dermatologi 2015; 24: 381-400.
10. Shen T, Heo SI, Wang MH. Involvering av signalvägen p38 MAPK och ERK i den anti-melanogena effekten av metyl-3,5--kaffeoylkinat i B16F10-musmelanomcell. Kemisk-biologisk interaktion 2012; 199: 106-11.
11. Ruesgas-Ramón M, Figueroa-Espinoza MC, Durand E. Användning av djupa eutektiska lösningsmedel (DES) för extraktion av fenoliska föreningar: översikt, utmaningar och möjligheter. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2017; 10: 3591-3601.
12. Tsao YT, Kuo CY, Kuan YD, Lin HC, Wu LH, Lee CH. Extrakten av Astragalus membranaceus hämmar melanogenes genom ERK-signalvägen. International Journal of Medical Sciences 2017; 3: 1049-53.
13. Chang TS. En uppdaterad recension av tyrosinashämmare. International Journal of Molecular Sciences 2009; 26: 2440-75.
14. Juturu V, Bowman JP, Deshpande J. Övergripande hudtons- och hudljusförbättrande effekter med oralt tillskott av lutein- och zeaxanthinisomerer: en dubbelblind, placebokontrollerad klinisk prövning. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology 2016; 7: 325-332.
15. Bell RE, Levy C. De tre m:n: melanom, mikrooftalmiassocierad transkriptionsfaktor och mikroRNA. Pigmentcellsmelanomforskning 2011; 24: 1088–106.
16. Zhou J, Ren T, Li Y, Cheng A, Xie W, Xu L, Peng L. Oleoyletanolamid hämmar -melanocytstimulerande hormonstimulerad melanogenes via ERK, Akt och CREB signalvägar i B16 melanomceller. Oncotarget 2017; 23: 56868-79.
17. Toews DPL, Hofmeister NR, Taylor SA. Evolutionen och genetiken för karotenoidbearbetning hos djur. Trender inom genetisk 2017; 33: 171-182.
18. Li L, Liu Y, Xue Y, Zhu J, Wang X, Dong Y. Framställning av ett ferulsyra-fosfolipidkomplex för att förbättra löslighet, upplösning och B16F10 cellulär melanogeneshämmande aktivitet. Chemistry Central Journal 2017; 22: 11-26.
För mer information: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
