3.2. Effekt av mediatorkoncentration på melaninavfärgning av LMS

Enligt relevanta studier,cistancheär en vanlig ört som är känd som "mirakelörten som förlänger livet". Dess huvudkomponent är cistanosid, som har olika effekter som t.exantioxidant, antiinflammatorisk, ochfrämjande av immunförsvaret. Mekanismen mellan cistanche ochblekning av hudenligger i antioxidanteffekten av cistancheglykosider. Melanin i mänsklig hud produceras genom oxidation av tyrosin som katalyseras av tyrosinas, och oxidationsreaktionen kräver deltagande av syre, så de syrefria radikalerna i kroppen blir en viktig faktor som påverkar melaninproduktionen. Cistanche innehållercistanosid, som är en antioxidant och kan minska genereringen av fria radikaler i kroppen, alltsåhämmar melaninproduktionen.

Klicka på Var kan jag köpa Cistanche

För mer information:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Effekten av mediatorkoncentrationen på avfärgningsutbytet med LMS undersöktes (Figur 3). LMS som använde lacT och 100 µM acetosyringon visade det högsta avfärgningsutbytet, som var 4,4- gånger högre än utan mediatorn. LMS som använde lacM och 100 µM acetosyringon visade det högsta avfärgningsutbytet, vilket var 6,7- gånger högre än utan mediatorn. När lacT användes för LMS ökade avfärgningsutbytena med användning av acetosyringon, syringaldehyd och acetovanillon med ökande koncentration och nådde sedan ett maximum vid koncentrationer på 100, 50 respektive 200 µM (Figur 3a). Acetosyringon och syringaldehyd förbättrade mer effektivt avfärgningsutbytet vid en lägre koncentration än acetovanillon. När spets användes för LMS var effekten av mediatorkoncentration mycket lik resultatet som erhölls med lacT. Avfärgningsutbytena med användning av acetosyringon, syringaldehyd och acetovanillon nådde ett maximum vid koncentrationer av 100, 50 respektive 200 µM (Figur 3b). En mediatorkoncentration på över 200 µM minskade avfärgningsutbytet signifikant (data ej visade). Därför valdes en mediator på 100 µM som den optimala koncentrationen för följande experiment. Lloret et al. rapporterade att den optimala mediatorkoncentrationen bör användas eftersom laccas kan inaktiveras av en hög koncentration av mediator [6], medan Khammuang och Sarnthima rapporterade att melaninavfärgningsaktiviteten hos LMS med vanillin och vaniljsyra inte påverkades signifikant av höga koncentrationer av till 10 mM [28]. Den optimala mediatorkoncentrationen kan vara beroende av mediatortypen och målföreningen för den lackaskatalyserade reaktionen [5,6]. När LMS katalyserade nedbrytningen av isoproturon, ökade nedbrytningsutbytet med ökande koncentrationer av acetosyringon, medan koncentrationerna av vanillin och syringaldehyd inte var relaterade till nedbrytningsutbytet [7].

3.3. Cytotoxicitet hos naturliga mediatorer

För att använda naturliga mediatorer som hudblekande kosmetiska ingredienser undersöktes cytotoxiciteten hos mediatorer (acetosyringon, syringaldehyd och acetovanillon) med hjälp av B16F10 melanomcellinjen. De naturliga mediatorerna behandlades på de odlade cellerna och cellviabiliteten mättes med NR-analysen. När mediatorer på över 22 mM sattes till de odlade cellerna minskade de cellviabiliteten avsevärt (Figur 4). När koncentrationen av mediatorn var högre än 5 mM ökade cellviabiliteten i följande ordning: acetosyringon > syringaldehyd > acetovanillon. Vidare visade mediatorer på mindre än 1 mM ingen hämmande effekt på B16F10 melanomceller. Dessa resultat indikerar att den optimala mediatorkoncentrationen på 0,1 mM som användes i detta arbete visade försumbar cytotoxicitet.

3.4. Effekten av pH på melaninavfärgning med LMS

Figur 5 visar effekten av pH på LMS-avfärgningsutbytet. Avsaknaden av en mediator visade det högsta avfärgningsutbytet vid pH 4, och avfärgningsutbytet minskade med ökande pH (Figur 5a). Denna profil liknar effekten av pH på laccaskatalyserad ABTS-oxidation [37]. I allmänhet har lacT optimal aktivitet vid sura förhållanden under pH 5, och dess aktivitet minskar med en ökning av pH. Vid högre pH kombineras hydroxidanjonerna med T2/T3-koppar av lacT och stör elektronöverföringen och orsakar en minskning av katalytisk aktivitet. Emellertid är effekten av pH på LMS mer komplicerad och kan påverkas av aktiviteten och stabiliteten hos laccas och oxiderade mediatorer [1,7]. Avfärgningsutbytet av lacT med acetosyringon ökade med ökande pH upp till 7 (41 procent). De optimala avfärgningsutbytena av lacT med syringaldehyd och acetovanillon var 32 procent respektive 42 procent vid pH 6. Även om bristen visade lägre katalytisk aktivitet vid högre pH, ökade melaninavfärgningen med ökande pH. Dessa resultat kan förklaras av den höga aktiviteten och stabiliteten hos de oxiderade formerna av naturliga mediatorer vid högt pH.

lacM utan mediator visade det högsta avfärgningsutbytet vid pH 6, och lacM visade ett lägre avfärgningsutbyte i alla pH-områden jämfört med det senaste. Det optimala pH-värdet för spetsar var ungefär 6 för oxidation av ABTS [38]. Därför var det optimala pH-värdet för lacM utan mediator liknande det för lacM för ABTS-oxidation. När de naturliga mediatorerna användes med lacM, var avfärgningsutbytena starkt beroende av reaktionens pH (Figur 5b). Avfärgningsutbytet av lacM med naturliga mediatorer ökade med ökande pH upp till pH 7. De maximala avfärgningsutbytena för lacM med acetosyringon, syringaldehyd och acetovanillon var 40 procent, 32 procent respektive 33 procent vid pH 7. Det höga melanin avfärgningsaktivitet vid neutralt pH gör användningen av LMS med naturliga mediatorer bättre för huden eftersom det optimala pH-intervallet liknar det för normal hud (cirka 5,5).

3.5. Kinetisk studie av melaninavfärgning av LMS

En kinetisk studie av melaninavfärgning av LMS med acetosyringon undersöktes kvantitativt för att förstå den förstärkande effekten av naturliga mediatorer (tabell 1). Km-värdet för lacT utan mediator var 10,6- gånger högre än det för lacT med acetosyringon. Detta betyder att affiniteten för melanin förstärktes kraftigt genom användningen av en mediator. Cat-värdet för lacT med mediatorn var 22,6- gånger högre än för lacT utan mediator. Detta indikerar att avfärgningshastigheten ökades signifikant av mediatorn. Specificitetskonstanten (kcat/Km) för lacT ökades 247 gånger genom att använda acetosyringon som mediator. Dessa resultat visar tydligt att den begränsade tillgången för melanin till det aktiva stället för laccase övervanns av acetosyringon. Km-värdet för lacM utan mediator var 2,4- gånger högre än det för lacM med acetosyringon. Melanins affinitet kan förstärkas genom att använda en mediator. Den ökande effekten för melaninaffinitet av lacM med acetosyringon var dock lägre än den av lacT med acetosyringon. Kattvärdet för spets var cirka 26 procent av det på senare tid. Spetsen utan mediator visade mycket låg aktivitet för melaninavfärgning. Emellertid var cat-värdet för lacM med mediatorn 161-faldigt högre än för lacM utan mediator. Avfärgningshastigheten med lacM ökades signifikant av mediatorn. Därför ökades specificitetskonstanten för spets 334 gånger med användning av acetosyringon som mediator. Dessa resultat visar användbarheten av acetosyringon som en mediator av laccaser för melaninavfärgning.

3.6. Avfärgning av melanin/cellulosafilmen av LMS

En melanin/cellulosakomposithydrogelfilm framställdes för att efterlikna melanin i huden. Melanin/cellulosahydrogelfilmen kunde framställas genom samupplösning av melanin och cellulosa i [Emim][Ac], vilket följs av regenerering med vatten. Den erhållna filmen uppvisade en transparent mörkbrun färg. Avfärgningen av melanin/cellulosahydrogelfilmen utfördes med lacM med acetosyringon i 0,1 M citronsyrafosfatbuffert (pH 5,5). Färgen på melanin/cellulosafilmen ändrades från mörkbrun till ljusbrun efter den LMS-katalyserade reaktionen (Figur 6a). När absorbansen av melanin/cellulosafilmen mättes efter avfärgningsreaktionen i intervallet 400–700 nm, minskade absorbansen av melanin/cellulosafilmen signifikant över hela våglängdsområdet (Figur 6b). Avfärgningen av melanin bekräftades också genom mätning av färgvärden (L*, a* och b*) för melanin/cellulosafilmen med användning av en kolorimeter. ∆L, ∆E, YI och WI-värdena beräknades från färgparametrarna (tabell 2). Efter melaninavfärgningsreaktionen med LMS ökades L*-värdet (ljushet) för melanin/cellulosafilmen avsevärt, medan värdena för a* (rodnad) och b* (gulhet) minskade något. ∆E-värdet som representerar färgskillnaden mellan proverna var 31,1. Ett ∆E-värde större än 12 indikerade att färgerna på filmen före och efter reaktionen skiljer sig ganska mycket från varandra [31]. Gulheten (YI) av filmen minskade från 209 till 92 efter avfärgningsreaktionen, medan vitheten (WI) ökade från 16 till 43. Łopusiewicz et al. rapporterade att YI för poly(mjölksyra)/melaninfilm ökade med ökande melaninhalt, medan WI av filmen minskade [32]. Därför förklarar förändringarna i färgegenskaperna kvantitativt avfärgningen av melanin i melanin/cellulosahydrogelfilmen. Dessa resultat visar att LMS effektivt kan avfärga melanin i en cellulosahydrogelmiljö.

3.7. Avfärgning av naturligt melanin som produceras av melanomceller

Naturligt melanin i mänsklig hud är uppdelat i eumelanin (svart till brunt) och pheomelanin (gult till rött), medan det syntetiska melanin som framställs genom oxidation av tyrosin med väteperoxid är en analog av eumelanin. Därför undersöktes även avfärgningen av naturligt melanin som produceras av melanomceller i detta arbete. Avfärgningen av syntetiskt melanin och naturligt melanin av LMS med spets och acetosyringon jämfördes genom att mäta absorbansen i intervallet 400–700 nm (Figur 7). Absorbansen av syntetiskt melanin minskade snabbt med ökande reaktionstid vid alla våglängder. Absorbansen av avfärgat naturligt melanin visade emellertid ett annat mönster jämfört med det för avfärgat syntetiskt melanin. Absorbansen av avfärgat naturligt melanin minskade vid våglängder större än 450 nm, medan absorbansen ökade vid våglängder mindre än 450 nm. Fler studier krävs för att förstå ökningen i absorbans av avfärgat naturligt melanin.

4. Sammanfattningar

I denna studie uppnåddes melaninavfärgning genom att använda "O2/laccase/mediator"-systemet, eftersom laccas visade låg katalytisk aktivitet för direkt oxidation av melanin på grund av dess låga redoxpotential och begränsade tillgång av melanin till det aktiva stället för laccas. Sju typer av naturliga mediatorer användes framgångsrikt för att ersätta syntetiska mediatorer (HOBt) för melaninavfärgning av LMS med användning av lacT och spets. Bland de testade naturliga mediatorerna visade acetosyringon och syringaldehyd, innehållande två metoxigrupper, höga avfärgningshastigheter och höga utbyten. Acetovanillon innehållande en metoxigrupp och en ketongrupp visade också ett högt avfärgningsutbyte i jämviktstillståndet. LMS med naturliga mediatorer visade hög avfärgningsaktivitet vid pH hos normal hud, och cytotoxiciteten hos naturliga mediatorer var mycket låg. En kinetisk studie av LMS med användning av acetosyringon för melaninavfärgning visade att acetosyringon effektivt övervann begränsningarna av lacT och lacM genom att öka affiniteten för melanin och avfärgningsaktivitet. LMS med acetosyringon avfärgade melaninet som fanns i cellulosahydrogelfilmen, som efterliknar huden. Dessutom kan LMS med acetosyringon avfärga inte bara syntetiska eumelaninanaloger framställda genom oxidation av tyrosin utan också naturligt melanin som produceras av melanomceller. Således kan LMS som använder naturliga mediatorer användas som ett effektivt hudblekande medel inom kosmetikaindustrin.

Tilläggsmaterial:Följande är tillgängliga online, Figur S1: Melaninavfärgningen med LMS med laccase från T. versicolor och M. thermophila, Figur S2: Den initiala hastigheten för melaninavfärgningsreaktionen med laccase från T. versicolor och M. thermophila.

Författarbidrag:Konceptualisering, SP, DJ och SHL; Datakurering, SHL; Formell analys, SP; Finansieringsförvärv, SHL; Utredning, SP, DJ och HD; Metodik, SP, DJ och HD; Projektadministration, SHL; Resurser, SHL; Programvara, JY, DL och SH; Tillsyn, SHL; Validering, JY, DL, SH och SHL; Visualisering, JY, DL och SH; Skriva – originalutkast, SP och DJ; Skrivning—granskning och redigering, SHL Alla författare har läst och samtyckt till den publicerade versionen av manuskriptet.

Finansiering:Detta arbete stöddes av Konkuk University 2018.

Uttalande av institutionell granskningsnämnd:Inte tillämpbar.

Informerat samtycke:Inte tillämpbar.

Datatillgänglighetsförklaring:Inte tillämpbar.

Intressekonflikt:Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Referenser

1. Stark, PJ; Claus, H. Laccase: En översyn av dess förflutna och dess framtid inom bioremediering. Crit. Rev. Environ. Sci. Technol. 2011, 41, 373–434. [CrossRef]

2. Mayer, AM; Staples, RC Laccase: Nya funktioner för ett gammalt enzym. Phytochemistry 2002, 60, 551–565. [CrossRef]

3. Camarero, S.; Ibarra, D.; Martinez, MJ; Martínez, AT Lignin-härledda föreningar som effektiva Laccase-förmedlare för avfärgning av olika typer av motstridiga färgämnen. Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71, 1775–1784. [CrossRef] [PubMed]

4. Campos, R.; Cavaco-Paulo, A.; Kandelbauer, A.; Robra, KH; Gübitz, GM Indigo-nedbrytning med renade laccaser från Trametes hirsuta och Sclerotium rolfsii. J. Biotechnol. 2001, 89, 131–139. [CrossRef]

5. Ostadhadi-Dehkordi, S.; Tabatabaei-Sameni, M.; Forootanfar, H.; Kolahdouz, S.; Ghazi-Khansari, M.; Faramarzi, MA Nedbrytning av vissa bensodiazepiner genom ett laccasmedierat system i vattenlösning. Bioresur. Technol. 2012, 125, 344–347. [CrossRef]

6. Lloret, L.; Eibes, G.; Lu-Chau, TA; Moreira, MT; Feijoo, G.; Lema, JM Laccase-katalyserad nedbrytning av antiinflammatoriska medel och östrogener. Biochem. Eng. J. 2010, 51, 124–131. [CrossRef]

7. Zeng, S.; Qin, X.; Xia, L. Nedbrytning av herbiciden isoproturon av laccas-mediatorsystem. Biochem. Eng. J. 2017, 119, 92–100. [CrossRef]

8. Ibarra, D.; Romero, J.; Martinez, MJ; Martínez, AT; Camarero, S. Utforska de enzymatiska parametrarna för optimal delignifiering av eukalyptmassa med laccas-mediator. Enzym Microb. Technol. 2006, 39, 1319–1327.

9. Fillat, A.; Colom, JF; Vidal, T. Ett nytt tillvägagångssätt för bioblekning av linmassa med laccase med hjälp av naturliga mediatorer. Bioresur. Technol. 2010, 101, 4104–4110. [CrossRef] [PubMed]

10. Camarero, S.; Ibarra, D.; Martínez, AT; Romero, J.; Gutiérrez, A.; del Río, JC Delignifiering av pappersmassa med laccase och naturliga mediatorer. Enzym Microb. Technol. 2007, 40, 1264–1271. [CrossRef]

11. Zerva, A.; Simic, S.; Topakas, E.; Nikodinovic-Runic, J. Applications of Microbial Laccases: Patent Review of the Past Decade (2009–2019). Catalysts 2019, 9, 1023. [CrossRef]

12. Cañas, AI; Camarero, S. Laccases och deras naturliga förmedlare: Bioteknologiska verktyg för hållbara miljövänliga processer. Biotechnol. Adv. 2010, 28, 694–705. [CrossRef] [PubMed]

13. Shleev, S.; Tkac, J.; Christenson, A.; Ruzgas, T.; Yaropolov, AI; Whittaker, JW; Gorton, L. Direkt elektronöverföring mellan kopparinnehållande proteiner och elektroder. Biosens. Bioelektron. 2005, 20, 2517–2554. [CrossRef] [PubMed]

14. Christopher, LP; Yao, B.; Ji, Y. Biologisk nedbrytning av lignin med laccas-mediatorsystem. Främre. Energi Res. 2014, 2, 1–13. [CrossRef]

15. Bourbonnais, R.; Paice, MG Oxidation av icke-fenoliska substrat: En utökad roll för laktas i biologisk nedbrytning av lignin. FEBS Lett. 1990, 267, 99-102. [CrossRef]

16. Srebotnik, E.; Hammel, KE Nedbrytning av icke-fenoliskt lignin av laccas/1-hydroxibensotriazolsystemet. J. Biotechnol. 2000, 81, 179–188. [CrossRef]

17. Baiocco, P.; Barreca, AM; Fabbrini, M.; Galli, C.; Gentili, P. Främjande av laccasaktivitet mot icke-fenoliska substrat: En mekanistisk undersökning med några laccas-mediatorsystem. Org. Biomol. Chem. 2003, 1, 191–197. [CrossRef]

18. Fabbrini, M.; Galli, C.; Gentili, P. Jämföra den katalytiska effektiviteten hos vissa förmedlare av laccas. J. Mol. Catal. B-enzym. 2002, 16, 231–240. [CrossRef]

19. González, MD; Vidal, T.; Tzanov, T. Elektrokemisk studie av fenoliska föreningar som förstärkare i laccaskatalyserade oxidativa reaktioner. Elektroanalys 2009, 21, 2249–2257. [CrossRef]

20. Yang, L.; Guo, X.; Jin, Z.; Guo, W.; Duan, G.; Liu, X.; Li, Y. Uppkomsten av melanininspirerade superkondensatorer. Nano Today 2021, 37, 101075. [CrossRef]

21. Caldas, M.; Santos, AC; Veiga, F.; Rebelo, R.; Reis, RL; Correlo, VM Melanin-nanopartiklar som ett lovande verktyg för biomedicinska applikationer - En recension. Acta Biomater. 2020, 105, 26–43. [CrossRef]

22. Woo, SH; Cho, JS; Lee, BS; Kim, EK Avfärgning av melanin med ligninperoxidas från Phanerochaete chrysosporium. Biotechnol. Bioprocess Eng. 2004, 9, 256–260. [CrossRef]

23. Kaneko, S.; Cheng, M.; Murai, H.; Takenaka, S.; Murakami, S.; Aoki, K. Purification and Characterization of an Extracellular Laccase from Phlebia radiata Strain BP-11-2 That Avcolorizes Fungal Melanin. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2009, 73, 939–942. [CrossRef]

24. Mohorˇciˇc, M.; Friedrich, J.; Renimel, I.; André, P.; Mandin, D.; Chaumont, J.-P. Produktion av melaninblekningsenzym av svampursprung och dess tillämpning i kosmetika. Biotechnol. Bioprocess Eng. 2007, 12, 200–206. [CrossRef]

25. Kim, BS; Blaghen, M.; Hong, H.; Lee, K. Rening och karakterisering av ett melanin bionedbrytningsenzym från Geotrichum sp. Int. J. Cosmetic Sci. 2016, 38, 622–626. [CrossRef] [PubMed]

26. Sung, HJ; Khan, MF; Kim, YH Rekombinant ligninperoxidas-katalyserad avfärgning av melanin med användning av in-situ genererad H2O2 för applicering i blekningskosmetika. Int. J. Biol. Macromol. 2019, 136, 20–26. [CrossRef]

27. Shin, SK; Hyeon, JE; Joo, Y.; Jeong, DW; Du, SK; Han, SO Effektiv melaninnedbrytning av ett synergistiskt lackas-peroxidasenzymkomplex för blekning av huden och andra praktiska tillämpningar. Int. J. Biol. Macromol. 2019, 129, 181–186. [CrossRef]

28. Khammuang, S.; Sarnthima, R. Avfärgning av syntetiska melaniner av råa laccaser av Lentinus polycarpous Lév. Folia Microbiol. 2013, 58, 1–7. [CrossRef] [PubMed]

29. Repetto, G.; del Peso, A.; Zurita, J. Neutral röd upptagsanalys för uppskattning av cellviabilitet/cytotoxicitet. Nat. Protoc. 2008, 3, 1125–1131. [CrossRef] [PubMed]

30. Castellar, MR; Obón, JM; Fernández-López, JA Isoleringen och egenskaperna hos ett koncentrerat rött-lila betacyanin livsmedelsfärgämne från Opuntia stricta frukter. J. Sci. Food Agric. 2006, 86, 122–128. [CrossRef]

31. Cserhalmi, Z.; Sass-Kiss, Á.; Tóth-Markus, M.; Lechner, N. Studie av pulserade elektriska fältbehandlade citrusjuicer. Innov. Food Sci. Emerg. Technol. 2006, 7, 49–54. [CrossRef]

32. Łopusiewicz, L.; J˛edra, F.; Mizieli ´ska, M. Nya poly(mjölksyra) aktiva förpackningskompositfilmer inkorporerade med svampmelanin. Polymers 2018, 10, 386. [CrossRef] [PubMed]

33. Pralea, IE; Moldavien, RC; Petrache, AM; Ilies, M.; Heghes, , SC; Ielciu, I.; Nicoară, R.; Moldavan, M.; Ene, M.; Radu, M.; et al. Från extraktion till avancerade analytiska metoder: Utmaningarna med melaninanalys. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3943. [CrossRef] [PubMed]

34. Tran-Ly, AN; Reyes, C.; Schwarze, FWMR; Ribera, J. Mikrobiell produktion av melanin och dess olika tillämpningar. World J. Microbiol. Biotechnol. 2020, 36, 1–9. [CrossRef] [PubMed]

35. Medina, F.; Aguila, S.; Baratto, MC; Martorana, A.; Basosi, R.; Alderete, JB; Vazquez-Duhalt, R. Prediktionsmodell baserad på beslutsträdsanalys för laccasmediatorer. Enzym Microb. Technol. 2013, 52, 68–76. [CrossRef]

36. Fillat, U.; Prieto, A.; Camarero, S.; Martínez, AT; Martínez, MJ Biodeinking av flexografiska bläck av svamplackaser med hjälp av syntetiska och naturliga mediatorer. Biochem. Eng. J. 2012, 67, 97–103. [CrossRef]

37. Hong, J.; Jung, D.; Park, S.; Åh, Y.; Åh, KK; Lee, SH Immobilisering av laccas via tvärbundna enzymaggregat framställda med hjälp av genipin som en naturlig tvärbindare. Int. J. Biol. Macromol. 2021, 169, 541–550. [CrossRef]

38. Berka, RM; Schneider, P.; Golightly, EJ; Brown, SH; Madden, M.; Brown, KM; Halkier, T.; Mondorf, K.; Xu, F. Karakterisering av genen som kodar för ett extracellulärt laccas av Myceliophthora thermophila och analys av det rekombinanta enzymet uttryckt i Aspergillus oryzae. Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63, 3151-3157. [CrossRef]

För mer information: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501