Effekter av fyra kinesiska örtextrakt på läkemedelskänsliga och multiresistenta småcelliga lungkarcinomceller

David SadavaJulie Ahn Mei Zhan Mei-Lin PangJane DingSusan E. Kane

Abstrakt syfte:Vi undersökte farmakologi, cellbiologi och molekylärbiologi hos småcelliga lungkarcinomceller behandlade med fyra extrakt avKinesiska örtmediciner. Många cancerpatienter tar dessa läkemedel, men deras effekter på cellnivå är i stort sett okända. Vi var särskilt intresserade av effekterna på läkemedelsresistenta celler, eftersom resistens är ett betydande kliniskt problem ilungcancerr. Metoder: Läkemedelskänsliga (H69), multiresistenta (H69VP) och normala lungepitelceller (BEAS-2) exponerades för extrakt från två växter som används i kinesisk örtmedicin förlungcancer: Glycyrrhiza glabra (GLYC) och Olenandria diffusa (OLEN), och till extrakt av två kommersiellt tillgängliga kombinationer avKinesiska örtmediciner, SPES (15 örter) och PC-SPES (8 örter). Cytotoxicitet mättes i termer av celltillväxthämning (IC50). Kinetiken för DNA-fragmentering efter exponering för örtextrakten mättes genom BudR-märkning följt av ELISA. Apoptos mättes med TUNEL-analysen följt av flödescytometri. Uttryck av apoptos- och cellcykelrelaterade gener mättes genom omvänd transkription av mRNA följt av filterhybridisering till arrayer av sönder och detektion genom kemiluminescens. Resultat: I varje fall var de fyra örtextrakten lika cytotoxiska för H69 och H69VP och mindre cytotoxiska för BEAS-2. Alla fyra extrakten inducerade DNA-fragmentering i lungkarcinomcellerna. Kinetiken visade DNA-fragment frisatta till mediet (en indikation på nekros) i GLYC-exponerade kulturer, men inuti cellerna (en indikation på apoptos) i OLEN-, SPES- och PC-SPES-exponerade kulturer. TUNEL-analys bekräftade att exponering för de tre sistnämnda extrakten, men inte för GLYC, ledde till apoptos. Jämfört med obehandlade och GLYC-behandlade celler, visade H69- och H69VP-celler behandlade med OLEN, SPES och PC-SPES förhöjt uttryck av ett antal gener involverade i den apoptotiska kaskaden, liknande celler behandlade med etoposid och vinkristin.

Slutsats:DeKinesisk örtmedicinextrakten OLEN, SPES och PC-SPES är cellgifter för både läkemedelsresistenta och läkemedelskänsligalungcancerceller, som visar viss tumörcellsspecificitet jämfört med deras effekt på normala celler, och är proapoptotiska mätt med DNA-brott och genuttryck. Tumörcellernas reaktion på dessa extrakt liknade deras reaktion på konventionella kemoterapeutiska läkemedel.

Cistanche, en dyrbarKinesisk örtmedicin, har effekten att förbättra immuniteten ochlungcancer. Cistanche har en lång historia av medicinsk användning. Den spelades först in i "Shen Nong's Materia Medica". Shennong smakade alla sorters örter. Cistanches effektivitet och roll är betydande när det gäller att stärka njuren och närande essensen, lindra trötthet, fukta tarmarna och avföring, närande yang och närande yin, etc., så det skrevs in i boken. Under post-Tangdynastin listades Cistanche som en av de nio kinesiska älvorna av gräs. Modern forskning om det har utförts i mer än 60 år. , Anti-aging, hjälper till att förbättra minne och immunitet, etc.

Nyckelord:Lungcancer, Läkemedelsresistens,Kinesiska örtmediciner,cistanche

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Introduktion

Småcelliglungcancer(SCLC) står för cirka 20 procent av allalungcanceroch är aggressiv, med en 5-årsöverlevnadsfrekvens vid diagnos på mindre än 10 procent [19]. Patienter uppvisar vanligen spridd sjukdom, och därför är behandlingen genom kemoterapi, med kombinationer som vanligtvis involverar cisplatin, etoposid, doxorubicin, 5-uorouracil och taxol [12]. Tyvärr blir denna behandling så småningom ineffektiv eftersom de flesta SCLC-tumörer utvecklar multiläkemedelsresistens [18]. Eftersom det finns många resistensmekanismer [15] är det en stor klinisk utmaning att övervinna resistens.

Inför palliativ vård använder många cancerpatienter alternativa läkemedel, inklusive växtbaserade terapier [6, 23]. Bland dessa terapier är traditionell kinesisk medicin förmodligen den bäst etablerade och kodifierade, med anor flera tusen år tillbaka i tiden. Den teoretiska grunden för detta medicinska system rör de motsatta krafterna av yin och yang, generativa och destruktiva cykler och en livskraft, eller qi [2]. Specifika örtextrakt och kombinationer har utvecklats för att behandla specifika sjukdomar inklusive cancer [11, 27]. Även om det finns några empiriska bevis för att örterna är effektiva vid behandling av cancer, är deras verkningsmekanismer på cellnivå i stort sett okända. Detta får extra betydelse om patienterna kombinerar sin användning med konventionell kemoterapi. Effekterna av örtextrakt på läkemedelsresistens har inte heller rapporterats.

Vi undersökte effekterna av fyraKinesiska örtmedicinerpå tre cellinjer: SCLC, multiläkemedelsresistent SCLC och normalt lungepitel. Två av de fyra extrakten kom från enstaka växter som ofta ordinerats för lungcancer, Glycyrrhiza glabra (GLYC) och Olenandria diffusa (OLEN). De andra två kom från kommersiellt tillgängliga kombinationer av örter som kallas SPES och PC-SPES. OLEN (kinesiskt namn Bai Hua she cao) har antitumör, antimutagena och immunstimulerande aktiviteter [1, 25, 29]. GLYC (kinesiskt namn gan car) är antiinflammatorisk, antitumörframkallande och antimutagen [7, 11]. SPES, utvecklat av BotanicLabs (Brea, Kalifornien), är i form av kapslar som innehåller lyofiliserade extrakt av 15 kinesiska örter och har visat sig minska smärta hos patienter med avancerad cancer [14]. Bland örterna i SPES finns det immunstimulerande medletCistanchedeserticola, antitumörmedlet Rabdosia rubescens och det antiinflammatoriska medlet Zanthoxylum iridium [1, 11]. PC-SPES, även framställt av BotanicLabs, innehåller åtta örter, inklusive den antiandrogena Serenoa repens som hämmar prostatahyperplasi [21], proteinkinas C-hämmaren Scutellaria baicalensis [13], antitumörmedlet Panax ginseng [30] och Glycyrrhiza glabra ( se ovan). Även om rigorösa bevis för klinisk antitumöreffekt av GLYC, OLEN och SPES saknas, finns det vissa bevis för effektiviteten av PC-SPES. I både prostatacancerceller och djurmodeller är PC-SPES proapoptotisk och cytotoxisk [8, 9, 10, 28]. Kliniska prövningar har visat att det är effektivt för att sänka nivåerna av prostataspecifikt antigen och för att stoppa tumörtillväxt vid både androgenberoende och androgenoberoende prostatacancer [4, 5, 17, 20, 26].

Även om cancerpatienter utan tvekan använder örtextrakt, finns det få prekliniska eller kliniska data om effekterna av dessa extrakt på SCLC. Vårt mål var att börja denna analys med en undersökning av farmakologi (cytotoxicitet), cellbiologi (metod för celldöd) och molekylärbiologi (genuttryck) i läkemedelskänsliga och läkemedelsresistenta SCLC-celler.

Material och metoder

Extrakt och kemikalier

GLYC och OLEN erhölls som torkade plantor från Jen-On Medical Group (Monterey Park, Kalifornien). För framställning av ett extrakt maldes 0,5 g till ett fint pulver med en mortel och mortelstöt och suspenderades i 30 ml destillerat vatten. I kinesisk medicin konsumeras växtextrakten som teer efter uppvärmning. Därför inkuberades suspensionen med skakning vid 70 grader i 18 timmar. Efter centrifugering vid 1500 g under 10 minuter steriliserades supernatanten genom att filtrera genom ett 0,45-lm-filter med användning av en spruta. Det resulterande extraktet justerades med destillerat vatten till 17 mg/ml baserat på det ursprungliga växtmaterialet. Extrakten förvarades vid 4 grader i upp till 1 vecka fram till användning.

SPES och PC-SPES erhölls från BotanicLabs (Brea, Kalifornien) som kapslar. Extraktionsmetoden som används har använts i tidigare studier av dessa preparat [8, 9, 10]. Innehållet i en kapsel (320 mg) löstes i 1 ml 95 procent etanol och suspensionen inkuberades med skakning vid 37 grader i 1 timme. Efter centrifugering vid 3000 g under 10 minuter, filtersteriliserades supernatanten enligt ovan. Den slutliga koncentrationen var 300 mg/ml baserat på det ursprungliga växtmaterialet. Extrakten förvarades vid –20 grader i upp till 1 vecka fram till användning.

Cellkulturer och cytotoxicitetsmätning

NCI-H69 SCLC-celler odlades vid 37 grader i en atmosfär innehållande 5 procent CO2 som en suspension i AIM-V serumfritt medium (Life Technologies, Grand Island, NY). En multiresistent cellinje (H69VP) vald i etoposid [16] odlades också i AIM-V och visade korsresistens mot etoposid (9- gånger), doxorubicin (20- gånger) och vinkristin (10-faldig) (data visas inte). Dessa celler har flera mekanismer för läkemedelsresistens, inklusive förändringar i topoisomeras II och uttryck av membranpumparna, MDR1 och MRP. BEAS-2 normala lungepitelceller [22] odlades i DMEM-F12 kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum.

För cytotoxicitetstestning tillsattes extrakt enligt indikation till logaritmiskt växande celler i 1-ml kulturer innehållande 6000 celler/ml. Efter 4 dagars kontinuerlig exponering räknades cellerna i en Coulter Z-1-räknare. Räkningar validerades mikroskopiskt med hemocytometer efter färgning med trypanblått. Alla experiment utfördes i tre exemplar och upprepades minst tre gånger. IC50-värdena, definierade som koncentrationen av extrakt som hade reducerat cellantal på dag 4 med 50 procent, beräknades jämfört med lösningsmedelskontroller. Medelvärden beräknades och jämfördes med ANOVA för de tre cellinjerna för det extraktet.

Celldödsanalyser

Mekanismen för cytotoxicitet undersöktes genom kinetiken för cellulär DNA-fragmentering (Boehringer-Mannheim kit, Indianapolis, Ind.). Kortfattat inkuberades 5·105 celler/ml i 16 timmar vid 37 grader i en atmosfär innehållande 5 procent CO2 i AIM-V-medium innehållande 10 1M BudR. Cellerna tvättades och återsuspenderades vid 105/ml i BudR-fritt medium, och 200 1 av denna kultur inkuberades med örtextrakt vid 2·IC50 under den angivna tiden, varefter 100 1 av odlingsmediet avlägsnades för kvantifiering av DNA fragment med ELISA. Detta är ett mått på cellnekros. DNA-fragment i cellerna, genererade genom apoptos, mättes efter cellys i bovint serumalbumin (BSA)/Tween 20 vid 21 grader under 30 minuter. Efter centrifugering användes lysatet för ELISA.

ELISA utfördes i en rundbottnad mikrotiterplatta belagd med anti-DNA-antikropp (mus anti-humant DNA monoklonalt, klon MCA-33) över natten vid 4 grader. Efter blockering med BSA sattes 100 1 märkt DNA-fragmentlösning till de belagda brunnarna följt av inkubation under 90 minuter vid 21 grader. DNA:t fixerades och denaturerades genom mikrovågsstrålning vid 500 W under 5 min. Mus-anti-BudR (mus monoklonal BMG 6HB) konjugerad med peroxidas tillsattes och efter inkubering i mörker under 120 minuter vid 21 grader stoppades reaktionen genom tillsats av 500 1 koncentrerad H2S04. Den resulterande färgen kvantifierades genom absorbans vid 450 nm. Extraktbehandlade prover jämfördes med obehandlade kontroller som bakgrund.

Apoptos bekräftades genom TUNEL-analys. Logaritmiskt växande celler exponerades för örtextrakt vid 1·IC50 i 3 timmar. De tvättades sedan två gånger i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 1 procent BSA och återsuspenderades i PBS/BSA vid 5·105 celler/ml. Till 500 ll celler sattes 100 ll 4 procent paraformaldehyd och cellerna fixerades vid 21 grader i 1 timme. Efter tvättning i PBS återsuspenderades cellerna i 100 1 kall permeabiliseringsbuffert (0,1 procent Triton X-100, 0,1 procent natriumcitrat) under 2 minuter vid 4 grader. Cellerna tvättades två gånger i PBS och återsuspenderades sedan i en 50 1 TUNEL-blandning innehållande terminalt deoxiribonukleotid-idyltransferas (TdT) och fluorescein-dUTP (Boehringer-Mannheim-kit). Efter inkubation i mörker vid 37 grader i 1 timme motfärgades cellerna med propidiumjodid och analyserades med flödescytometri.

Analys av genuttryck

Kulturer (6 ml) av logaritmiskt växande celler (5·105 celler/ml) inkuberades i ett medium innehållande örtextrakt vid 1·IC50 vid 37 grader i en atmosfär innehållande 5 procent CO2 under 3 timmar. Efter tvättning två gånger i PBS frystes cellpelletarna vid –70 grader över natten. RNA isolerades med RNeasy Mini-protokollet (Qiagen, Valencia, Kalifornien). I allmänhet gav denna metod 0,5 LG RNA. Denna mängd RNA transkriberades omvänt till cDNA och märktes med biotin-dUTP och hybridiserades till denaturerade prober till apoptos- och cellcykelrelaterade gener på filter. Hybridisering detekterades genom att binda alkaliskt fosfatas-streptavidin till cDNA:t med användning av ett kemiluminescerande substrat, CDP-Star (SuperArray, Bethesda, Md.), följt av exponering för röntgenfilm, vanligtvis i 1–2 minuter.

Kontrollgenmål på varje filter inkluderade b-aktin och GAP-DH som positiva kontroller och pUC18 som en negativ kontroll. Följande cellcykel- och apoptosrelaterade gener var hybridiseringsmål: bad, bcl-2, BCL-w, BCL-x, kaspaser 1–10, c-myc, E2F, fas, fas ligand, gadd45, iNOS , mdm2, NFkB, p21Waf1, p53, pig7, pig8, Rb, DR5, trail, Casper, CRADD, DAXX, IAP-1, IAP-2, NIK, TNFR2, TRAF2, TRAF3, TRAF5 och DR5. Intensitetenav hybridisering bedömdes visuellt i tandem duplikatfläckar på filtret i förhållande till de positiva kontrollerna.

Resultat

Våra första experiment testade cytotoxiciteten hos extrakt av kinesiska örter på läkemedelskänsliga och läkemedelsresistenta SCLC-celler, såväl som normala lungepitelceller. Som visas i tabell 1 var de fyra örtextrakten cytotoxiska vid låga koncentrationer. Dessa fynd liknar de som hittades för SPES och PC-SPES i andra tumörcellinjer [8]. I varje fall skilde sig inte IC50-värdena för multiresistenta celler (H69VP) från de för läkemedelskänsliga celler (H69). Dessutom var IC50-värdena för normala lungepitelceller signifikant högre än för tumörcellinjerna.

Vi undersökte sedan mekanismen för cytotoxicitet med hjälp av kinetiken för DNA-fragmentering som en indikation på apoptos (fragment som långsamt bildas i celler) eller nekros (fragment som snabbt bildas och frigörs från de skadade cellerna). Celler inkuberades i örtextrakt i mellan 30 minuter och 8 timmar, och sedan uppskattades DNA-fragmenten med ELISA i både odlingsmediet och cellysat. Figur 1 visar representativa data för H69-celler exponerade för de fyra extrakten under 90 min. Med tre av extrakten (SPES, PC-SPES, OLEN) kom de flesta av DNA-fragmenten inifrån cellerna (lysaten), vilket tyder på apoptos. Men med GLYC frisattes fragmenten till mediet från skadade celler, vilket tyder på nekros. Liknande resultat erhölls med H69VP-celler (data visas ej).

Dessa cytotoxicitetsexperiment följdes av TUNEL-analyser av DNA-brott in situ. Jämfört med obehandlade kontroller (1–3 procent apoptotiska celler i fyra experiment), visade SCLC-celler behandlade med SPES (58–85 procent), PC-SPES (63–77 procent) och OLEN (49–81 procent) TUNEL-positivitet, medan celler behandlade med GLYC gjorde det inte (1–2 procent) (Fig. 2). Liknande resultat erhölls med H69VP-celler (data visas inte).

Vi analyserade gentranskription som svar på örtextrakt med hjälp av GeneArrays. Dessa arrayer har tandem arrangerade gener relaterade till cellcykeln och apoptos. Vi utförde dessa experiment två gånger med liknande resultat. Figur 3 visar representativa arrayautora-diagram av H69-celler exponerade för etoposid eller SPES. Våra resultat för H69-celler sammanfattas i tabell 2. Medan obehandlade kontroller hade ett detekterbart uttryck av endast ett fåtal av de studerade generna, visade celler behandlade med konventionella kemoterapeutiska läkemedel (etoposid och vinkristin) starka signaler för ett antal gener involverade i cellcykeln reglering och apoptos. Celler behandlade med OLEN, SPES och PC-SPES visade ett mönster liknande det som erhölls med de två läkemedlen. I allmänhet verkade inte celler behandlade med GLYC visa detta transkriptionsmönster, utan visade istället starkt uttryck av antiapoptosgenen, BCL-2.

Diskussion

Vi genomförde dessa studier av två skäl. För det första finns det en gammal tradition av kinesisk örtmedicin som bygger på dess egna teorier och filosofi [2], och vi ville börja förstå i västerländska medicinska termer effekterna av örtläkemedlen. Dessa örter används som blandningar, och även om det har gjorts vissa framsteg när det gäller att bryta ner dem till individuella kemiska beståndsdelar[11], fokuserade våra studier på dem eftersom de används i traditionell praxis. Vår andra motivation var att många cancerpatienter använder dessa örter tillsammans med konventionella behandlingar [6, 23], och att förstå de cellulära effekterna av örterna kan ge viktig information för kliniskt beslutsfattande.

Cytotoxicitetsdata (tabell 1) visade att de fyra örtextrakten verkligen var cytotoxiska för tumörceller, mer så på en dosbasis än för normala lungepitelceller, vilket indikerar viss tumörspecificitet och möjligen ett gynnsamt terapeutiskt index. Likheterna i IC50 mellan läkemedelskänsliga och multiresistenta celler indikerar att dessa extrakt inte påverkas av läkemedelsresistensmekanismerna som visas i H69VP-celler, inklusive överuttryck av två läkemedelstransportörer, MDR1 och MRP.

Kinetiken för DNA-fragmentering visade att extrakten SPES, PC-SPES och OLEN var proapoptotiska, medan GLYC var pron erotisk (Fig. 1). Detta bekräftades av TUNEL-färgning in situ (fig. 2). De flesta konventionella kemoterapeutiska läkemedel är proapoptotiska [3], och en grupp av apoptotiska och cellcykelreglerande gener uppregleras i cellerna som svar på läkemedlen [24]. Vi fann att uttrycksmönstret för några av generna som uttrycks som svar på de tre pro-appen till örtextrakt liknade det som observerades i dessa celler efter exponering för konventionella kemoterapeutiska läkemedel (Fig. 3, Tabell 2). Svaret på enbart GLYC verkade vara annorlunda, åtminstone vid den tidpunkt som analyserades i dessa experiment. Intressant nog är GLYC en del av PC SPES, som var proapoptotisk, medan GLYC ensam inte var det. Kanske är andra komponenter i PC-SPES ansvariga för dess proapoptotiska aktivitet. Även om dessa resultat inte visar hur örtextrakten utvinner skadade celler, föreslår de att H69-celler svarar på skadan på molekylär (transkription) och cellulär (apoptos) nivå på ett sätt som liknar deras svar på kemoterapi.

Våra studier indikerar den potentiella användbarheten av dessa kinesiska örtextrakt vid behandling av SCLC, särskilt läkemedelsresistenta sjukdomar.

ErkännandenVi tackar L. Brown för ovärderlig hjälp med andra cytometri och R. Lingeman för hjälp med molekylärbiologiska protokoll. BEAS-2-cellerna levererades generöst av Dr. I. Laird-Offringa, University of SouthernCalifornia, Norris Cancer Center. SPES och PC-SPES var en gåva från Dr. S. Chen, New York Medical College. Denna forskning stöddes av Pritzker Family Foundation och WM KeckFoundation.

Cistanche som kinesisk örtmedicin kan förbättra immuniteten och bekämpa cancer, klicka här för att lära dig mer

Referenser

1. Boik J (1996) Cancer och naturmedicin: en lärobok i grundläggande vetenskap och klinisk forskning. Oregon Medical Press, Princeton, s 221

2. Chan K (1995) Framsteg inom traditionell kinesisk medicin. Trends Pharmacol Sci 16:182–187

3. Chu E, DeVita V Jr (2001) Principer för cancerhantering: kemoterapi. I: DeVita V Jr, Hellman S, Rosenberg SA (red) Cancer: principer och praxis för onkologi. Lippincott Williams och Wilkins, Philadelphia, s 289–306

4. De la Taille A, Hayek OR, Buttyan R, Bagiella E, Burchart M, Katz AE (1999) Effekter av ett fytoterapeutiskt medel, PC-SPES, på prostatacancer. BJU Int 84:845–850

5. DiPaola RS, Zhang H, Lambert G, Meeker R, Licitra E, Rafi M, Spaulding H, Goodin S, Toledano M, Gallo M (1998) Klinisk och biologisk aktivitet av en östrogen örtkombination (PC-SPES) i prostata cancer. New Engl J Med 339:785–791

6. Eisenberg DM, Davis RB, Ettner SL (1998) Trender inom användning av alternativ medicin i USA: 1990–1997: resultat av en uppföljande nationell undersökning. JAMA 280:1569–1575

7. Fenwick GR, Lutomski J, Nieman C (1990) Glycyrrhiza glabra: sammansättning, användningar och analys. Food Chem 38:119–143

8. Halicka HD, Ardelt B, Juan G, Mittleman A, Chen S, Traganos F, Darzynkiewicz Z (1997) Apoptos och cellcykeleffekter inducerade av extrakt av det kinesiska örtpreparatet PC-SPES. Int J Oncol 11:437–448

9. Hsieh T, Chen SS, Wang X, Wu J (1997) Reglering av androgenreceptorn och prostataspecifikt antigenuttryck i androgenkänsliga humana prostata-LNCaPceller genom etanolextrakt av det kinesiska örtpreparatet PC-SPES. Biochem Mol Biol Int 42:535–544

10. Hsieh T, Ng C, Chang, C, Chen SS, Mittleman, A, Wu J (1998) Induktion av apoptos och nedreglering av BCL-6 i Mutu-celler behandlade med etanolextrakt av det kinesiska örttillskottet PC-SPES. Int J Oncol 13:1199–1202

11. Huang KC (1999) The pharmacology of Chinese herbs, 2^ndedn. CRC Press, Boca Raton

12. Kalemkerian GP, ​​Worden FP (2000) Terapeutiska framsteg inom SCLC. Expert Opin Invest Drugs 9:65–79

13. Kimura Y, Okuda H, Yokio K, Matsushita N (1997) Effekter av baicalein isolerat från Scutellaria baicalensis på interleukin 1b- och TNF-inducerad vävnadsplasminogenaktivator och plasminogenaktivatorhämmare-1 produktion i odlad navelvensendothel . Phytother Res 11:363–367

14. Lin C (1996) En observation om den kombinerade användningen av kemoterapi och traditionell kinesisk medicin för att lindra cancersmärta. J Tradit Chin Med 16:267–269

15. Mattern J, Volm M (1995) Resistensmekanismer i human lungcancer. Invasionsmetastas 15:81–94

16. Minato K, Kanzawa F, Nishio K, Nakagawa K, Fujiwara Y, Saijo N (1990) Karakterisering av en etoposid-resistent human småcellig lungcancerlinje. Cancer Chemother Pharmacol 26:313–327

17. Moyad MA, Pienta KJ, Montie JE (1999) Användning av PC-SPES, ett kommersiellt tillgängligt tillskott för prostatacancer, hos en patient med den hormonnaiva sjukdomen. Urology 54:319–324

18. Nishio K, Nakamura T, Koh Y, Suzuki H, Fukumoto N, Saijo N (1999) Läkemedelsresistens vid lungcancer. Curr Opin Oncol 11:109–115

19. Pass H, Mitchell JB, Johnson DH, Turrisi AT, Minna J (2000) Lungcancer: principer och praxis. Lippincott, Philadelphia

20. Pfeifer BL, Pirani JF, Hamann SR, Klippel KF (2000) PC SPES: ett kosttillskott för behandling av hormonrefraktär prostatacancer. BJU Int 85:481–485