Interaktioner mellan polyfenoliska antioxidanter Quercetin och Naringenin dikterar det distinkta redoxrelaterade kemiska och biologiska beteendet hos deras blandningar. Del 1

Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information

Forskning utförd under de senaste två decennierna på den molekylära basen av icke-infektiösa kroniska sjukdomar som t.ex.åderförkalkning, hypertoni, diabetes och särskilt cancer som fångar stort intresse har visat att alla dessa sjukdomar delar en gemensam riskfaktor, som är störningen av redoxhomeostas som ofta kallas oxidativ stress12. Det uppstår som ett resultat av en ökad endogen nivå av reaktiva syrearter (ROS) på grund av att kroppens antioxidantbarriär brister och tros främja utvecklingen av alla dessa sjukdomar.3. Sålunda följde antagandet att exogena faktorer som kan neutralisera ROS, t.ex. växtantioxidanter, kunde motverka eller bromsa utvecklingen av kroniska sjukdomar och stödja deras behandling. Verifiering av denna hypotes initierade detaljerade studier av antioxidanter som finns i livsmedel som kan ha förebyggande potential4. Faktum är att flera studier som sammanfattats i metaanalysen som jämförde matkonsumtion och kostrelaterade kroniska sjukdomar visade minskad risk när det gäller dieter rik på frukt och grönsaker, fullkornsflingor samt drycker som vin, kaffe och te, därför produkter rika på antioxidanter fytokemikalier. Inte överraskande antogs det att dessa ämnen när de väl isolerats från sina naturliga källor, renats och sedan konsumerats i form av kosttillskott som innehåller högre doser än de som kan uppnås i kosten kunde bli kraftfulla kemopreventiva medel. Detta antagande bekräftades av en stor mängd bevis från studier som utnyttjar olika experimentella in vitro- och in vivo-modeller av kroniska sjukdomar, inklusive cancer. . Till exempel, två metaanalyser av human kohort- och fall-kontrollundersökningar med vitamin E8 eller mikronäringspreparat" drog slutsatsen att låga nivåer av antioxidanter inte hade någon effekt, medan höga doser kan öka både förekomsten och dödligheten av cancer och hjärt- och kärlsjukdomar. kosttillskott var baserade på riktiga växter, såsom en specifik blandning av koncentrerad polyfenolrik mat (granatäpple, grönt te, broccoli och gurkmeja), en signifikant skyddande effekt observerades hos män med prostatacancer1.

Klicka här för att veta mer

De lovande effekterna av hela livsmedel i motsats till isolerade föreningar är i linje med livsmedelssynergikonceptet, som definieras som en tillsats eller mer än den additiv påverkan av kombinationen av olika livsmedelsingredienser på människors hälsa. Vår tidigare studie verifierade detta koncept genom att jämföra bioaktiviteterna hos riktiga livsmedel med deras isolerade stora antioxidant. Detta visade att de biologiska effekterna av extrakt av bärfrukter skiljer sig mycket från de som uppvisas av antocyanincyanidin-3-O-glukosid. Vissa andra rapporter indikerade också vikten av interaktioner mellan olika bioaktiva föreningar och matriskomponenter som visade sig vara samverkande faktorer, som bestämmer den slutliga bioaktiviteten hos livsmedel3-1. Våra senaste mekanistiska undersökningar som involverade stegvis rekonstituering av kakaosammansättningen av bioaktivt stödde också idén om livsmedelssynergi men visade att de biologiska effekterna av prover med komplexa sammansättningar inte bara är en kombination av aktiviteterna som visas av enskilda komponenter'3. Alla dessa observationer antydde att när man överväger redoxrelaterade bioaktiviteter av isolerade antioxidanter kontra deras blandningar, måste interaktionerna mellan komponenterna tas med i beräkningen. Den växande komplexiteten hos en blandning avfytokemikalierverkade skapa en nyredoxaktivt ämnesnarare än att berika blandningen med nya aktiviteter som är karakteristiska för den tillsatta substansen, vilket framgår av konceptet för livsmedelssynergi.

Cistanche kan förbättra immuniteten

I den aktuella forskningen förenklade vi det experimentella systemet genom att begränsa det till endast två kärnstrukturer för att fördjupa oss i detaljer om deras interaktioner i samband med kemisk struktur, redoxreaktivitet och redoxrelaterade bioaktiviteter, för att möjliggöra en bättre förståelse och förutsägelse av antioxidanters kemopreventiva potential." De fytokemikalier som användes för detta ändamål var vanliga antioxidanter som fanns i olika örter, grönsaker och frukter, särskilt i citrusfrukter, nämligen: flavonoler representerade av quercetin (O) och dess rhamno-side-rutin ( R) och flavanoner av naringenin (N-) och dessneohesperidosidnaringin (N plus ) samt två blandningar av dessa föreningar (QN-, RN plus ). Den kemiska sammansättningen av studien omfattade bestämningar som gav viss insikt i termodynamik och kinetik för oxidativa processer, dvs. DPPH-test, potentiometrisk titrering och differentiell pulsvoltammetri (DPV). De biologiska testerna undersökte effekten av de studerade proverna på celltillväxt (MTT-test), cellulär antioxidantaktivitet (CAA-analys), genotoxicitet (kometanalys), global DNA-metyleringsnivå (epigenetisk version av kometanalys) och uttrycket av 84 redox -relaterade gener (realtids-PCR-array-baserade teknologier). De biologiska experimenten utfördes med den rekommenderade för näringsstudier kolonadenokarcinom HT29-cellinje som en modell av tarmepitel som kan utsättas för relativt höga koncentrationer av intagna antioxidanter.

Resultat

Våra tidigare undersökningar som jämförde redoxrelaterade egenskaper hos kakaopulver och dess huvudbeståndsdelar pekade på vikten av interaktioner mellan polyfenoliska komponenter i blandningen på den totala antioxidantaktiviteten. I den aktuella forskningen förenklade vi det experimentella systemet för att undersöka sådana interaktioner mer i detalj för ett par flavonoider som är vanliga livsmedelskomponenter. Två flavonoider valdes, både i form av aglykoner och glykosider. Flavonolerna representerades av quercetin (Q) och dessrhamnoside-rutin(R) ochflavanonerav naringenin(N-) och dess neohesperidosid naringin (N plus ). Dessa polyfenoler skiljer sig åt i antal och placering av redoxaktiva hydroxylgrupper såväl som förmågan att bilda intramolekylära H-bindningar, dvs tre strukturella egenskaper som kan störa att reducera egenskaperna hos antioxidantföreningar. Såsom visas i fig. 1 bildades de intermediära semikinonradikalerna i det första steget av oxidation av katekoldelen i ring B

av Q eller R kan stabiliseras på två sätt:8,19. Det första sättet är konjugering av både kärnstrukturen över B- och C-ringarna och den andra H-bindningsbildningen med vicinal OH-grupp eller substituenter i C-ringen, Speciellt i R. närvaron av hydroxylgrupper i sockersubstituenten i position 3 av ring C kan ytterligare förstärka denna stabiliseringseffekt på grund av fler möjligheter till bildning av H-bindningar (direkt eller via vattenmolekyl). Däremot stabiliseras den intermediära fenoxylradikalen i N plus eller N- varken av konjugerade dubbelbindningar som även involverar ring C eller H-bindning med närliggande substituenter. Dessutom, i N plus är sockerdelen fäst till ring A och är därför för långt för att bilda H-bindning med radikalen i ring B. Man kan förvänta sig att dessa strukturella egenskaper påverkar redoxaktiviteten hos studerade flavonoider.

Antioxidantaktivitet genom kemiska tester.

Bestämningen av reducerande egenskaper för de studerade polyfenolerna och deras blandningar utfördes med två kemiska analyser vid 37 grader C för att matcha de cellulära förhållandena för redoxprocesser. Den första metoden var det vanligt använda batchspektrofotometriska DPPH-testet; resultaten för individuella flavonoider och deras blandningar presenteras i fig. 2A. De uttrycks som stökiometrivärden n där siffran 10 hänvisar till reaktionens varaktighet—10 min. Genom att införa tidsparametern i mätningar, införlivades en kinetisk aspekt i bedömningen av antioxidantaktivitet som har beskrivits tidigare13. I dessa bestämningar uppvisade båda aglykonerna starkare reducerande egenskaper än motsvarande glykosider, vilket också tidigare visats med detta test2021, medan flavonoler var mer aktiv än flavanoner. O var den mest effektiva föreningen för att rensa upp DPPHradikal och följdes av R. Trots försumbar reaktivitet mot DPPH, ökade båda flavanonerna, inklusive N som i sig inte uppvisade några redoxegenskaper inom reaktionsperioden på 10 minuter, signifikant den totala antioxidantaktiviteten hos blandningar, i fallet med både aglykoner ON- och glykosider RN plus.

Den andra metoden involverade potentiometrisk titrering (PT) som tillåter mätning av standardreduktionspotential (E), och utvärderade således den termodynamiska förmågan hos rena föreningar att få elektroner. De bestämda värdena för bekräftade att Q och R är starkt reducerande föreningar (Fig. 2B). Men i PT accepterade R donatorelektroner mer villigt än Q. Bestämningen av E för N- och N plus var inte möjlig på grund av mycket långsam elektronöverföring under oxidationsprocessen (långsammare för N plus ). PT mäter skillnaden i potential mellan referenselektroden och mätelektroden efter tillsats av varje del av titranten. Den stabila potentialen innebär att reaktionskvoten (Q) mellan titrant och analyt är stabil (Q= konstant). Om laddningsöverföringshastigheten under en reaktion är låg (låga strömmar i voltammetri), så tar det lång tid att stabilisera Q i PT. Följaktligen, för mycket långsamma reaktioner, är den potentiometriska titreringskurvan svår att erhålla och därför är det hittade värdet för E" mindre tillförlitligt.

Antioxidantaktivitet genom differentiell pulsvoltammetri,

De kemiska testerna som användes antydde att förtydligandet av antioxidantverkan hos polyfenoler måste ta hänsyn till kinetiska aspekter, där stabiliteten hos mellanradikaler kan spela en roll. Såsom illustreras i fig. 1 är semikinonradikaler som bildas vid det första steget av flavanoloxidation mycket bättre stabiliserade än fenoxylradikaler som uppstår vid flavanonoxidation. Detta samband illustreras i fig. 1 och kan påverka hastigheten för redoxprocesser. Därför analyserades reduktionsoxidationsegenskaperna hos studerade rena antioxidanter och deras blandningar ytterligare med hjälp av differentialpulsvoltammetri (DPV). Eftersom denna teknik möjliggör övervakning av både termodynamiska och kinetiska aspekter av oxidationsreaktioner, kombineras båda slutligen i en parameter som kallas antioxidantkraft (AOP)15.

Observationerna som gjordes med DPV-mätningar (Fig. 2B-F) motsäger de som förvärvats med DPPH-testet (Fig. 2A). Överraskande nog avslöjade DPV att Q som beskrivs i litteraturen som ett utmärkt reduktionsmedel, när man endast tar hänsyn till termodynamiska aspekter (anodisk topppotential, E.), visade sig vara den svagaste antioxidanten (Fig.2B, C). Termodynamiskt sett var R en något starkare antioxidant. Intressant nog anses N- och N plus i litteraturen som svaga antioxidanter, uppvisade termodynamiskt de högsta värdena av E, vilket betyder att de var mycket starka reduktionsmedel. För båda flavonoidklasserna ökade glykosiddelen antioxidantaktiviteten hos aglykoner. Kinetikrelaterade parametrar (Fig. 2E, F), dvs. anodström (I,.) och laddningstäthet (Q), visade dock att oxidation av N plus är den långsammare processen jämfört med oxidation av Q och R. På liknande sätt anodisk ström (I) var lägre för N- än för Q och R, men laddningsöverföringen för denna förening nådde det högsta värdet.

I fallet med blandningar detekterades två anodoppar (1:a och 2:a) på voltammetriska kurvor, vilket kunde förväntas för tvåkomponentsblandningen. De bestämda värdena för anodiska topppotentialer (E.) indikerade att den 1:a observerade toppen återspeglar oxidation av flavonoler, medan 2"d toppar oxidationen av flavanoner (Supplementary Materials-Fig. S1). I de flesta fall är närvaron av den andra komponenten i en blandning påverkade termodynamiken och/eller kinetiken för redoxprocessen jämfört med oxidation av de rena föreningarna. Till exempel, för QN-, var värdet av E., för 1:a oxidationstoppen lika med den anodiska topppotentialen för Q oxidation. Emellertid var den 2" anodiska toppen motsvarande N-oxidation och potentialen för denna övergång högre än anodpotentialen för ren N-(Fig.2C). Den motsatta situationen observerades för kinetiken för denna reaktion. I och Q för 1s anodisk topp för QN var nära kinetiska parametrar för rena komponenters oxidation (Fig. 2E, F), medan laddningen som utbyttes under det andra steget av ON-oxidation var mycket lägre än den för N-oxidation (Fig. 2F). Dessa kombinerade termodynamiska och kinetiska effekter resulterade i förbättringen av AOP (fig. 2D) för denna blandning, vilket är i överensstämmelse med resultaten av DPPH-testet.

Cytotoxicitetsbedömning.

Effekten av de studerade flavonoidaglykonerna (Q, N-), glykosider (R, N plus) och deras blandningar (QN-, RN plus ) på tarmcelltillväxt bedömdes med MTT-testet. Den humana kolonadenokarcinom HT29-cellinjen valdes som en modell av epitel i mag-tarmkanalen, dvs vävnaden i direkt kontakt med intagna livsmedelsingredienser såsom polyfenoler. Cellerna behandlades med individuella flavonoider och deras blandningar vid fysiologiska koncentrationer som potentiellt förekommer i blodet (0.01-1 uM)22-2 eller koncentrationer som kan nås i matsmältningskanalen (10-100 uM) efter matintag25-27. Dos-responskurvorna för 6,24 och 72 timmars behandlingar presenteras i Fig.3.

Individuella föreningar påverkade inte celltillväxten signifikant vid någon av de undersökta koncentrationerna, varken för korta eller långvariga behandlingar. Undantaget var den högsta koncentrationen av N- som efter 72 timmar hämmade celltillväxt ner till 75 procent jämfört med kontroll. Däremot stimulerade de undersökta blandningarna (QN-, RN plus ) signifikant celltillväxt på ett koncentrationsberoende sätt för alla testade exponeringstider. Denna effekt observerades vid låga koncentrationer (0.01-1 uM) som kunde nås i blodomloppet och var ännu mer potent vid högre koncentrationer (10-100 uM) till vilka epitelceller i matsmältningskanalen kan bli utsatta. Endast i fallet med den högsta koncentrationen av QN-, efter 72 timmars behandling, upphörde stimuleringen, troligen på grund av hämmande effekter observerade under sådana förhållanden för N-. Cellulär antioxidantaktivitet. Effektiviteten hos renade flavonoider och deras blandningar för att stödja den endogena antioxidantbarriären hos HT29-celler verifierades med hjälp av CAA-analys. Denna metod bygger på förmågan hos ett prov som innehåller redoxaktiva föreningar att hämma eller främja oxidationen av den absorberade sonden av celler till dess fluorescerande form. Dämpningen av sondens oxidation, observerad som släckning av fluorescens, är ett mått på antioxidanternas reducerande kapacitet i cellerna (positiva CAA-värden), medan ökningen av sondoxidationen anger deras prooxidativa aktivitet (negativa CAA-värden)28 . Bestämningarna utfördes för aglykoner och glykosider vid koncentrationer som återspeglar både fysiologiska-endogena- och livsmedelshärledda-exogena tarmexponeringar. Inkubationen med studerade flavonoider utfördes under en rekommenderad standardperiod på 1 h18 för aglykoner och glykosider. De förlängda behandlingarna (3 och 6 timmar) som syftade till att övervaka kinetiken för redoxsvaret i den applicerade cellmodellen användes endast i fallet med aglykoner, på grund av deras mer framträdande inverkan på cellulär antioxidantaktivitet.

De undersökta flavanonerna och flavonolerna skilde sig åt i deras inverkan på redoxstatusen för HT29-celler. I fallet med individuella aglykoner observerades de definierade koncentrationsberoende svaren efter 1 timmes exponering. Flavonol-Q-antioxidantaktiviteten ökade emellertid med applicerad koncentration, medan i fallet med flavanon-N- observerades den gradvisa förstärkningen av den prooxidativa effekten (Fig. 4A). Dosberoendet av individuella glykosider var mindre uppenbart; endast R vid sin högsta koncentration ökade på ett övertygande sätt den cellulära antioxidantaktiviteten (Fig. 4A). Intressant nog visade båda blandningarna förbättrad antioxidantaktivitet, uppenbarligen inte påverkad av den prooxidativa effekten som ses för enskilda föreningar.

Figur 4B visar kinetiken för förändringar av CAA-värden bestämda efter 1,3 och 6 timmars behandling av HT29-celler med aglykoner. För den lägsta koncentrationen (1 μM), matchande fysiologiska exponeringar, observerades inte tidsberoende vare sig för individuella aglykoner eller deras blandning. Inverkan av högre koncentration på CAA-värden var dock klart tidsberoende. De långvariga exponeringarna minskade både den prooxidativa effekten av N- och antioxidantaktiviteten av Q och QN-.

De undersökta aglykonerna visade olika nutrigenomisk aktivitet, dessutom modifierad av koncentrationen som applicerades på celler.

Flavanon N-at l μM minskade signifikant uttrycket av CCL5, CYGB, GTF2I, MT3 (p<0.05) as="" well="" as="" showing="" some="" tendency="" to="" down-regulate="" alox12="" and="" ucp2="" transcription=""><><0.09). the="" increased="" expression="" caused="" by="" n-was="" observed="" for="" the="" ncf2="" gene="" only=""><0.05). these="" genes,="" though="" in="" one="" or="" another="" way,="" related="" to="" cellular="" redox="" status,="" do="" not="" fall="" into="" any="" specific="" common="" pathway="" nor="" are="" involved="" in="" any="" coordinated="" process.="" the="" protein="" encoded="" by="" ccl5="" belongs="" to="" a="" group="" of="" inflammation-relevant="" genes,="" while="" the="" cytoglobin="" gene(cygb)functions="" as="" a="" tumor="" suppressor="" gene2930.="" gtf2i="" protein="" acts="" as="" a="" general="" transcription="" factor="" and="" is="" involved="" in="" the="" coordination="" of="" cell="" growth="" and="" division31.="" so,="" the="" other="" gene="" down-regulated="" by="" the="" n-at="" l="" um="" gene—mt3—may="" cooperate="" with="" it,="" because="" although="" it="" plays="" a="" role="" in="" zinc="" and="" copper="" homeostasis,="" it="" is="" also="" known="" as="" growth="" inhibition="" factor2.="" the="" enzyme="" encoded="" by="" alox12="" acts="" on="" different="" polyunsaturated="" fatty="" acid="" substrates="" to="" generate="" bioactive="" lipid="" mediators3.="" the="" protein="" coded="" by="" ucp2="" has="" been="" described="" as="" a="" mitochondrial="" scavenger="" of="" ros.="" the="" only="" up-regulated="" gene="" by="" n-at="" 1="" um="" was="" ncf2="" which="" encodes="" a="" cytosolic="" protein="" required="" for="" the="" activation="" of="" the="" nadph="" oxidase="" system="" responsible="" for="" superoxide="">

Denna flavanon applicerad på HT29-celler vid 10 uM påverkade uttrycket av 5 gener, som också nedreglerades av dess lägre dos, nämligen: CCL5, CYGB.MT3(p)<0.05)as well="" as="" gtf2i="" and=""><><0.09).additionally,in contrast="" to="" lower="" dose,="" n-at="" 10="" um="" showed="" tendency="" to="" decrease="" expression="" of=""><><0.09). the="" latter="" gene="" codes="" for="" a="" protein="" with="" superoxide="" dismutase="" activity,i.e.,="" the="" antioxidant="" enzyme="" catalyzing="">

dismutation av superoxidradikaler till väteperoxid och syre6. Den lätta ökningen i uttryck orsakad av N-vid 1 0 uM observerades endast för VIMP-genen (0,05<><0.09)that is="" involved="" in="" the="" degradation="" process="" of="" misfolded="" endoplasmic="" reticulum(er)luminal="">

Den här artikeln är hämtad från www.nature.com/scientificreports