Experimentell studie av anti-sports trötthetseffektmekanismer hos Cistanche Deserticola

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

YANG Hong-xin1, YANG Yong2, YAN Xiao-hong1 (1. Department of Cytobiology, Inner Mongolia Medical College, Hohhot 010059, Kina; 2. Department of Oncology, Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region, Huhhot 010017, Kina)

Abstrakt:Mål Att studera effekten avcistanche deserticolapå laktatdehydrogenas (LDH) isoenzym, glykogen och kväveoxidsyntas 3 (NOS3) i levern hos mössen belastar simning och utforskar relevanta molekylära mekanismer för anti-sport trötthet. Metoder Mössen delades in i den normala kontrollgruppen, sportkontrollgruppen ochcistanche deserticolaexperimentgrupp. Varje möss i den orala kontrollgruppen och sportkontrollgruppen fick saltlösning 0,2 ml per dag. Varje möss i experimentgruppen cistanche deserticola fick vattenavkok avcistanche deserticola0,2 mL (3 g/kg) per dag. Administreringarna var under 15 dagar. Belastningssimningen under 90 minuter utfördes på mössen från sportkontrollgruppen och experimentgruppen cistanche deserticola 1 timme efter den senaste administreringen. Lever från mössen avlägsnades efter 10 timmars simning. En del av levern fixerades i den neutrala formalinvätskan för att preparera paraffinsnitten och de andra användes för mätning av LDH-aktivitet. Leverns struktur observerades genom färgning av HE och leverglykogenet mättes genom färgning av glykogen. NOS3 undersöktes med SP immunhistokemisk metod. Resultat Leverstrukturen i sportkontrollgruppen skadades allvarligt, isoenzymet för LDH4 och LDH5 var högre, leverglykogenet var dåligt, NOS3 minskade jämfört med den normala kontrollgruppen (P<0.05). the="" liver="" structure="" of="" the="" cistanche="" deserticola="" experimental="" group="" was="" good,="" ldh5="" isoenzyme="" was="" low,="" the="" glycogen="" was="" rich="" and="" expression="" of="" nos3="" was="" upregulated="" compared="" with="" the="" sport="" control="" group="" (p=""><0.05). conclusions="">Cistanche deserticolakan minska LDH5, skydda levern hos mössen som simmar och påskynda glykogenackumulering genom att öka uttrycket av NOS3 för att skydda levern och förbättra återhämtningen av fysisk kapacitet.

Nyckelord:cistanche deserticola;leverglykogen;kväveoxidsyntas 3;möss.

Cistanche bild

Cistanche,även känd som Dayun, är en tvåårig parasitisk ört från Ledanaceae. Den har torra köttiga stjälkar med fjäll. Det produceras huvudsakligen i sandiga jordar och halvsandiga gräsmarker i Inre Mongoliet, Gansu, Xinjiang, Qinghai och andra platser. Inre MongolietCistanchehar den bästa kvaliteten bland alla producerande områden.Cistancheär söt, salt och varm till sin natur. Den går in injuraroch tjocktarmens meridian. Dess huvudsakliga funktioner är att ge näring till njurarna och stärka yang, ge näring till essensen och blodet och återfukta tarmarna. Det används ofta för att behandla impotens, infertilitet, svag midja och knän, svaghet i muskler och ben, torra tarmar och förstoppning. Denna studie syftar till att observera effekterna avCistanchepå lastbärande simmöss leverlaktatdehydrogenas (LDH), leverglykogen och kväveoxidsyntas 3 (NOS3) genom ett bärande simtest på möss, och för att utforska dess skyddsmekanism på levern. Därför kan den ge en teoretisk grund för fördjupad forskning, utveckling och utnyttjande avCistanche i sport hälsokost.

1 Experimentellt material

1.1 Djur

30 kunmingråttor av hankön, ren kvalitet, kroppsvikt (20±0,5) g, tillhandahållen av Animal Center of Inner Mongolia University.

1.2 Mediciner

Cistanche deserticolaYCMa, producerad i Ejina Banner, Inre Mongoliet och har identifierats. Enligt det ursprungliga medicinska materialet: vatten=100 g: 400 mL, blötlägg först i 30 minuter, värm upp och koka, och avkok sedan på varm eld i 30 minuter. Häll ut det flytande läkemedlet och avkok på nytt i förhållandet 100 g: 200 ml. De två avkokningarna blandades samman och filtrerades med två lager gasväv och koncentrerades sedan till motsvarande 1 g av det ursprungliga medicinska materialet per milliliter vattenavkoksstamlösning, förvarad i ett kylskåp vid 4 grader .

1.3 Reagens och instrument

NOS3 polyklonal antikropp köptes från Wuhan Boster Bioengineering Co., Ltd. SP-kitet köptes från Fujian Maixin Reagent Company. Laktatdehydrogenasisoenzymkit köptes från Inner Mongolia Tongri Reagent Company (exklusivt ägt av Nissan). Nanjing JD-80 färgbildanalysator. Amerikanskt UVP-gelbildanalyssystem.

2 Experimentell metod

2.1 Gruppering och dosering

Kunming-möss delades slumpmässigt in i normal kontrollgrupp, träningskontrollgrupp ochCistancheexperimentgrupp, med 10 möss i varje grupp. Den normala kontrollgruppen och träningskontrollgruppen gavs normal koksaltlösning en gång om dagen, 0,2 ml/gång; deCistancheexperimentgrupp gavscistancheavkok (ta 3 mL av det ursprungliga vattenavkoket och tillsätt vatten till 10 mL). En gång om dagen, 0,2 ml/gång, är daglig dos 3 g/kg och 15 dagar i rad. En timme efter den sista doseringen, mössen i träningskontrollgruppen ochCistancheexperimentgruppen lastades med en blyvikt på 1 g på sina svansar och de placerades i en bassäng på 50 cm hög, 50 cm lång och 35 cm bred för att simma under temperaturen (30±0,5) grader , Observera mössen ständigt, om de visar sig sluta simma, använd en träpinne för att stimulera deras rörelse i 90 minuter. Efter träning, ät en normal diet, vila i 10 timmar och avliva sedan mössen med normala kontrollgruppsmöss. Ta ut levern, fixera en del med 10 procent neutral formaldehyd och gör den 4 µm tjock efter uttorkning, genomskinlighet, vaxnedsänkning och inbäddning. Använd HE-färgningsmetoden för att observera levervävnadens struktur för varje grupp. Den andra delen tvättades med vanlig koksaltlösning och förvarades fryst vid -20 grader och tinades i rumstemperatur under mätningen. Blötlägg torrt med filterpapper och väg, förbered sedan leverhomogenat med normal koksaltlösning, centrifugera vid 3 500 r/min i 15 min. Ta supernatanten och mät laktatdehydrogenasisoenzymaktiviteten genom elektrofores.

2.2 Bestämning av laktatdehydrogenasaktivitet

Med hjälp av polyakrylamidgelelektrofores separeras LDHs isoenzymer enligt deras elektroforetiska mobilitetsskillnader. Separationsgelkoncentrationen i provet är 7 procent, pH 8,9, och koncentrationen av koncentrerad gel är 4 procent, pH 6,8. 10 µL provet blandas med 1 droppe glycerol och bromfenolblått indikator. Elektrodbufferten är Tris-glycin (pH 8,7), börja stabilisera spänningen vid 100-150 V, lägg till 200-250 V efter 30 minuter och elektrofores i 4 timmar. Efter elektrofores färgades det med Lactate Dehydrogenase Isoenzyme Kit och färgades vid 37 grader i 30 minuter, vilket visade ett blått laktatdehydrogenasisoenzymband, sköljdes sedan med vatten, fixerades med isättika. Använd slutligen UVP-gelbildanalyssystem för dataanalys.

2.3 Glykogenfärgning

4 µm tjocka seriella sektioner avparaffineras rutinmässigt till vatten. lägg i 1 procent perjodsyralösning vid 37 grader i 15 minuter. sköljs med rinnande vatten. lägg i Schiff-lösning i 60 min. sköljs med rinnande vatten, dehydreras med gradientetanol, transparent xylen och monteras med neutralt gummi. Titta sedan på färgningsresultaten under mikroskopet.

2.4 Immunhistokemisk färgning

Skivorna avparaffineras rutinmässigt till vatten och antigenet repareras med citratbuffertmikrovågsugn. Agera med lösning A i 10 minuter för att avlägsna endogent peroxidas och blockera med lösning B (utspätt getserum) i 10 minuter. Tillsätt den primära antikroppen i en fuktad låda vid 4 grader över natten och tvätta med pH 7,4 PBS-lösning i 5 min×3 gånger på den andra dagen. Tillsätt sedan biotinmärkt C-lösning (sekundär antikroppsarbetslösning) och inkubera i 10 minuter, tvätta med PBS-lösning i 5 min×3 gånger. Tillsätt pepparrotsperoxidas märkt D-lösning och inkubera i 10 min, tvätta med PBS-lösning i 5 min × 3 gånger. Slutligen utvecklades den i DAB-lösning i 5 minuter, tvättades med kranvatten, HE-motfärgades, dehydrerades med gradientetanol, transparent med xylen och monterades med neutralt gummi. Observera under ett ljusmikroskop efter montering av filmen. I varje sats av experiment användes fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som en negativ kontroll istället för den primära antikroppen.

2.5 Analys av uttryck av kväveoxidsyntas 3

Preliminär observation genom visuell semikvantitativ metod under ljusmikroskop, NOS3-positiv produkt är mörkbrun eller brun. Den positiva produkten finns i cytoplasman hos hepatocyter eller endotelceller mellan hepatocyter, och den blå bakgrunden är negativ. Använd sedan färgbildsanalyssystemet för att mäta gråvärdet för den positiva reaktanten. Under en 40x objektivlins mäts parametrarna för 4 synfält slumpmässigt för varje film och medelvärdet tas. Denna parameter används för att återspegla förändringen av NOS3-färgningsintensiteten.

2.6 Statistiska metoder

All data uttrycks som x-±s och SPSS11.0 statistiskt programpaket används för t-test, och P<0.05 is="" considered="" as="" significant="">

3. Resultat

3.1 Observation av vävnadsstruktur under optiskt mikroskop

Strukturen av leverlobuli i den normala gruppen är tydlig, cellsträngarna är ordnade prydligt, leversinusoiderna är normala, levercellerna har inga uppenbara lesioner och kärnstrukturen är tydlig. Den normala vävnadsstrukturen för träningskontrollgruppen försvann, lobulens gränser var oklara, och cellsträngen var störd, de flesta leversinusoiderna försvann och omfattande vakuolär degeneration av hepatocyter manifesteras av ökad cellvolym. Cytoplasman är lös, lätt färgad, till och med klar och genomskinlig, och vissa leverceller visar en typisk ballongförändring, med en liten mängd fokal eller punktformig nekros. Levercellerna iCistancheexperimentgruppen var svagt grumlig, men de arrangerades regelbundet. Det fanns inga uppenbara vakuoler och löshet i cellerna, cellsladdarna var snyggt ordnade och kärnstrukturen var tydlig.

3.2 Effekter på aktiviteten av leverlaktatdehydrogenasisoenzymer hos möss under belastningsträning (se tabell 1)

3.3 Observation av leverglykogenfärgning under optiskt mikroskop

Även om halten av glykogen i den normala kontrollgruppen inte är hög, finns det glykogen i varje levercell, fördelningen är enhetlig och det finns inget vakuolfenomen. Träningskontrollgruppen hade mindre glykogen, utspridda i levercellerna, och vakuoler uppträdde i vissa områden; experimentgruppen Cistanche var rik på glykogen, men samlade mycket på ena sidan av cellen.

3.4 Observation av uttrycket av kväveoxidsyntas 3 genom optiskt mikroskop och kvantitativ bildanalys

Det finns ett starkt positivt uttryck i cytoplasman hos hepatocyter i den normala kontrollgruppen, som är diffust fördelat, speciellt i binukleära celler, och positivt uttryck i endotelceller. Uttrycket i cytoplasman av hepatocyter och endotelceller i träningskontrollgruppen försvagades.Cistancheexperimentgruppen hade positivt uttryck i cytoplasman av hepatocyter och starkt positivt uttryck i endotelceller. Analysresultaten för färgbildsanalysatorn visas i tabell 2.

4. Diskussion

Människokroppens rörelser behöver energi, och kroppen behöver också energi i ämnesomsättningsprocessen Cellmetabolism använder direkt energi från nedbrytningen av adenosintrifospat (ATP), och den energi som krävs för syntesen av ATP tillhandahålls i slutändan huvudsakligen av katabolismen av socker . Studier har visat att efter ansträngande träning kommer kroppen att producera en stor mängd H plus , fria radikaler, mjölksyra och andra ämnen som påverkar cellers normala metabolism. Samtidigt leder bristen på glukos i cellerna till träningströtthet och cellskador. Resultaten av denna studie visar att skador på levervävnadens struktur är mycket allvarliga efter mycket träning, och det påverkar även cellanabolism, såsom minskningen av leverglykogensyntesen. Möss som tar Cistanche kan observeras minska leverskador efter mycket träning, främst på grund av minskningen av LDH5, och leverglykogenhalten är betydligt högre än hos träningskontrollgruppen, vilket tyder på attCistanchekan uppnå leverskydd och bibehålla normal fysiologi genom att minska LDH5-funktionen. Från resultaten av glykogenfärgning, glykogenhalten iCistancheexperimentgruppen är högre än den för den normala kontrollgruppen. gör detCistancheöka leverglykogenreserverna före träning eller påskynda glykogensyntesen under stress efter träning? Ingen slutsats kan dras eftersom det inte finns någon kontrollgrupp som inte tränarCistanchei experimentet. Det har ännu inte bekräftats i nästa steg, men den skyddande effekten av Cistanche på levern och främjandet av glykogensyntes efter mycket träning är uppenbara.

NO är en liten molekyl substans som har värderats högt av idrottsvärlden de senaste åren. NOS är den huvudsakliga hastighetsbegränsande faktorn för NO-produktion. Det har bekräftats att NOS har 3 typer av isoenzymer. NOS1 kallas neuronalt kväveoxidsyntas. Det finns i neuronala celler, skelettmuskelceller etc., och är huvudsakligen involverat i neuroutveckling, neurosekretion, inlärnings- och minnesprocesser. NOS2 är ett inducerbart kväveoxidsyntas, som huvudsakligen finns i glatta muskelceller, makrofager och lymfocyter. När detta enzym har inducerats kan det fortsätta att syntetisera NO tills substratet är uttömt eller cellen dör. Det tros för närvarande vara inblandat i cellskador; NOS3 är en endotelial kväveoxidsyntas, som huvudsakligen distribueras i endotelceller och hepatocyter. Det producerade NO är huvudsakligen involverat i fysiologiska funktioner. Resultaten av denna studie visar att uttrycket av NOS3 i endotelceller och hepatocyter försvagas efter mycket träning, och det resulterande NO reduceras, så att blodkärlen inte effektivt kan expanderas, blodflödet minskar och råvarorna för syntetiskt glykogen kan inte transporteras till levercellerna, så glykogensyntesen minskar.

Cistanche anti-utmattningsfunktion

Cistanchekan uppreglera uttrycket av NOS3 i endotelceller och leverceller. Expandera blodkärlen reaktivt. Öka blodflödet, påskynda förmågan att transportera glykogensyntesråmaterial. Accelerera glykogensyntesen och bibehåll kroppen på en normal fysiologisk metabolisk nivå. Därför kan en minskning av LDH5 för att skydda levern och uppreglering av uttrycket av NOS3 för att främja mjölksyraglukoneogenes vara en viktig mekanism förCistancheför att skydda levern och främja fysisk återhämtning. Denna forskning ger en vetenskaplig experimentell grund för vidareutveckling och användning avCistancheinom det idrottsmedicinska området, och lägger också grunden för utveckling och rening avCistanches effektämnen.

Artikal från: "Experimental Study of Anti-Sports Fatigue Effect Mechanisms of Cistanche Deserticola" av YANG Hong-xin1, etc.

-----Chinese Journal of Information on TCM Apr.2008 Vol.15 No.4