Extraviralt DNA i adenoassocierade virala vektorpreparat inducerar TLR9-beroende medfödda immunsvar i humana plasmacytoida dendritiska celler

Adenoassocierade virala (AAV) vektorsuspensioner producerade i antingen humant härledda HEK-celler eller i Spodoptera frugiperda (Sf9) insektsceller skiljer sig i termer av kvarvarande värdcellskomponenter såväl som artspecifika posttranslationella modifieringar som visas på AAV-kapsidproteinerna . Här analyserade vi effekten av dessa skillnader på vektorns immunogena egenskaper. Vi stimulerade humana plasmacytoida dendritiska celler med olika massor av HEK-cellproducerade och Sf9-cellproducerade AAVCMV-eGFP-vektorer härledda från olika tillverkare. Vi fann att AAV8-CMV-eGFP såväl som AAV2-CMV-eGFP-vektorer inducerade partispecifika men inte produktionsplattformsspecifika eller tillverkarspecifika inflammatoriska cytokinsvar. Dessa kan reduceras eller avskaffas genom att blockera tollliknande receptor 9-signalering eller genom att enzymatiskt reducera DNA i vektorpartierna med användning av DNas. Framgångsrik HEK-celltransduktion med DNas-behandlade AAV-lots och DNA-analyser visade att DNas inte påverkade vektorns integritet utan degraderade extraviralt DNA. Vi drar slutsatsen att både HEK- och Sf9-cellshärledda AAV-preparat kan innehålla immunogena extravirala DNA-komponenter som kan utlösa partispecifika inflammatoriska immunsvar. Detta tyder på att förbättrade strategier för att avlägsna extravirala DNA-föroreningar kan vara avgörande för att minska de immunogena egenskaperna hos AAV-vektorberedningar.

cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret

Det senaste decenniet har bevittnat ett enormt intresse för utvecklingen av nya rekombinanta adenoassocierade virus (AAV)-baserade strategier för både grundforskning och kliniska tillämpningar1–3. Den främsta anledningen ligger i det faktum att AAV-vektorer har varit extremt mångsidiga verktyg inom genterapiområdet med tanke på deras förmåga att effektivt och säkert leverera terapeutiska gener till målvävnader4. Men ett växande antal utredare rapporterar oberoende fynd som tyder på lokala och systemiska immunsvar efter leverans av AAV i prekliniska och kliniska studier5–8.

AAV-vektorer har visat sig aktivera medfödda immunmönsterigenkänningsreceptorer såsom toll-like receptor (TLR)2 och TLR9, vilket resulterar i frisättning av inflammatoriska cytokiner och typ I-interferoner (IFN)9,10. Immunogena komponenter av AAV som kan stimulera dessa svar inkluderar kapsidproteiner och vektorgenom9,10. Immunsvar efter applicering av AAV kan också utlösas av föroreningar i vektorsuspensionen5,11. Dessa föroreningar har definierats som vilken komponent som helst som är närvarande i den renade AAV-vektorsuspensionen annan än den önskade produkten12 och är resultatet av vektorns produktionsprocessen. Två av de viktigaste metoderna för att producera kliniska rekombinanta AAV-vektorer involverar transfektion av plasmid-DNA till HEK-celler och infektion av Spodoptera frugiperda (Sf9) insektsceller med bacoluvirus13. Följaktligen kan potentiellt immunogena föroreningar som finns i AAV-vektorsuspensioner inkludera endotoxiner, cellodlingsmediumkomponenter, reagens som används för AAV-rening, proteiner och DNA som härrör från värdceller och kvarvarande bakuloviralt DNA eller plasmid DNA5. Ytterligare faktorer som kan påverka immunogeniciteten hos AAV-vektorsuspensioner är post-translationella modifieringar (PTM) som är präglade på kapsiden av de olika vektorproduktionsplattformarna5. Viktigt är att HEK-cell-härledda och Sf9-cell-härledda AAV-vektorer skiljer sig mycket när det gäller deras PTM, deras kvarvarande värdcellproteinföroreningar11 och potentiellt även i deras DNA-föroreningar (HEK-cells-DNA vs. Sf9-cells-DNA såväl som kvarvarande plasmid-DNA kontra bakuloviralt DNA)14. Plasmacytoida dendritiska celler (pCD) är en specialiserad medfödd immuncellstyp som utsöndrar stora mängder typ I IFN och pro-inflammatoriska cytokiner vid virusinfektioner9,15 och spelar en viktig roll i avkänningen av AAV-vektorer9. Följaktligen, för att analysera om skillnaderna mellan HEK-cellproducerade och Sf9-cellproducerade AAV-vektorer resulterar i skillnader i deras immunogena egenskaper, stimulerade vi humana pDCs med olika partier av samma AAV-vektor erhållen från de två produktionssystemen och olika tillverkare. Vi fann att hälften av de undersökta vektorpartierna framkallade partispecifika pro-inflammatoriska immunsvar som varken var relaterade till vektorproduktionssystemet eller tillverkaren. Dessa svar förmedlades av TLR9-signalering och mottagliga för behandling av vektorpartierna med DNas. Framgångsrik HEK-celltransduktion av både obehandlade och DNas-behandlade AAV-vektorlots och DNA-analyser av AAV-preparat antydde att DNas inte påverkade AAV-partikelintegriteten utan snarare riktade sig mot icke-inkapslat extraviralt DNA. Sammantaget antyder detta att AAV-vektorberedningar kan innehålla icke-inkapslat extraviralt DNA som kan påverka de immunogena egenskaperna hos AAV-vektorberedningar i humana pDCs.

Fördelarna med cistanche tubulosa-stärka immunförsvaret

Resultat

AAV inducerar partispecifika medfödda immunsvar i humana pDCs.

Studier har visat att HEK-cellhärledda och Sf9-cellhärledda AAV-vektorer skiljer sig åt vad gäller deras PTM och föroreningar som finns i virussuspensionerna11. Vi antog att dessa faktorer kunde resultera i skillnader i de immunogena egenskaperna mellan HEK-cell- och Sf9-cell-härledda vektorpartier. För att testa denna hypotes analyserade vi totalt åtta AAV serotyp 8 (AAV8) vektorlots som innehöll den identiska DNA-sekvensen av cytomegaloviruspromotor (CMV) och den identiska transgenen för det förstärkta gröna fluorescensproteinet (eGFP) (AAV8- CMV-eGFP; fem HEK- och tre Sf9-cellhärledda lots) och fyra AAV2-CMV-eGFP-lots (två HEK- och två Sf9-cellhärledda lots) från tre olika tillverkare [tillverkare A; Viral Vector Core Facility vid University of Iowa (Iowa, USA), tillverkare B; Virovek (CA, USA) och tillverkaren C; Vigene Biosciences (MD, USA)]. För att maximera likheterna mellan satserna framställdes de sju AAV8-satserna från tillverkare A och tillverkare B (tabell 1) med användning av samma ursprungliga plasmid. Dessutom utfördes en droplet digital PCR (ddPCR)-registrering av vektorgenomen (vg) för AAV-vektorlotterna i en sida-vid-sida-mätning med två olika mål: en inom CMV-sekvensen och den andra inom eGFP-sekvensen av vektorerna. Resultat erhållna genom kvantifiering av CMV-målet användes för titrering av AAV-vektorsatserna i följande experiment (tabell 1). pDCs är specialiserade virala sensorer som massivt producerar typ I IFN vid virusinfektion15, inklusive AAV-vektorer9. För att undersöka om HEK-cell-producerade och Sf9--cell-producerade AAV-vektorer skiljer sig i sin förmåga att framkalla medfödda immunsvar i immunkompetenta celler, stimulerade vi humana pDCs med de ovan listade AAV-vektorlotterna. För detta ändamål renades pDCs från perifera mononukleära blodceller (PBMC) från individuella friska humana donatorer genom negativ selektion med hjälp av magnetisk aktiverad cellsortering (MACS). Flödescytometrianalys bekräftade renheten hos de isolerade pDCs på över 90% (Fig. S1). Tio pDCs från en individuell donator såddes och stimulerades med AAV8- och AAV2-vektorlotter vid en MOI på 1:1 × 106 vg/cell under 18 timmar. MOI av 1:106 vg/cell applicerad på totalt 12 500 celler i 50 ul/brunn översätts till en titer på 2,5 x 1011 vg/ml. Vi använde denna titer eftersom den ligger inom intervallet för vad som tillämpas i retinala genterapistudier på människor (t.ex. 1 × 1012 vg/ml16 eller 4 × 1011–1,3 × 1012 vg/ml17) och icke-mänskliga primater (t.ex. 5 × 1011–5 × 1012 vg/ml6). Stimulering med fordonet fungerade som kontroll. Inkubation med AAV8- och AAV2-vektorlots resulterade inte i något detekterbart transgenuttryck i pDCs. Fyra av de åtta AAV8-lotterna (partierna A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf9-1) och två av fyra AAV2-lots (partier B-Sf9-1, B-Sf9-2) inducerade reaktiv cellproliferation i de stimulerade pDCs (fig. la). Detta åtföljdes av en frisättning av pro-inflammatoriska cytokiner (IP-10, MIP-1 och TNF-) och typ I IFN (IFN-). Omvänt inducerades varken cellproliferation eller cytokinfrisättning av återstående AAV8 (partier A-Sf9-1, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK{{92} }) och AAV2-partier (partier C-HEK-1, C-HEK-2). Dessa resultat bekräftades i tre till fyra oberoende experiment var och en utförd med cellerna från en individuell donator (Fig. 1a-c och Tabell S1). Lotspecifika skillnader i cytokinkoncentrationerna i dessa oberoende experiment analyserades statistiskt med hjälp av en linjär blandad effektmodell och post hoc Dunnetts test (Q=2.6) genom att jämföra de minsta kvadratiska medelvärdena för de olika AAV-vektorlotterna med fordonskontrollen (tabell S2 och S3). Detta visade statistiskt signifikanta skillnader i cytokinsvaren mellan "immunogena" AAV-vektorlots (AAV8 lots A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf{ {114}}, eller AAV2-partier B-Sf9-1, B-Sf9-2 respektive) och kontroll men inga signifikanta skillnader mellan "icke-immunogena" AAV-vektorlots (AAV8-partier A-Sf{{ 123}}, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK-1 eller AAV2 partier C-HEK-1, C-HEK-2 respektive) och kontroll (tabell S3). Koncentrationerna av resten av de uppmätta cytokinerna som ingår i multiplexanalysen var antingen under analysintervallet (dvs. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 , IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, GM-CSF, IFN-) eller varken det "immunogena" eller de "icke-immunogena" vektorpartierna inducerade några signifikanta ökningar av deras frisättning (dvs. IL-7, IL-8, G-CSF, MCP-1) (Fig. S2), vilket tyder på en grad av specificitet i det AAV-medierade cytokinsvaret. För att undersöka cytokinsvar vid en tidigare tidpunkt stimulerades pDCs med den "immunogena" AAV8-vektorlotten A-HEK-1. Vi observerade en signifikant ökning av koncentrationen av TNF- i supernatanten redan 2 timmar efter pDC-stimulering. Detta svarsmönster kunde bekräftas i tre experiment, var och en utförd med cellerna från en individuell donator (Fig. S3). För att undersöka om en högre dos av en "icke-immunogen" AAV8-vektorlot kunde utlösa ett immunsvar, stimulerade vi pDCs med den tekniskt maximalt tillämpliga MOI (1:4,61 × 106 vg). Intressant nog upptäcktes varken reaktiv cellproliferation eller cytokinsvar vid stimulering med denna ökade titer (Fig. S4). I motsats till vår hypotes visar dessa resultat att medfödda immunsvar mot AAV i pDCs var partispecifika och inte relaterade till ett specifikt produktionssystem eller tillverkare/reningsmetod.

Tabell 1. Olika partier av AAV8- och AAV2-virusvektorer som används i denna studie.

Figur 1. Induktion av AAV-vektorpartispecifika immunsvar i humana pDCs. Human pDCs stimulerades med olika mängder AAV8-CMV-eGFP och AAV2-CMV-eGFP (MOI: 1:1× 106 vg) i 18 timmar (a) Representativa ljusfältsbilder av pDCs stimulerade med vehikelkontroll (övre bilden) eller en immunogen AAV-vektorlot (nedre bilden). Skalstången är 100 μm. (b) Cytokinfrisättning av IP-10, MIP-1, TNF- och IFN- 2 av AAV8-stimulerade pDC:er. (C) Cytokinfrisättning av AAV2-stimulerade pDCs. Representativa plotter av ett av tre till fyra oberoende experiment. Eftersom i IFN- 2-mätningarna (b,c) och TNF-mätningar (c) föll vissa värden under analysintervallet, adderades konstanten 1 till alla uppmätta IFN- 2- och TNF-värden för presentation i en semi-logaritmisk plot. Median och interkvartilintervall visas. I etiketterna för de individuella vektorpartierna representeras de tre tillverkarna av bokstäverna A, B och C; HEK-cellhärledda och Sf9-cellhärledda vektorer indikeras med "HEK och "Sf9" och motsvarande partier från samma tillverkare och samma produktionssystem är numrerade "1, 2, 3". Cirkel: HEK-härledd vektorparti; triangel: Sf9-härlett vektorparti; svart: vektorparti från tillverkare A; orange: vektorparti från tillverkare B; grönt: vektorparti från tillverkare C.

Immunsvaret på AAV-stimulering i pDCs påverkas inte av skillnader i kapsid/VG-förhållande.

Prekliniska studier har visat att skillnader i antalet fulla och tomma vektorpartiklar i AAV-vektorsuspensioner kan påverka ett immunsvar18. För att bedöma om skillnaderna i immunogena egenskaper mellan de analyserade vektorpartierna berodde på skillnader i förhållandet mellan fulla och tomma vektorpartiklar, bestämde vi titern för vektorkapsider i alla AAV-partier med AAV-titrerings-ELISA och beräknade kapsiden/VG förhållande. Intressant nog hittades stora skillnader i kapsid/vg-förhållandet mellan alla AAV-partier (Fig. 2). Ungefär två gånger fler kapsider än vg (2:1) hittades i AAV8-CMV-eGFP-partier A-HEK-1, A-HEK-3, A-Sf{{11} } och AAV2-CMV-eGFP B-Sf9-1; och fyra gånger mer (4:1) i AAV8 lot A-Sf9-1. Ett 1:1-förhållande observerades i resten av partierna. Däremot hittades inga signifikanta skillnader mellan kapsid/vg-förhållanden för "immunogena" och "icke-immunogena" AAV-vektorlots i AAV8 (P=0.27) eller i AAV2 (P=0.37) vektorpartier (fig. 2). Detta tyder på att skillnaderna i de immunogena egenskaperna hos de analyserade AAV-vektorlotterna inte heller var relaterade till skillnader i förhållandet mellan fulla och tomma vektorpartiklar.

cistanche tillägg fördelar-hur man stärker immunförsvaret

Igenkänning av "immunogena" AAV8-vektorlots av TLR9.

Det har visats att den medfödda immunigenkänningen av AAV av murina och humana pDCs medieras av DNA-avkänning av TLR99. Följaktligen utvärderade vi om TLR9 också var involverad i igenkänningen av våra "immunogena" AAV8-vektorlots. För detta ändamål såddes pDCs såsom beskrivits och odlades med TLR9-antagonisten H154 (50 µM) följt av stimulering med de "immunogena" AAV8-vektorlotterna A-HEK-1, A-HEK-2, A -HEK-3 och A-Sf9-1 (MOI: 1:1× 106 vg). Efter 18 timmar observerades inga tecken på cellproliferation (Fig. 3a) och en signifikant minskning av frisättningen av IP-10, MIP-1, TNF- och IFN- mättes (Fig. 3b). Detta indikerar att immunsvar på "immunogena" AAV8-vektorlotter i humana pDCs medieras av TLR9-signaleringen.

Figur 2. Jämförelse av kapsid/vg-förhållanden mellan olika AAV8-CMV-eGFP och AAV2-CMV-eGFP vektorlots. Kapsid/vg-förhållandena härrör från absorbansmätningar (ELISA) och ddPCR-resultat av (a) åtta AAV8-vektorlots och (b) fyra AAV2-vektorlots. Streckade linjer separerar "immunogena" från "icke-immunogena" AAV-vektorlots. Staplar anger medelvärden och standardavvikelser för replikat. Statistisk signifikans bestämdes med hjälp av oparat Student t-test.

Figur 3. Igenkänning av "immunogena" AAV8-CMV-eGFP-vektorlots av pDC är TLR9-beroende. Humana pDCs behandlades med TLR9-antagonisten H154 (50 μM) följt av stimulering med "immunogena" AAV8-vektorlots (MOI: 1:1×106 vg) under 18 timmar. (a) Representativa ljusfältsbilder av renade pDCs behandlade med "immunogena" AAV-vektorpartier (övre bilden) eller "immunogena" AAV-vektorpartier och H154 (nedre bilden). Skalstrecket är 100 μm. (b) Cytokinfrisättning av IP-10, MIP-1, TNF- och IFN- 2 av stimulerade pDC. Eftersom vissa värden i IFN- 2-mätningarna föll under analysintervallet lades konstanten 1 till alla uppmätta IFN- 2-värden för presentation i en semi-logaritmisk plot. Medelvärden och standardavvikelser visas. Statistisk signifikans bestämdes med envägs ANOVA och Holm-Sidaks post hoc-analys. P-värden: Mindre än eller lika med 0,05: *; Mindre än eller lika med 0,01: **; Mindre än eller lika med 0,001: ***.

DNas-behandling minskar immunsvar av "immunogena" AAV8- och AAV2-vektorlots.

Medan "immunogena" AAV8-vektorer framkallade ett TLR9-beroende immunsvar i pDCs, inducerades inga sådana svar av de "icke-immunogena" partierna. TLR9 aktiveras som svar på DNA, i synnerhet DNA som innehåller ometylerade CpG-motiv9. Viktigt är att våra ddPCR-mätningar bekräftade att samma virala DNA-komponenter fanns i både "immunogena" och "icke-immunogena" vektorpartier. Sammantaget antydde detta att oförpackat/fritt DNA i den virala suspensionen snarare än det intravirala DNA:t kunde vara orsaken till de observerade immunsvaren mot "immunogena" AAV-vektorpartier. Följaktligen, om kvarvarande fritt DNA fanns närvarande i den virala suspensionen av de "immunogena" AAV8-vektorlotterna, bör det medfödda immunsvaret dämpas av DNas. För att testa denna hypotes förbehandlades "immunogena" AAV8- och AAV2-vektorpartier med DNas I (100 µg/ml) under 30 minuter före AAV-stimulering. För att utesluta icke-specifika effekter av DNas-behandling på pDCs eller AAV-partiklarna, i AAV-enbart-stimuleringarna, utsattes vektorerna för DNasemock-behandling före pDC-stimulering. I dessa skenbehandlingar utan DNas inkuberades AAV-partiklarna vid 37 grader i ett identiskt DNas-digereringsmedium under samma tidsperiod som de DNas-behandlade AAVs. Tio pDC såddes och stimulerades med de DNas-förbehandlade eller skenbehandlade "immunogena" AAV-vektorlotterna (MOI: 1:1 × 106 vg). pDCs som inkuberades med endast DNas eller skenbehandlade med en vehikel tjänade som kontroller. Intressant nog minskade DNas-behandling av de "immunogena" AAV8- och AAV2-vektorpartierna reaktiv cellproliferation (Fig. 4a) och antingen avskaffades fullständigt (AAV8-partier A-HEK-2 och A-Sf9-1; AAV2-partier B-Sf9-1 och B-Sf9-2) eller avsevärt reducerad (AAV8 lots A-HEK-1 och A-HEK-3) lanseringen av IP{{40} }, MIP-1, TNF- och IFN- efter AAV-stimulering (Fig. 4b,c). För att bekräfta att den observerade DNas-effekten faktiskt orsakades av nedbrytningen av extraviralt DNA och inte av en effekt av DNaset på vektorns integritet, undersökte vi om DNas-behandling av AAV-vektorpartier påverkade transduktionskapaciteten hos AAV. Eftersom AAV-applikationen inte resulterade i någon detekterbar pDC-transduktion, användes HEK-celler för dessa analyser eftersom HEK-celler är en välkänd cellmodell för att analysera transduktionseffektivitet vid AAV-transduktion19. Vi stimulerade HEK293T-celler med DNas-behandlade och skenbehandlade AAV8- och AAV2-vektorlots (MOI: 1:8 × 104 vg) och utvärderade transduktionseffektiviteten genom fluorescensmikroskopi 3 dagar efter vektorapplicering. Som beskrivits visade AAV2-vektorer en högre transduktionsstyrka jämfört med AAV8-vektorer. Viktigt, dessutom, reducerade förbehandling med DNas varken transduktionseffektiviteten i de HEK-härledda eller i Sf9--cellhärledda AAV8- och AAV2-vektorlotterna (Fig. S5a,b). Dessa resultat ger ytterligare bevis för att DNas-effekten på de immunogena egenskaperna hos vektorpartierna beror på nedbrytningen av det extravirala DNA:t. Även om TLR9-antagonisten H154 i huvudsak avskaffade frisättningen av proinflammatoriska cytokiner för alla fyra immunogena AAV8-loterna (Fig. 3), kunde DNas-förbehandling också eliminera det pro-inflammatoriska cytokinsvaret för AAV8-partierna A-HEK{{75} } och A-Sf9-1, medan den inte helt tog bort den för AAV8-partierna A-HEK-1 och A-HEK-3 (Fig. 4). För att testa om en ökad DNas-behandlingstid kunde upphäva detta cytokinsvar, upprepade vi simuleringsexperimenten av pDCs efter en tiofaldig ökning av DNas-inkubationstid för respektive lot (A-HEK-1 och A-HEK{{87} }). Vi observerade att efter DNas-behandling av vektorerna i 5 timmar, minskade de genomsnittliga cytokinkoncentrationerna i supernatanten av de AAV-stimulerade cellerna ytterligare och var inte längre signifikant annorlunda än den för vehikelkontroll. Detta svarsmönster kunde bekräftas i tre experiment, var och en utförd med cellerna från en enskild donator (Fig. S6). Detta tyder på att den centrala orsaken till det TLR9-beroende pro-inflammatoriska immunsvaret i pDC verkligen är extraviralt DNA. För att testa om frisättningen av intraviralt DNA ökar den immunstimulerande aktiviteten hos AAV-vektorer, öppnade vi medvetet de virala kapsiderna i den "immunogena" AAV8-partiet A-HEK-1 genom värmebehandling vid 95 grader i 10 minuter . Det värmebehandlade vektorpartiet användes sedan för att stimulera pDCs. Även om det inte fanns några skillnader i den reaktiva cellproliferationen vid AAV8 lot A-HEK-1-stimulering med och utan värmebehandling, var det en signifikant ökning av frisättningen av IP-10, MIP-1 , TNF- och IFN- i det uppvärmda behandlade tillståndet, vilket indikerar att frisättningen av inkapslat viralt DNA i vektorsuspensionen kan bidra till induktionen av immunsvar (fig. 5). Tillsammans indikerar dessa data att AAV-vektorberedningar kan innehålla extravirala DNA-kontaminanter som kan utlösa partispecifika immunsvar i pDCs. Dessa svar förmedlas av TLR9-signalering och kan reduceras/avskaffas genom behandling av vektorpartierna med DNas.

Figur 4. DNas-förbehandling minskar immunsvar som induceras av "immunogena" AAV8-CMV-eGFP och AAV2-CMV-eGFP vektorlots. Humana pDCs stimulerades med DNas-behandlade "immunogena" AAV8-vektorlotter under 18 timmar (MOI: 1:1 × 106 vg). (a) Representativa ljusa fältbilder av renade pDCs stimulerade med "immunogena" AAV-vektorlots (övre bilden) och "immunogena" AAV-vektorlots förbehandlade med 1{{30}}0 ug/ml DNas I (nedre bilden). Skalstången är 500 μm. (b) Cytokinfrisättning av IP-10, MIP-1, TNF- och IFN- 2 av AAV8-stimulerade pDC. (c) Cytokinfrisättning av AAV2-stimulerade pDCs. Eftersom i IFN- 2-mätningarna (b och c) och TNF-mätningar (b), vissa värden föll under analysintervallet, lades konstanten 1 till alla uppmätta IFN- 2- och TNF-värden för presentation i en semi-logaritmisk plot. Medelvärden och standardavvikelser visas. Statistisk signifikans bestämdes med hjälp av envägs ANOVA och Holm–Sidaks post hoc-analys. P-värden: Mindre än eller lika med 0,05: *; Mindre än eller lika med 0,01: **; Mindre än eller lika med 0,001: ***.

Explorativ analys av extravirala DNA-kontaminanter i AAV8-vektorberedningar.

För att utföra den första utforskande karakteriseringen av de extravirala DNA-komponenterna i AAV-vektorlotterna, en representativ "immunogen" (A-HEK-1) och "icke-immunogen" (B-HEK-1) HEK-cellhärledda vektorpartier analyserades. Dessa partier var antingen DNas-behandlade i pDC-medium i 30 minuter vid 37 grader enligt beskrivningen ovan, eller var skenbehandlade och ultrafiltrerade med en 100 kDa cut-of-filtreringsanordning, eller var bara skenbehandlade (Fig. S7a– g). Konsekutiv Bioanalyzer LabChip-separation och bedömning av det renade DNA:t avslöjade närvaron av jämförbara mängder vektor-DNA (Fig. S7b–g) i behandlade och skenbehandlade prover av varje lot, vilket bekräftar att varken ultrafiltrering eller DNas-behandling påverkade DNA-innehållet inuti kapsiden. Dessutom visade det att endast den "immunogena" (Fig. S7a–d) men inte den "icke-immunogena" vektorlotten (Fig. S7a,e–g) innehöll ytterligare DNA-molekyler som sträckte sig i storlek från 100 till 450 bp (Fig. S7a, e–g) S7c,d och h). Viktigt är att dessa ytterligare DNA-molekyler kunde detekteras i det mock-behandlade provet och det ultrafiltrerade provet men var praktiskt taget frånvarande i det DNase-behandlade provet (Fig. S7a-d). Detta indikerar att dessa DNA-molekyler representerar extravirala DNA-kontaminanter som kan brytas ned av DNas men inte kan avlägsnas från vektorsuspensionen genom ultrafiltrering. Finansieringen av att dessa kontaminanter endast kunde detekteras i den "immunogena" men inte i den "icke-immunogena" vektorpartiet bevisar att förekomsten av dessa extravirala DNA-molekyler är partispecifik och kan dessutom antyda att dessa molekyler inducerar eller bidrar till vektorns immunstimulerande egenskaper. För att bedöma den potentiella källan till det kontaminerande DNA:t i den "immunogena" (A-HEK-1) och "icke-immunogena" (B-HEK-1) mängder av kvantitativ (q)PCR-analys av HEK cell-DNA, plasmid-DNA och AAV-vektor-DNA utfördes. Mall-DNA från DNas-behandlade, mock-behandlade och ultrafiltrerade och endast mock-behandlade prover av varje lot användes för amplifiering av Alu-upprepning, nukleärgenomet multicopy NPIP-gen och mitokondriella 16S rRNA-gensekvenser (mt16S) av HEK-cellursprung , för amplifiering av en AAV8 inverterad terminal upprepad amplikon (ITR2; vektor- och transgenplasmid-DNA-ursprung), och för amplifiering av ett amplikon för blah-genen (ampicillinresistens) (Amp; plasmid-DNA-ursprung) (tabell S4). Jämförelse av förhållandena mellan ΔCt-värdena för HEK-cell-DNA-specifik amplikon kontra ITR2-amplikon (dvs. Alu vs. ITR2, NPIP vs. ITR2 och mt16S vs. ITR2) och plasmid-DNA-specifika amplikon kontra ITR2-amplikon (Amp) kontra ITR2), indikerar att de två partierna innehåller försumbara mängder HEK-cellskärn- och mitokondrie-DNA. Däremot avslöjade analysen en anständig mängd plasmid-DNA i både det "immunogena" och det "icke-immunogena" vektorpartiet (cirka 1/32 respektive 1/50, vad gäller antal kopior i förhållande till AAV-DNA). en andel som ligger väl inom intervallet för värden som rapporterats för andra AAV-vektorer12 (Fig. S7). Icke desto mindre fanns det inga uppenbara skillnader i den relativa andelen vektor-DNA till plasmid- och HEK-cell-DNA mellan de DNas-behandlade och mock-behandlade eller ultrafiltrerade och mock-behandlade proverna av båda vektorpartierna (Fig. S8). Detta kan tyda på att det icke-förpackade kontaminant-DNA:t liknar det förpackade DNA:t i målsekvenssammansättning. En begränsning av qPCR-analysen är dock storleken på det kontaminerande DNA (100–450 bp) som kommer att innehålla en anständig del av fragment med ofullständig målsekvens.

Figur 5. Frisättningen av intraviralt DNA genom värmebehandling av vektorer förstärker pro-inflammatoriska cytokinsvar i pDC. Cytokinfrisättning av IP-10, MIP-1, TNF- och IFN- 2 av pDCs 18 timmar efter stimulering med värmebehandlad AAV8 lot A-HEK-1 (MOI: 1:1× 106 vg). Horisontella linjer indikerar medelvärden och standardavvikelser. Statistiskt signifikanta skillnader mellan cytokinsvar inducerade av värmebehandlade och obehandlade vektorer bestämdes genom att använda Student t-test. P-värde: Mindre än eller lika med 0.01: **; Mindre än eller lika med 0,001: ***.

Diskussion

AAV-vektorer är ett av de mest lovande verktygen inom genterapi. Ackumulerande bevis utmanar emellertid uppfattningen att immunogeniciteten för AAV är försumbar5. Mot bakgrund av detta har det blivit allt viktigare att bättre förstå mekanismerna genom vilka immunsvar mot AAV uppstår. I denna studie visar vi att (1) AAV8 och AAV2 inducerar partispecifika medfödda immunsvar i humana pDCs som varken är specifika för kapsid/vg-förhållandet eller produktionsplattformen eller tillverkare/reningsmetoden; (2) medfödda immunsvar i pDC är beroende av TLR9-signalering och kan reduceras genom förbehandling med DNas; (3) DNas-behandling påverkar inte vektorpartikelns integritet eftersom den inte minskar transduktionshastigheten för AAV8- och AAV2-vektorlots i HEK293T-celler; och (4) AAV-vektorsatser kan innefatta extravirala DNA-molekyler som kan avlägsnas genom behandling av vektorpartiet med DNas. Detta tyder på att både HEK- och Sf9-cellhärledda AAV-preparat kan innehålla extravirala DNA-föroreningar som stimulerar ett medfött immunsvar. I en nyligen genomförd studie genomfördes en jämförande analys med användning av AAV-vektorer från olika värdcellsarter (HEK-celler och Sf9-celler)11. Författarna fann att HEK- och Sf9-härledda vektorer skiljer sig åt vad gäller deras PTM och deras kvarvarande värdcellproteinföroreningar över alla AAV-serotyper och tillverkare som de testade. Vidare analyserade de cytokinsvaret från primära humana fibroblaster på AAV-transduktion och fann att HEK- och Sf9--härledda vektorer kan skilja sig åt i deras immunogena egenskaper. I vår studie jämförde vi också dessa två huvudproduktionssystem med olika partier av samma AAV-konstruktion från olika tillverkare och två olika serotyper. De vektorinducerade immunsvaren vi observerade i vår humana pDC-modell var dock inte specifikt relaterade till ett givet produktionssystem, tillverkare eller serotyp, istället var de partispecifika. Tidigare prekliniska och kliniska studier av retinal genterapi har rapporterat att immunsvar mot AAV-vektorer, såsom okulär inflammation eller immuncellsinfiltration, kan påverkas av skillnader i kapsid/vg-förhållanden18 eller dosskillnader5. Timmers et al.18 visade att avlägsnande av tomma AAV-kapsider från virussuspensionen minskade inflammation och förbättrade viral transduktion i en preklinisk studie med icke-mänskliga primater. Ändå visade våra resultat att förhöjda kapsid/vg-förhållanden fanns bland både "immunogena" och "icke-immunogena" AAV-vektorlots, vilket betyder att ett högre antal kapsider (tomma kapsider) i virussuspensionen inte var ansvarig för induktionen av de vektorpartispecifika immunsvaren i vår humana pDC-modell. Förutom det har vi tidigare visat att AAV8 inducerar immunsvar på ett dosberoende sätt hos icke-mänskliga primater6,8. Att öka dosen av de "icke-immunogena" AAV-vektorerna i denna studie var emellertid inte tillräcklig för att utlösa ett immunsvar i humana pDCs. Därför, för att förstå orsaken till skillnaderna i de immunogena egenskaperna hos vektorerna, undersökte vi mekanismen involverad i igenkänningen av de "immunogena" AAV-partierna. Användningen av in vitro immunkompetenta cellmodeller har gjort det möjligt för forskare att mer exakt studera rollen av TLR-vägar i medfödda immunsvar som genereras av AAV-vektorer9,10. Zhu et al.9frst beskrev att pDCs, men inte konventionella DCs eller icke-pDCs, frisätter stora mängder typ I IFN och pro-inflammatoriska cytokiner som svar på AAV-stimulering och visade inblandningen av TLR9-vägen i igenkänningen av AAV8 och AAV2 använder mus-pDCs. Författarna observerade också att AAV2 inducerade TLR9-beroende immunsvar i humana pDCs. I vår studie, med användning av en av de mest specifika TLR9-antagonisterna, H1549,21–24, har vi indirekt visat att inte bara AAV2, utan även AAV8-vektorer inducerar TLR9-beroende medfödda immunsvar i humana pDCs, men på ett mycket specifikt sätt. Eftersom TLR9 är en DNA-receptor, antydde detta att immunsvaren på "immunogena" AAV-vektorlots inducerades av DNA-komponenter. Men även om våra ddPCR-mätningar hade bekräftat att samma förpackade DNA-komponenter fanns i både "immunogena" och "icke-immunogena" vektorpartier, utlöste inte de "icke-immunogena" partierna immunsvar i pDCs. Dessutom minskade eller avskaffade DNas-behandling de immunstimulerande egenskaperna hos de "immunogena" AAV-vektorlotterna, men minskade inte transduktionsstyrkan för dessa vektorer i HEK-celler, vilket tyder på att DNas-behandling av AAV riktade sig mot icke-inkapslat extraviralt DNA i vektorsuspension men påverkade inte integriteten av vektorgenomet i den intakta kapsiden. Detta bekräftades ytterligare genom jämförande DNA-analyser av representativa DNas-behandlade och skenbehandlade "immunogena" och "icke-immunogena" vektorpartier.

cistanche tubulosa-förbättra immunförsvaret

Klicka här för att se produkter från Cistanche Enhance Immunity

【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Tillsammans indikerar alla dessa experiment att immunsvaret mot "immunogena" vektorpartier i pDCs inte var orkestrerat av DNA som fanns i AAV-partiklarna (dvs vektorgenom eller potentiella DNA-föroreningar förpackade i AAV-kapsiderna) utan av tillgängligt extraviralt DNA komponenter som ingår i virussuspensionerna (dvs. DNA utanför eller oskyddat av den virala kapsiden). Vi observerade också att när DNA som fanns i de virala kapsiderna i en "immunogen" vektorlot exponerades för cellerna genom värmebehandling av vektorn, fanns en ökning av immunsvaret. Det är inte klart om ökningen av immunstimulerande aktivitet efter öppning av kapsiderna berodde på vektorns enkelsträngade DNA eller på potentiella föroreningar packade i AAV-kapsiderna, såsom återstående värdcellsnukleinsyror, återstående hjälpar-DNA-sekvenser, ryggradssekvens fragment förpackade tillsammans med kassetten eller omvänd priming från ITR, vilket resulterar i små ryggradsfragment förpackade i AAV12,25. Den exakta mekanismen för extraviralt DNA-upptag av pDC:er är fortfarande okänd. Reaktionsförmåga hos pDCs för CpG-oligonukleotider visar att pDCs kan reagera på fritt DNA26. Detta tyder på att immunsvaret i pDC kan triggas av upptaget av fritt kontaminerande DNA som finns i vektorsuspensionen. Dessutom har det visats att pDCs kan ta upp AAV-vektorer27, vilket alternativt föreslår att potentiellt kapsidbundet DNA skulle kunna transporteras in i cellen under upptaget av AAV-partiklar. Förekomsten av extraviral DNA-kontamination i AAV-vektorberedningar kan antingen vara en inneboende egenskap hos respektive vektorparti som är ett resultat av produktionen och reningsprocessen av vektorerna, eller så kan det bero på frisättningen av inkapslat DNA på grund av olämpliga lagringsförhållanden . Alla vektorpartier som undersöktes i dessa experiment erhölls under samma tidsperiod (5 av de 8 AAV8-vektorlotterna som undersöktes, varav två var "immunogena" (A-HEK-2; A-HEK-3) och tre var "icke-immunogena" (A-Sf9-2; B-Sf9-1; B-Sf9-2) producerades till och med parallellt specifikt för denna studie), partierna från varje tillverkare skickades i samma transportlådor och vid mottagandet förvarades alla partier sida vid sida i samma låda i en temperaturlarmskyddad -80 graders frys innan alikvoter av alla partier tinades upp samtidigt och applicerades på pDC:erna i experiment sida vid sida. Detta tyder starkt på att AAV-produktion och reningsprocessen, snarare än olämplig lagring, var ansvarig för skillnaderna i extraviralt DNA-innehåll och immunstimulerande egenskaper hos dessa partier. Tidigare var AAV-vektorlots av klinisk kvalitet producerade för genterapi (alipogen tiparvovec, Glybera) inte längre godkända på grund av höga mängder föroreningar inklusive potentiellt immunogen restvärdcells-DNA28. Avlägsnandet av DNA-föroreningar från virussuspensionerna utförs vanligtvis under produktionsprocessen. Här tillämpas Benzonase29- eller DNase30-behandling rutinmässigt för att eliminera kvarvarande DNA från den slutliga virala suspensionen. Denna behandling, beroende på protokoll, varar mellan 30 minuter och 3 timmar och sedan inaktiveras enzymet av kemikalier som cesiumkloridsalter30. I våra experiment visade sig fyra av de fem AAV8-partierna härledda från Viral Vector Core Facility vid University of Iowa, och båda AAV2-vektorpartierna från Virovek vara immunogena i pDCs. Som beskrivs i avsnittet "Material och metoder" innefattar reningsprocessen för vektorpartierna från båda dessa tillverkare flera reningssteg, av vilka några skiljer sig mycket från varandra. Således inkluderar reningsprocessen vid Core Facility i Iowa turbonukleasbehandling, följt av jodixanolgradientultracentrifugering, anjonbyteskolonnkromatografi, fladdersterilisering och buffertbyte med centrifugalfilter. Däremot tillämpar Virovek Benzonase-behandling, ultracentrifugering i CsCl följt av avsaltning och filtersterilisering. Reningsprocessen av Vigene, å andra sidan, omfattar inte DNas-behandling, men, som används av Core Facility i Iowa, inkluderar jodixanolgradient-ultracentrifugering. Förvånansvärt nog inducerade dock ingen av de tre vektorpartierna från Vigene (AAV8: C-HEK-1; AAV2: C-HEK-1 och 2) immunsvar i pDC, vilket tyder på att "icke-immunogena " vektorlots kan också genereras med produktionsprocesser som inte involverar DNas-behandling.

cistanche tillägg fördelar-hur man stärker immunförsvaret

Sammantaget gör de delvis lika och delvis olika reningsstegen som används av de tre tillverkarna det svårt att koppla de immunogena egenskaperna hos vektorerna som observeras i pDC till ett enda steg i tillverkningsprocessen. I kliniska prövningar används vektorer av god tillverkningssed (GMP) som är föremål för stränga kvalitetskontroller. Ingen av vektorerna från de tre tillverkarna som används i denna studie är av god laboratoriepraxis (GLP) och kan därför vara av lägre renhet än vektorer av klinisk kvalitet. Därför är det viktigt att inse att GMP-vektorer som används i kliniska prövningar på människor kan eller kanske inte uppvisar de skillnader som vi observerade i denna studie och att relevansen av våra resultat för den kliniska användningen av genterapier inte är tydlig. Enligt vår egen erfarenhet kan dock betydande partispecifika skillnader i koncentrationen av kontaminerande komponenter såsom värdcellsproteiner förekomma även med vektorer av GMP-grad, och även i vektorer av GMP-grad finns det inga enhetligt överenskomna specifikationer för vilka nivåer som är acceptabelt 5. Sammantaget är förbättring av tillverkningsprocessen för AAV-vektorer nyckeln för att undvika närvaron av kvarvarande föroreningar i virussuspensionerna för att minimera risken för oavsiktliga immunsvar. Sammanfattningsvis visade vi att extravirala DNA-föroreningar kan påverka de immunogena egenskaperna hos AAV-vektorer i humana pDCs. Ytterligare studier krävs för att undersöka konsekvenserna av dessa fynd för säkerheten av AAV-medierad genterapi i djurmodeller eller mänskliga patienter.

Referenser

1. Gaj, T., Epstein, BE & Schafer, DV Genomteknik med Adeno-associerat virus: grundläggande och kliniska forskningsapplikationer. Mol. Ter. 24, 458–464 (2016).

2. Garita-Hernandez, M. et al. AAV-medierad genleverans till 3D retinala organoider härledda från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller. Int. J. Mol. Sci. 21, 994 (2020).

3. Russell, S. et al. Effekt och säkerhet av voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) hos patienter med RPE65-medierad ärftlig retinal dystrofi: En randomiserad, kontrollerad, öppen fas 3-studie. Lancet 390, 849–860 (2017).

4. He, X., Urip, BA, Zhang, Z., Ngan, CC & Feng, B. Utveckling av AAV-levererade terapier mot ultimata botemedel. J. Mol. Med. 99, 1–25. https://doi.org/10.1007/s00109-020-02034-2 (2021).

5. Bucher, K., Rodríguez-Bocanegra, E., Dauletbekov, D. & Fischer, MD Immunsvar på retinal genterapi med användning av adenoassocierade virala vektorer – Implikationer för behandlingsframgång och säkerhet. Prog. Retin. Eye Res. 83, 100915 (2020).

6. Reichel, FF et al. AAV8 kan inducera medfödda och adaptiva immunsvar i primatögat. Mol. Ter. 25, 2648–2660 (2017).

7. Boyd, RF et al. Minskad retinal transduktion och förbättrad transgenriktad immunogenicitet med intravitreal leverans av rAAV efter posterior vitrektomi hos hundar. Gene Ter. 23, 548–556 (2016).

8. Rodríguez-Bocanegra, E. et al. Longitudinell utvärdering av hyperrefektiva foci i näthinnan efter subretinal leverans av adenoassocierat virus hos icke-mänskliga primater. Transl. Vis. Sci. Technol. 10, 15 (2021).

9. Zhu, J., Huang, X. & Yang, Y. Te TLR9-MyD88-vägen är avgörande för adaptiva immunsvar mot adenoassocierade virusgenterapivektorer hos möss. J. Clin. Undersök. 119, 2388–2398 (2009).

10. Hösel, M. et al. Tollliknande receptor 2-medierad medfödd immunrespons i humana icke-parenkymala leverceller mot adenoassocierade virala vektorer. Hepatology 55, 287–297 (2012).

11. Rumachik, NG et al. Metoder spelar roll: Standardproduktionsplattformar för rekombinant AAV producerar kemiskt och funktionellt distinkta vektorer. Mol. Ter. Metoder Clin. Dev. 18, 98–118 (2020).

12. Wright, JF Produktrelaterade föroreningar i rekombinanta AAV-vektorer av klinisk kvalitet: Karakterisering och riskbedömning. Biomedicines 2, 80–97 (2014).

13. Clément, N. & Grieger, JC Tillverkning av rekombinanta adenoassocierade virala vektorer för kliniska prövningar. Mol. Ter. Metoder Clin. Dev. 3, 16002 (2016).

14. Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N. & Ayuso, E. Farmakologi av rekombinant adeno-associerad virusproduktion. Mol. Ter. Metoder Clin. Dev. 8, 166–180 (2018).

15. Ye, Y., Gaugler, B., Mohty, M. & Malard, F. Plasmacytoid dendritiska cellbiologi och dess roll i immunmedierade sjukdomar. Clin. Transl. Immunol. 9, e1139 (2020).

16. Fischer, MD et al. Effekt och säkerhet av retinal genterapi med användning av adenoassocierad virusvektor för patienter med choroideremi: En randomiserad klinisk prövning. JAMA Oftalmol. 137, 1247–1254 (2019).

17. Weleber, RG et al. Resultat 2 år efter genterapi för RPE65-defekt Leber medfödd amauros och svår retinal dystrofi i tidig barndom. Ophthalmology 123, 1606–1620 (2016).

18. Timmers, AM et al. Okulärt inflammatoriskt svar på intravitreal injektion av adenoassocierad virusvektor: Relativt bidrag av genom och kapsid. Brum. Gene Ter. 31, 80–89 (2020).

19. Ran, G. et al. Platsriktad mutagenes förbättrar transduktionseffektiviteten för kapsidbibliotekshärledda rekombinanta AAV-vektorer. Mol. Ter. Metoder Clin. Dev. 17, 545–555 (2020).

20. Ellis, BL et al. En undersökning av ex vivo/in vitro-transduktionseffektivitet för primära däggdjursceller och cellinjer med nio naturliga adenoassocierade virus (AAV1-9) och en konstruerad adenoassocierad virusserotyp. Virol. J. 10, 1–10 (2013).

21. Yamada, H. et al. Effekt av suppressivt DNA på CpG-inducerad immunaktivering. J. Immunol. 169, 5590–5594 (2002).

22. Zhang, P. et al. Toll-liknande receptor 9-antagonist undertrycker humoral immunitet i experimentell autoimmun myasthenia gravis. Mol. Immunol. 94, 200–208 (2018).

23. Chan, YK et al. Konstruera adenoassocierade virala vektorer för att undvika medfödda immun- och inflammatoriska svar. Sci. Transl. Med. 13, eabd3438 (2021).

24. Bayik, D., Gursel, I. & Klinman, DM. Struktur, mekanism och terapeutisk användbarhet av immunsuppressiva oligonukleotider. Pharmacol. Res. 105, 216–225 (2016).

25. Brimble, MA et al. 547. AAV-beredningar innehåller kontaminering från DNA-sekvenser i produktionsplasmider direkt utanför ITR. Mol. Ter. 24, S218–S219 (2016).

26. Latz, E. et al. TLR9-signaler efter translokering från ER till CpG-DNA i lysosomen. Nat. Immunol. 5, 190–198 (2004).

27. Veron, P. et al. Stora undergrupper av humana dendritiska celler transduceras effektivt av självkomplementära adenoassocierade virusvektorer 1 och 2. J. Virol. 81, 5385–5394 (2007).

28. Bedömningsrapport: Glybera. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/glybera-epar-public-assessment report_en.pdf. Åtkomst 3 mars 2022 (2012)

29. Arden, E. & Metzger, J. Billigt, serotypoberoende protokoll för rening av nativt och biokonstruerat rekombinant adenoassocierat virus. J. Biol. Metoder 3, e38 (2016).

30. Grieger, JC, Choi, VW & Samulski, RJ Produktion och karakterisering av adenoassocierade virala vektorer. Nat. Protoc. 1, 1412–1428 (2006).

31. Kimura, T. et al. Produktion av adenoassocierade virusvektorer för applikationer in vitro och in vivo. Sci. Rep. 9, 13601 (2019).

32. Ayuso, E. et al. Hög AAV-vektorrenhet resulterar i serotyp- och vävnadsoberoende förbättring av transduktionseffektiviteten. Gene Ter. 17, 503–510 (2010).