Tandemmasspektrometri med hög upplösning identifierar ett särskilt gangliosidmönster i tidig diabetes njursjukdom hos patienter med typ 2 diabetes mellitus

Abstrakt:

Med tanke på den värdefulla information som tillhandahålls av glykosfingolipider sommolekylära marköreroch de begränsade data som finns tillgängliga för deras upptäckt och karakterisering hos patienter som lider avTyp 2 diabetisk njursjukdom(DKD), utvecklade och implementerade vi en överlägsen metod baserad på högupplöst (HR) masspektrometri (MS) och tandem MS (MS/MS) för bestämning av gangliosider i urinenDKD-patienter. Denna studie var fokuserad på: (i) testning av HR MS och MS/MS genomförbarhet och prestationer i kartläggning ochsekvensering av njurgangliosider i typ 2 DMpatienter; (ii) fastställande av ändringarna iuringangliosid av DKDpatienter iolika stadier av sjukdomen-normo-, mikro- och makroalbuminuri-i en jämförande analys med friska kontroller. På grund av den höga upplösningen och massnoggrannheten visade den jämförande MS-screeningen att sialyleringsstatusen för gangliosidkomponenterna; deras modifiering av O-acetyl, CH3COO−, O-fucosyl och O-GalNAc; samt sammansättningen av ceramiden representerar möjliga markörer för tidig DKD-detektion, bedömning av sjukdomsprogression och uppföljningsbehandling. Dessutom visade strukturell undersökning av MS/MS att GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) och GT1b(d18:1/18:{{ 23}}) isomerer är associerade med makroalbuminuri, vilket förtjänar ytterligare undersökning i relation till deras roll i DKD.

Nyckelord: nanoelektrospray; högupplöst tandemmasspektrometri; undersökning; fragmenteringsanalys; diabetisk njursjukdom; gangliosidbiomarkörer

1. Introduktion

Typ 2-diabetes mellitus (DM) är fortfarande en terapeutisk utmaning med en ständigt ökande global prevalens, trots vetenskapliga framsteg på området. I samband med förödande makrovaskulära och mikrovaskulära långtidsskador leder typ 2 DM till ökad dödlighet. Diabetisk njursjukdom (DKD) är den vanligaste orsaken till njursjukdom i slutstadiet (ESRD) i utvecklade länder och utvecklingsländer [1,2]. Därför är tidig upptäckt av DKD och optimal hantering av typ 2 DM avgörande för att minska komplikationer, sjuklighet och mortalitet. För närvarande bygger diagnosen och progressionen av DKD på mätning av albuminuri och den stadiga minskningen av glomerulär filtrationshastighet (eGFR), båda parametrarna visar blygsamma förutsägelser om framtida njurstatus. Den naturliga historien för DKD inkluderar flera kliniska stadier, inklusive följande: tidig glomerulär hyperfiltrering, förekomsten av mikroalbuminuri eller makroalbuminuri, en minskning av glomerulär filtrationshastighet och ESRD. Senare forskning anser dock att albuminuri är en markör för försämrat tillstånd [3].

Under det senaste decenniet har särskilt intresse visats för det subtelocentriska konceptet, enligt vilket den proximala tubuli och den tubulointerstitiella avdelningen kan ha en väsentlig roll i initieringen och progressionen av DKD [4–6]. I detta sammanhang får utvecklingen av prognostiska och prediktiva glykomiska biomarkörer allt större uppmärksamhet och har blivit fokus för många forskargrupper under åren [7–11].

Gangliosider representerar en särskild klass av glykosfingolipider med en komplex struktur identifierad i alla vävnader och kroppsvätskor och särskilt rikligt förekommande i det centrala nervsystemet (CNS) [12]. Som väsentliga beståndsdelar i de neuronala cellernas dubbelskiktsmembran spelar gangliosider en viktig roll i hjärnans utveckling, mognad och åldrande, förmedlar cellvidhäftning, aktivering, proliferation, motilitet och tillväxt. Gangliosider består av en ceramid av olika sammansättning med avseende på den sfingoida basen, fettsyrarester som är rotade i det yttre lagret av membranet och en sialylerad oligosackaridkedja som täcker membranet och deltar i specifika och väsentliga interaktioner med andra molekyler i den omgivande miljön. Genom normal cellytomsättning, känd som "cellyteutsöndring", frigörs gangliosider, i viss utsträckning, till det intercellulära utrymmet.

Eftersom uttrycket, distributionen och strukturen av gangliosider är kända för att vara cell- och vävnadstypspecifika och att variera under vävnadsutveckling, mognad, åldrande och framför allt i patologiska tillstånd [12], anses gangliosider bland de mest värdefulla diagnostiska markörer och potentiella terapeutiska medel.

Flera metoder som använder serum- eller njurbiopsifragment har använts för identifiering av njurgangliosid hos patienter med typ 2 DM, såsom tunnskiktsimmunfärgning [7,8], högpresterande tunnskiktskromatografi (HPTLC) [9], spektrofotometri [10 ] och masspektrometri (MS) [11].

Med tanke på den värdefulla information som kan tillhandahållas av gangliosider som molekylära markörer för neuronal vävnad [12] och de begränsade data som finns tillgängliga hittills för detektion och karakterisering av glykosfingolipider i urinen hos DKD-patienter, utvecklade och implementerade vi en överlägsen metodbaserad på nanoelektrospray (nanoESI) högupplöst (HR) MS för bestämning av gangliosider i urinen hos DM-patienter. Detta alternativ för HR MS styrdes av fördelarna med denna metod i analysen av de komplexa blandningarna av gangliosider extraherade från mänsklig urin. Instrumentets förhöjda upplösningsförmåga: (i) möjliggör detektering av joner med nära m/z-värden, som annars inte skulle kunna särskiljas i ett heterogent flerkomponentprov som innehåller arter av olika längder och arkitekturer av glykankedjan och olika sammansättningar av ceramid; (ii) eliminerar i princip behovet av blandningsseparation med antingen vätskekromatografiska eller elektroforetiska metoder före MS-analys; (iii) ger en hög massnoggrannhet, vilket avsevärt ökar tillförlitligheten av strukturell identifiering; och (iv) erbjuder inte bara en bättre insikt i komplexiteten hos DM-associerad gangliosdom utan också data om arterna med potentiell biomarkörroll baserat på det höga förtroendet för massbestämning för både molekylära joner och fragmentjoner.

Denna pilotstudie, med syftet att karakterisera uringangliosider med biomarkörroller itidig diagnos av DKD, fokuserades på: (a) att testa genomförbarheten och prestanda för HR MS och tandem MS (MS/MS) genom högenergikollisionsinducerad dissociation (HCD) vid kartläggning av njurgangliosider hos patienter med typ 2 DM; (b) bestämning av förändringarna i uttrycket av naturliga gangliosidblandningar från urinprover från typ 2 DM-patienter i en jämförande analys med friska kontroller och karakterisering av de upptäckta biomarkörerna. För detta ändamål optimerade vi en modern bioanalytisk plattform baserad på nanoESI HR MS på ett Orbitrap-instrument inställt för drift i negativt jonläge i både MS-screening och MS/MS-fragmentering för detaljerad strukturanalys.

2. Resultat och diskussioner

2.1. Jämförande screening av proverna av nanoESI HR MS

A1-, A2-, A3- och C-gangliosidproverna infunderades av nanoESI efter varandra i en Orbitrap MS och screenades i negativt jonläge under identiska instrumentella förhållanden. I varje fall förvärvades den totala jonströmsignalen (TIC) under 2 minuter, vilket genererade spektra från ackumuleringen av 100 skanningar. På grund av metodens höga känslighet, även under de använda tidsbegränsande förhållandena, uppvisade de förvärvade masspektra ett högt signal-till-brusförhållande och ett rikt molekylärt jonmönster.

Bedömning av kartläggningsdata som genererats under samma förhållanden avslöjade signifikanta skillnader i antalet och typen av gangliosidkomponenter uttryckta i A1-, A3- och C-proverna, medan inga skillnader mellan A1- och A2-proverna observerades. Dessa resultat sammanfattas i tabell 1, som jämförande listar de strukturer som identifierats i de naturliga A1-, A3- och C-blandningarna, tillsammans med de experimentella m/zexp-värdena för de detekterade signalerna och de teoretiska m/ztheor-värdena som motsvarar de föreslagna strukturerna.

Den höga upplösningen och massnoggrannheten hos den använda MS-plattformen förbättrade diskrimineringen och identifieringen baserat på noggranna massmätningar av inte mindre än 37 distinkta uringangliosid- och fukogangliosidkomponenter i de tre proverna. De upptäckta arterna tillhör 15 olika klasser, inklusive modifieringar av huvudglykankedjan (tabell 2), och tilldelades den utmärkta genomsnittliga massnoggrannheten på 4 ppm.

En detaljerad utvärdering av strukturerna i Tabell 1 visade att av alla prover innehåller A3-blandningen, som motsvarar makroalbuminuri (därav ett framskridet stadium av DKD), det högsta antalet distinkta gangliosidföreningar, dvs. 19, följt av prov C, med 12 distinkta arter, och prov A1, med 10.

Jämfört med A1- och C-proverna, omfattar A3 också: (i) det högsta antalet arter med den längsta O-glykankedjan tillhörande G1-klassen och den mest framträdande mångfalden av ceramidkompositioner; (ii) presenterar det högsta antalet gangliosidklasser uttryckta-12 klasser jämfört med endast 6 i A1-provet respektive 6 i C-provet; (iii) innehåller det högsta antalet gangliosider, som uppvisar en sackaridkärna förändrad av icke-kolhydrat O-acetyl, såväl som kolhydrat O-fucosyl och O-GalNAc biologiskt relevanta modifieringar; (iv) är det enda urinextraktet som innehåller gangliosidstrukturer modifierade av O-GalNAc-bindning, nämligen GalNAc-GS1(t18:1/18:0), detekterad som en fyrskiktig deprotonerad och sodierad molekyl vid m/z 1176,8266 , och GalNAc-GQ1(d18:1/18:0), som en dubbelt deprotonerad molekyl vid m/z 1310.1271. Som är synligt i figur 1a–c, som visar andelen gangliosidklasser uttryckta i de tre proverna, och i det jämförande histogrammet som avbildas i figur 2, visar A3-extrakt en speciell sialyleringsstatus, som domineras av polysialoföreningar. Förutom den monosialylerade gangliotetraosen GM1(d18:1/16:1) detekterad som [M-2H+] 2− vid m/z 756,9078 och den monosialylerade GM3(d18:0/24: 0) detekterad som en dubbelt deprotonerad molekyl vid m/z 645,3956, alla 17 andra arter innehåller mer än en Neu5Ac-rest i sin glykandel. Dessutom, eftersom inte mindre än sju trisialo GT1, fyra pentasialo GQ1 och till och med en heptasialylerad GS1 upptäcktes, uppenbarligen, bredvid det utökade antalet och mångfalden av strukturer, längden på glykankärnorna och deras perifera modifieringar, den höga totala sialyleringen innehåll representerar en annan egenskap som är specifik för makroalbuminuri.

Tabell 1. Gangliosid-arter identifierades i A1-, A3- och C-prover genom (-) nanoESI Orbitrap MS-screening. d: dihydroxylerad sfingoidbas; t: trihydroxylerad sfingoidbas.

En kliniskt relevant observation framkommer också från den jämförande analysen A1 vs. C. Medan i kontrollprovet, C, den högsta sialyleringsgraden av de detekterade gangliosiderna är fyra, identifierad via två tetrasialylerade gangliotetraos GQ1 som skiljer sig i sammansättningen av deras lipidaglykon, i A1-provet är den högsta sialyleringsgraden fyra. Bredvid de di-, tri- och tetrasialylerade gangliosiderna innehåller A1-blandningen en pentasialo gangliotetraos GP1(d18:1/18:0), detekterad som [M-4H+] 4−-jon vid m/z 676,5569, som tilldelades den utmärkta massnoggrannheten på 2,95 ppm. Sådana data relaterade till sialyleringsstatusen för de undersökta proverna visar att sialyleringsgraden för njurgangliosider följer egenskapen C < A1 < A2=A3, en observation som understryker precocity av dessa modifieringar, även i normoalbuminuristadiet av Typ 2 DM-patienter. Sialyleringsgraden ökar med sjukdomens fortskridande, vilket gör det till en molekylär parameter som ska beaktas inte bara för tidig upptäckt av DKD utan också för bedömning avDKD-progressionochbehandlingseffektivitet.

Tabell 2. Tabulerad vy av de identifierade uringangliosidklasserna tillsammans med deras differentiella uttryck i A1-, A3- och C-prover. Symboler: x=klassen upptäcktes; -=klassen upptäcktes inte.

En detaljerad inspektion av aglykonkonstitutionen avslöjar att, förutom de markanta olikheterna i sammansättningen av glykankedjan, uppvisar gangliosiderna som uttrycks i de tre proverna också skillnader i strukturen av deras ceramider. De mest uppenbara förändringarna av lipiddelen är relaterade till den mindre vanliga processen med sfingoidbastrihydroxylering, som sker i A1- och A3-gangliosidblandningarna, och den ovanliga längden på fettsyrakedjorna, som enbart finns i A3. Vart och ett av A1- och A3-proverna visade sig innehålla två arter med trihydroxylerade sfingoida baser av ceramiden. Därför upptäcktes GT1(t18:0/18:0) och GT1(t18:0/20:0) i A1-exemplet, medan ju fler komplexa trihydroxylerade GT1(t18:1/24:3) och Fuc-GT3(t18:1/18:3) strukturer hittades i A3-provet.

Anmärkningsvärt nog visar A3-provet också tecken på arter som innehåller mycket långkedjiga fettsyror (VLCFA). En VLCFA anses vara en sällan förekommande lipidstruktur som omfattar 23 till 27 kolatomer i fettsyrakedjan. Fyra sådana ovanliga VLCFA-arter som bär 24 kolatomer i fettsyrakedjan upptäcktes i A3-provet: GM3(d18:0/24:{{10}}), GT1(t18:1 /24:3), O-Ac GT1(d18:0/24:0) och Fuc-GT1(d18:0/24:0), varav en struktur uppvisar också den ovanliga sfingoidbastrihydroxyleringen och tre dubbelbindningar i fettsyrakedjan, medan två strukturer uppvisar bindningar till glykankärnan av O-Ac respektive fukosylgruppen.

Dessa egenskaper hos ceramiddelarna i A1- och A3-proverna, som inte hittades i kontrollprovet; likheterna mellan A1 och A2; och de markanta skillnaderna som detekteras i A3 tyder på att, bredvid kolhydratsammansättningen och sialyleringsstatusen, är strukturen av lipiddelen i njurgangliosider en annan möjlig markör för tidig DKD. Dessutom verkar modifieringarna i ceramidkompositionen bero på albuminuristadierna; komplexa ceramider, som uppvisar trihydroxylering av sfingoidbasen och VLCFA verkar vara kopplade till de avancerade albuminuristadierna. Med tanke på att det ovanliga antalet av tre dubbelbindningar i fettsyrakedjan endast påträffades i A3-provet via två olika arter, Fuc-GT3(t18:1/18:3) och GT1(t18:1/24:3), uppenbarligen är mekanismen för dubbelbindningsbildning också relaterad till utvecklingen av DKD.

De negativa effekterna av lipidackumulering i njuren, både på glomerulär och tubulär nivå, är cellspecifika. Dessutom är lipotoxicitet förknippad med olika typer av lipider, bland vilka gangliosider har en central roll [13].

Njurinnehållet av gangliosider, bland andra lipidklasser, ökade inom podocyter, såväl som proximala tubuliceller, i en DN-musmodell [14]. Proximala tubuli kan exponeras för höga nivåer av urinlipider, inklusive gangliosider, på grund av ökat fettsyrainnehåll per albuminmolekyl tidigt i DKD [15]. De direkta konsekvenserna av lipidackumulering inom segmenten av nefron är relaterade till strukturella och funktionella modifieringar, som leder till försämrad albuminbearbetning tidigt i förloppet av typ 2 DM.

De allra flesta studier som fokuserar på karakterisering av njurgangliosid förlitar sig på experimentella modeller av diabetisk nefropati. Så vitt vi vet är detta den första mänskliga translationella studien från grundforskning till klinisk tillämplighet för att rapportera om ett visst urinvägliosidmönster hos patienter med typ 2 DM. Den praktiska betydelsen av vår studie är i demonstrationen av ett samband mellan sialyleringsgraden av uringangliosider och strukturen av deras ceramider med tidig DKD, iscensatt av albuminurinivå.

Supportive Service Of Wecistanche - Den största cistanche-exportören i Kina:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Handla för fler specifikationer:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

FÅ NATURLIGT ORGANISKT CISTANCHEEXTRAKT MED 25 % ECHINACOSID OCH 9 % ACTEOSID FÖR NJURINFEKTION