Orsaken till kronisk njursjukdom (CKD)- Anemi

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

DEL I.:P roteinurisk kronisk njursjukdom är förknippad med förändrad livslängd för röda blodkroppar, deformerbarhet och metabolism

Rosi Bissinger, Travis Nemkov & et al.

Utvecklingen avanemiär en typisk komplikation av avanceradkronisk njursjukdom(CKD) och är förknippad med försämrad livskvalitet¹och ökad risk för kardiovaskulära händelser²och sjukhusvistelse,³såväl som kognitiv nedgång.⁴Svårighetsgraden avanemihar betraktats som en oberoende prediktor för dödlighet i både dialys- och icke-dialysberoende CKD (kronisk njursjukdom) patienter.⁵Patofysiologin för njursjukdom-associeradanemiär komplex och involverar järn- och erytropoietinbrist (EPO) vid inställning av låggradig inflammation, vilket i sin tur äventyrar normal erytropoies vid CKD (kronisk njursjukdom) patienter.⁶I avancerad CKD (kronisk njursjukdom) är EPO:s svar otillräckligt lågt i förhållande till graden avanemi.^7,8Den höga förekomsten av samtidig järnbrist vid kronisk njursäcka (kronisk njursjukdom) är en följd av störd järnhomeostas.⁹En försummad mekanism för järnförlust i CKD (kronisk njursjukdom) är proteinuri, vilket kan leda till urinförluster av transferrinbundet järn (upp till 0,3 mg/d) när proteinuri når nefrotiska intervallet.¹⁰En annan faktor som tros bidra tillanemii CKD (kronisk njursjukdom) patienter är den förkortade livslängden för röda blodkroppar (RBC), som först beskrevs för >60 år sedan.^6,11,12

Fördelen med Cistanche: behandling av njursjukdom och förbättring av njurfunktionen

En nyligen genomförd studie med hjälp av ett kolmonoxidandningstest visade att RBC-livslängden gradvis minskade från 120 dagar hos patienter med stadium 1 CKD (kronisk njursjukdom) till 60 dagar hos patienter med stadium 5 CKD (kronisk njursjukdom).¹³I synnerhet transfusion av allogena RBC från friska givare till CKD (kronisk njursjukdom) patienterna följdes av snabb clearance av transfuserade RBC utan tecken på hemolys.¹²En trolig mekanism för denna observation kan vara stimulering av apoptosliknande celldöd i anukleat-RBC, vilket betecknar ett skademönster där cellmembranintegriteten inte äventyras och det cytoplasmatiska innehållet förblir intakt.¹⁴RBC som genomgår celldöd uppvisar olika morfologiska förändringar till följd av cytoskelettskador, såsom ytbbbildning, förlust av membranelasticitet och / eller cellulär uttorkning.¹⁵På molekylär nivå är RBC-död associerad med intracellulär Ca2þ-ackumulering, förändrad cellulär energistatus och nedbrytning av fosfolipidasymmetri, vilket i slutändan leder till externalisering av fosfatidylserin (PS) på det yttre plasmamembranet.^15,16Som en konsekvens känner makrofager och specialiserade dendritiska celler snabbt igen PS-externaliserade RBC, vilket leder till erytrosfagocytos och deras katabolism i mjälten och levern.¹⁷På grund av den förvirrande patofysiologin avnjursjukdom–associeradanemiHos människor är djurstudier motiverade för att fastställa de bidragande mekanismerna. Doxorubicininducerad nefropati (DIN) hos 129S1/SvImJ-möss¹⁸och möss med inducerbar podocinbrist (Nphs2Dipod)¹⁹är 2 modeller som kännetecknas av induktion av nefrotisk proteinuri inom några dagar, progression till njursvikt efter 3 veckor och död på 6 till 7 veckor.^19–21Båda musmodellerna rekapitulerar effektivt alla stadier av mänsklig CKD (kronisk njursjukdom). I den aktuella studien testade vi om progressiv njursvikt hos dessa möss med proteinuricnjursjukdompåverkar RBC:s livslängd och bidrar tillanemi. Parallellt undersökte vi RBC-fenotypen i blod som dras från CKD (kronisk njursjukdom) patienter med nefrotiskt intervallproteinuri.

CKD (kronisk njursjukdom) ochanemi: CISTANCHE

METODER

Detaljerad information om material och metoder finns i Kompletterande material och metoder.

Mus studier

Experiment utfördes på 8 veckor gamla vildtyp 129S1 / SvImJ möss av båda könen (Charles River). DIN inducerades genom en enda injektion av doxorubicin (14,5 mg/g kroppsvikt), som beskrivits tidigare.^18,22För att kontrollera den myelotoxiska effekten av doxorubicin som inte är relaterat till utvecklingen av nefropati utsattes också doxorubicinresistenta C57BL/6-möss för samma behandlingsprotokoll.²³Dessutom utfördes liknande experiment på 8 veckor gamla möss med inducerbar deletion av podocin (B6-Nphs2tm3.1Antc * Tg [Nphs1-rtTA * 3G] 8Jhm * Tg [tetO-cre] 1Jaw) eller Nphs2Dipod möss, som behandlades med doxycyklin i 14 dagar.¹⁹Alla djurförsök utfördes i enlighet med National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och den tyska lagen om djurens välbefinnande, med godkännande från de lokala myndigheterna (Regierungspräsidium Tübingen, godkännandenummer M12/17 och M17/19G). Den experimentella utformningen av musstudierna beskrivs i kompletterande figur S1.

Patienter

Patientstudien genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen och godkändes av den lokala etikkommittén vid Universitetssjukhuset Tübingen (556/2018BO2). Litium-heparinblod- och urinprover erhölls från patienter med nefrotisk proteinuri och bevarad glomerulär filtreringshastighet (GFR; steg 1–2; n 1/4 10) och patienter med reducerad GFR (CKD (kronisk njursjukdom) steg 3–5; n 1/4 15) på Universitetssjukhuset Tübingen. Som kontrollgrupp tillhandahölls blod från ålders- och könsmatchade friska frivilliga (n 1/4 25) av blodbanken på Universitetssjukhuset Tübingen. Alla mänskliga prover samlades in efter informerat samtycke. Kliniska egenskaper hos patienterna anges iTabell 1.

Tabell 1 | Egenskaper hos patienter med kronisk njursjukdom (kronisk njursjukdom) och friska blodgivare

Analyser av flödescytometri

Olika parametrar för RBC-celldöd bestämdes av medlycytometri.¹⁴För att bestämma RBC-livslängden in vivo injicerades 25 ml 5,6-karboxifluoresceindiacetatsuccinimidylester [5(6)-CFDA, SE] färgämne i en koncentration av 9,96 mM (solubiliserat i dimetylsulfoxid) i retroorbital plexus av vildtyp 129S1/SvImJ och doxorubicininjicerade möss, som beskrivits tidigare.24 Vid de angivna tidpunkterna drogs blod från mössens retroorbitala plexus, och procentandelen 5 (6) -CFDA, SEþ -celler detekterades genom annan cytometrianalys. Slutligen analyserades data med hjälp av FlowJo-programvaran (FlowJo LLC).

RBC-deformerbarhet och osmotisk gradient ektacytometri

RBC-deformerbarhet mättes med hjälp av Laser-Assisted Optical Rotational Cell Analyzer (LORCA Max Sis; RR Mekatronik), som har beskrivits i detalj någon annanstans.²⁵De osmotiska gradientektacytometrianalyserna (kosmosburk) utfördes också med hjälp av LORCA Max Sis och mätte deformerbarhet under olika osmotiska förhållanden.²⁶

Histologisk undersökning

För hematoxylin och eosinfärgning färgades mjälte och lårben med hematoxylin och eosin. Alla diabilder färgades med den primära antikroppen Ter119 (BD Pharmingen; spädning 1:500). För periodisk syra-Schiff-färgning, 2,5 mm tjocka skivor avNjurarfärgades med periodiskt syra-Schiff-reagens (Carl Roth) och hematoxylin (Abcam). May-Grünwald-Giemsa-färgning (Pappenheim-metoden) utfördes för att bestämma RBC-formförändringar, som beskrivits tidigare.²⁷Glomeruli-isolering gjordes genom att använda en biotinyleringsmetod och cellsortering.¹⁹För proteindetektion av podocin applicerades en antikropp från Sigma (P0372).¹⁹Roti-Mount Fluor Care 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; Carl Roth) användes för att färga kärnor.

Ultrahögpresterande vätskekromatografi-masspektrometri metabolomik från mus RBC

Analyser utfördes som tidigare publicerats.²⁸Kortfattat använder analysplattformen ett Vanquish ultrahögpresterande vätskekromatografisystem (Thermo Fisher Scientific) kopplat online till en Q Exactive masspektrometer (Thermo Fisher Scientific).

Cistanche behandlar njursjukdom orsakad av anemi

Statistiska analyser

Data tillhandahålls som aritmetiskt medelvärde SEM eller som median med interkvartilintervall (25:e–75:e percentilen) där n representerar antalet använda djur respektive inkluderade patienter. Data testades för normalitet med Kolmogorov-Smirnov-testet, D'Agostino-testet och Shapiro-Wilk-testet. Varianser analyserades av Bartlett-test för lika varianser. Tukey eller Dunn multipel jämförelse posttest, unpaired Student t-test eller Mann-Whitney U-test utfördes av GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). P< 0.05="" with="" 2-="" tailed="" testing="" was="" considered="" statistically="" significant.="" additional="" graphs="" were="" plotted="" through="" graphpad="" prism="">

RESULTAT

Experimentell proteinurisk njursjukdom induceraranemihos möss Efter induktion utvecklade 129S1/SvImJ-möss med DIN- och Nphs2Dipod-möss nefrotisk proteinuri (figur 1a och kompletterande figur S2C) och progressiv njursvikt kännetecknad av höga plasmaureanivåer från dag 20 och framåt (figur 1b och kompletterande figur S2D). Under de första 10 dagarna upplevde möss kroppsviktökning med ascites (figur 1c och kompletterande figur S2E), vilket återspeglar natriumretention orsakad av utsöndring av serinproteaser eller proteinuri.¹⁸Efter spontan reversering av natriumretention gick dessa möss stadigt ner i vikt. Hos möss med DIN och hos Nphs2Dipod-möss avslöjade ljusmikroskopibilder, tagna efter 10 dagar, typiska histomorfologiska förändringar som överensstämde med fokal segmentell glomerulär skleros (figur 1d och kompletterande figur S2B). Dessa saknades hos doxorubicininjicerade C57BL/6-möss (figur 1d). Doxorubicinbehandling inducerade en stark minskning av hemoglobin, RBC-antal och hematokrit (figur 1e–g) från dag 10 och vidare hos mössen 129S1/SvImJ och C57BL/6, som hos de senare normaliserades vid dag 20 och 30. Däremot utvecklade doxorubicininjicerade 129S1/SvImJ och podocin-bristfälliga möss på dag 20 och 30 progressiv progressivanemi, kännetecknad av minskad genomsnittlig korpuskulär volym (figur 1h) och reducerat hemoglobin (tilläggsfigur S2F), vilket tyder på attanemiär associerad med progressiv njursvikt och inte med doxorubicinbehandling per se.

Figur 1 | Njurfunktion och öppet anemi hos doxorubicininjicerade 129S1/SvImJ-möss.(a–d) Doxorubicininjicerade 129S1/SvImJ-möss utvecklade (a) hög proteinuri, (b) progressiv ökning av plasmaureakoncentrationen, (c) övergående kroppsviktsökning och (d) typiska histomorfologiska förändringar som indikerar fokal segmentell glomerulär skleros på dag 10 (periodisk syra-Schiff-färgning; bar 1/4 10 mm). (e–h) Dessutom utvecklades dessa mössanemireflflekterad av (e) en minskad hemoglobinnivå, (f) lägre antal röda blodkroppar (RBC), (g) minskade hematokritnivåer och (h) minskad genomsnittlig korpuskulär volym. (a–d) Doxorubicininjicerade C57BL/6-möss visade inga tecken på njurskada, och (t–g)anemipå dag 10 normaliserades på dag 20 och 30. Aritmetisk betyder SEM visas. *P< 0.05,="" **p="">< 0.01,="">< 0.001,and="" ****p="">< 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" #p=""><0.05, ##p="">< 0.01,="" ###p="">< 0.001,="" and="" ####p="">< 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" to="" the="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="">< 0.05,="" §§p="">< 0.01,="" §§§p="">< 0.001,="" and="" §§§§p="">< 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="">

Anemi vid experimentell proteinurisk njursjukdom orsakas inte av komprometterad erytropoies

Båda anemiska musmodellerna visade en signifikant ökning av andelen cirkulerande retikulocyter (figur 2a och kompletterande figur S3C). Plasmakoncentrationerna av EPO ökade dramatiskt vid dag 10 hos 129S1/SvImJ med DIN och friska C57BL/6-möss men normaliserades igen på dag 20 och 30 (figur 2b). Hos möss med podocinbrist ökade EPO-koncentrationerna i plasma vid dag 10 och förblev ökade vid dag 20 och 30 (tilläggsfigur S2H). I histologiska analyser från benmärg och mjälte ökade antalet erytroida prekursorceller jämfört med myeloida prekursorer vid dag 30 (figur 2d–g), vilket pekar på stimulerad erytropoies hos anemiska 129S1/SvImJ-möss med DIN.

Figur 2 | Erytropoies stimuleras hos doxorubicininjicerade 129S1/SvImJ-möss med anemi.(a)Anemihos doxorubicininjicerade 129S1/SvImJ-möss inträffade trots ökat retikulocytantal vid dag 20 och 30. (b) Plasmakoncentrationen av erytropoietin ökade mycket vid dag 10 hos doxorubicininjicerade möss 129S1/SvImJ och C57BL/6 men normaliserades igen på dag 20 och 30. (c–e) Kvantifiering av det absoluta antalet (c) myeloida och (d) erytroida celler i benmärgen. Förhållandet mellan myeloida och erytroida celler i friska och doxorubicininjicerade 129S1/SvImJ-möss i benmärgen visade ett högre antal erytroida prekursorceller i doxorubicininjicerade 129S1/SvImJ-möss dag 30. (f,g) (f) mjälten och (g) benmärgs histologin visade en ökning av erytroida prekursorceller, observerade även vid lägre förstoringar, hos doxorubicininjicerade 129S1 / SvImJ-möss (höger paneler) jämfört med friska möss (vänster paneler) på dag 30. (f,g) Ter119 immunohistokemi (nedre paneler) stödde hematoxylin och eosin (H & E) fynd. Ter119 är positivt i erytroida prekursorer (kärnceller) och i de röda blodkropparna (icke-kärnceller). Stång 1/4 100 mm; insatser 1/4 25 mm. Aritmetisk betyder SEM visas. *P< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" and="" ***p="">< 0.001="" indicate="" significant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" ##p="">< 0.01="" and="" ####p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" to="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="">< 0.05,="" §§p="">< 0.01,="" and="" §§§§p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="">

Fördel medCistanche: behandling av njursjukdom och förbättring av njurfunktionen

Minskad RBC-livslängd är den främsta orsaken till anemi vid experimentell proteinurisk njursjukdom

Externalisering av PS på den yttre bipacksedeln i RBC-plasmamembranet är en indikator på celldöd och en promotor för erytrofagocytos.¹⁴RBC-celldöd kvantifierades med hjälp av fluorescensaktiverade cellsorteringsanalyser av fluorescerande annexin V-bunden yta PS.¹⁴I nydraget blod var andelen PS-exponerande celler >4 gånger högre på dag 20 hos möss med DIN (4,16% & 0,86%) jämfört med friska möss (1,00% & 0,11%) (Figur 3a). På samma sätt visade Nphs2Dipod-möss en ungefärlig 2-faldig ökning av PS-exponeringen (1,27% & 0,20%) jämfört med friska möss (0,58% & 0,05%) på dag 30 (kompletterande figur S3A). Det är känt att RBC elimineras från cirkulationen av makrofager som finns i mjälten.17 Denna observation kan därför förklara det högre mjält-/kroppsviktsförhållandet hos Nphs2Dipod-möss (kompletterande figur S2G), där dubbelt så många RBC försämras jämfört med friska C57BL/6-möss. Eftersom nefrotisk proteinuri leder till dysproteinemi,29 undersökte vi vidare om förbättrad RBC-celldöd kan stimuleras av en komponent i plasma hos möss med DIN. Som visas i figur 3b var PS-exponeringen vid dag 10 och 20 dubbelt så hög efter inkubation (30 minuter vid 37^OC) friska RBC i plasma av doxorubicininjicerade 129S1/ SvImJ-möss jämfört med inkubation i plasma hos friska möss. Ca2þ tillströmning till RBC, medierad av spänningsgrindade och spänningsoberoende icke-selektiva katjonkanaler,^30,31är en av de viktigaste regulatorerna för RBC-celldöd. I RBC som samlats in vid dag 20 och 30 från 129S1/SvImJ-möss med DIN ökades intracellulära Ca2þ-koncentrationer (figur 3c). detta fenomen rekapitulerades hos Nphs2Dipod-möss på dag 20 (kompletterande figur S3B). I båda musmodellerna fanns det en signifikant negativ korrelation mellan andelen PS-positiva RBC: er, med svårighetsgraden avanemiåterspeglas av hemoglobinnivåer (figur 3d och kompletterande figur S3D). Dessutom fanns det ett signifikant samband med njurskador som återspeglades av plasmaureakoncentrationen (figur 3e och tilläggsfigur S3E) och i mindre grad med proteinuri (figur 3f och tilläggsfigur S3F). För att kompensera för RBC-förlust ianemistimulerades bildandet av nya RBC hos båda mössen, vilket indikeras av ökad andel cirkulerande retikulocyter, och var signifikant korrelerad med storleken på PS-exponerande RBC (figur 3g och kompletterande figur S3G).

Figur 3 | Möss med doxorubicininducerad nefropati utvecklar förbättrad död i röda blodkroppar (RBC) medierad av ökade intracellulära kalciumnivåer.(a) Externalisering av fosfatidylserin (PS), som återspeglar RBC-död, förstärktes på dag 20 och 30 efter induktion av doxorubicininducerad nefropati. (b) Inkubation av friska RBC i plasma som togs på dag 10 och 20 från dessa möss ledde till PS-externalisering. (c) PS-externalisering åtföljdes av förbättrade intracellulära kalciumnivåer av RBC som togs på dag 20 och 30 efter induktion. (d–g) (d) procentandelen PS-exponerande RBC var korrelerad med hemoglobinnivåer, njurskada indikerad av (e) plasmaureakoncentration och (f) proteinuri, samt med (g) retikulocytbildning. (d–g) Data inkluderar varje tidpunkt (0, 10, 20 och 30 dagar) för varje frisk 129S1 / SvImJ och 129S1 / SvImJ mus med doxorubicininducerad nefropati. Aritmetisk betyder SEM visas. **P< 0.01,="" ***p="">< 0.001,="" and="" ****p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" (in.)="" 129s1/svimj="" mice;="" #p="">< 0.05,="" ##p="">< 0.01,="" and="" ####p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" to="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §§§§p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="" creatinine;="" mfi,="" mean="" fluorescence="">

Fördel medCistanche: behandling av njursjukdom och förbättring av njurfunktionen

KLICKA HÄR TILL DEL II.