Material och metoder

6. Cellupptagsanalyser

Internalisering av EVs i celler övervakades genom att först färga LEVs och SEVs med lipofilt DiI (MOP-D -3911) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Efter att ha behandlat celler med färgade elbilar i 1, 3, 6, 12, 24 och 48 timmar avlägsnades tillväxtmediet och celler fixerades med 4 procent paraformaldehyd (Wako, Japan). Hoechst 33342 (Invitrogen) tillsattes och cellerna inkuberades i 15 minuter vid rumstemperatur för att färga kärnorna (blå). Slutligen tvättades cellerna med PBS innehållande 1 procent bovint serumalbumin och fluorescens (röd och blå) observerades under ett fluorescensmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). Minst tre fält valdes ut och analyserades med hjälp av programvaran ImageJ.

7. Mätning av melaninhalt

För att bedöma melaninhalten inokulerades B16BL6-melanomceller först i 24-brunnsplattor (5 × 104 celler/brunn) i en volym av 500 μL. Efter 24 timmars inkubation, cellerbehandlades med 100 nM -MSH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) enbart eller 50 μL LEV och SEV vid 1, 5 och 10 µg/ml under 48 timmar. Efter behandling tvättades cellerna med PBS och inkuberades sedan med 2,5 procent trypsin (Gibco, Thermo Fisher Scientific) för isolering. Cellmikrosfärer löstes i 1 n natriumhydroxidlösning (Sigma-Aldrich) innehållande 1 procent DMSO (Sigma-Aldrich) under 1 timme vid 80 grader. Cellysaten överfördes till en 96-brunnsplatta och melaninhalten bestämdes genom att mäta absorbansen vid 405 nm med användning av en enzymmarkör (BioTek). Melaninhalten bestämdes med användning av en melaninstandardkurva konstruerad av 0-100 µg/ml syntetisk melaninlösning (Sigma-Aldrich) (extracellulära vesiklar Figur enligt följande). Melaninhalten beräknades genom jämförelse med kontroller.

8. Tyrosinasaktivitetsanalys

TYR-aktivitet mättes med användning av L-DOPA-oxidasaktivitet. B16BL6-celler inokulerades i -MEM-medium innehållande 100 nM Sigma-Aldrich -MSH (500 μL) och odlades med en densitet av 1 × 105 celler/brunn i 24-brunnsodlingsplattor. Efter att ha behandlat celler med 50 μL LEV och SEV i koncentrationer av 10, 50 och 100 µg/ml under 24 timmar, tvättades cellerna med PBS och lyserades med 1 procent Triton X -100 (Sigma-Aldrich). De lyserade cellerna inkuberades vid - 80 grad i 30 minuter och lyofiliserades sedan och lagrades vid RT i 10 minuter. De resulterande proverna klargjordes genom centrifugering vid 12,000 x g under 15 minuter, varefter 2 mg/ml L-DOPA (Sigma-Aldrich) tillsattes och inkuberades vid 37 grader i 1 timme. Absorbansen mättes sedan vid 490 nm med användning av en enzymmarkör (BioTek). Absorbansen mättes sedan vid 490 nm med hjälp av BioTek.

Klicka här för att hämtaCistanche-fördelarna med att bleka hudochvilka är effekterna av Cistanche tubulosa

9. Western blot-analys

Proteinnivåer associerade med den anti-melanogena vägen bestämdes intracellulärt genom Western blot-analys av helcellsextrakt. En volym på 500 μL B16BL6-musmelanomceller inokulerades i 24-brunnsplattor (1 × 105 celler/brunn). Celler lyserades genom inkubation i RIPA-buffert (Thermo Fisher Scientific) i 20 minuter i närvaro av proteashämmareblandning (Roche, Tyskland) och behandlades med 50 μL av 10, 50 och 100 μg/mL EVs i 24 timmar. Cellysaten centrifugerades vid 17 709 g under 15 minuter och proteinkoncentrationen i de resulterande lysaten bestämdes med användning av ett BCA-analyskit (Thermo Fisher Scientific). Lika mängder protein (10-20 ug/prov) laddades i brunnarna med Bolt 4-12 procent Bis-Tris Plus-geler (Invitrogen) och överfördes på elektrolytisk väg till PVDF-membran (polyvinylidenfluorid) (GE Healthcare, Chicago, IL, USA). Membranen tvättades med Tris-buffrad saltlösning innehållande 0,2 procent (v/v) tio -20 (TBST), stängdes med TBST innehållande 5 procent (vikt/volym) skummjölk (Gibco, Thermo Fisher Scientific) under 1 timme vid RT och inkuberades sedan vid 4 grader i en primär antikroppslösning utspädd med 1 procent (vikt/volym) skummjölk. Inkubation utfördes över natten. Primära antikroppar som användes inkluderade anti-TRP-1 (1:1000), anti-TRP-2 (1:1000) och anti-MITF(1:1000) antikroppar från Abcam, Cambridge, Storbritannien; anti-TYR (1:500) antikroppar från Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anti- -aktinantikropp (1:500; Santa Cruz) användes för standardisering på proteinnivå. Primära antikroppar detekterades med pepparrotsperoxidas (HRP)-märkt sekundär antikropp från Genetex (Irvine, CA, USA). Membran tvättades med TBST och inkuberades under 1 timme vid RT med en 1:2000 utspädning av den sekundära antikroppen i TBST. Signalen som genererades efter tvättning av membranet med TBST och inkubation med förstärkt kemiluminescens (ECL) reagens (GE Healthcare) detekterades med hjälp av ett ImageQuant 350 gelbildsystem (GE Healthcare).

10. Elektronmikroskopi detektion av intracellulär melaninproduktion

Celler bearbetades med LEV eller SEV och inkuberades i 48 timmar. Efter behandling fixerades cellerna genom inkubation med 200 mM kakodylatbuffert innehållande 8 procent glutaraldehyd och 20 procent paraformaldehyd (Wako). När de hade dehydratiserats med etanol preparerades ultratunna sektioner med en Leica EM UC7-mikrotom (Leica) och samlades upp på ett 200-nätkoppargaller. Sektioner färgades med 1 procent uranylacetat och blycitrat och bilder togs med ett JEOL JEM 1010 transmissionselektronmikroskop (JEOL) vid 80 kV.

Cistanche-extrakt

11. Mätning av blekningseffekt med hjälp av en mänsklig hudmodell

Derm-me (Tego Science, Seoul, Korea) mänsklig hudmodell användes för att testa blekningseffekten av LEV. Mänsklig hudvävnad behandlades med 10 μg/mL lev under 7 dagar som en negativ kontroll. Koncentrationen av arbutin var 70 µg/ml. Human hudvävnad löstes i 1 N NaOH och absorbansen vid 405 nm mättes med användning av en enzymmarkör (BioTek) för att bestämma melaninhalten. På dag 7 jämfördes hudpigmentering genom mikroskopisk analys av Fontana - masonfärgade prover. För Fontana-Masson-färgning fixerades hudprover över natten vid RT i 4 procent paraformaldehyd (Waco), sektionerades och bäddades in i paraffinvax. Paraffininbäddade sektioner upphettades sedan i en ugn vid 60 grader i 1 timme för att torka. Sektionerna blötlades sedan tre gånger i xylen, två gånger i 95 procent etanol och två gånger i 100 procent etanol och tvättades sedan med destillerat vatten. Fontana-Masson-färgning utfördes med användning av ammoniaksilverlösningen vid 56 grader och tvättades med destillerat vatten. Objektglasen fixerades sedan i 0,2% guldkloridlösning och nedsänktes i 5% natriumtiosulfatlösning vid rumstemperatur. Slutligen torkades objektglasen i färsk alkohol.

12. Statistisk analys

Data erhållna från experimenten uttrycks som medelvärde ± SEM. Vi utförde experiment med fyra satser av aktivitet, melanininnehåll och TYR-aktivitet (kompletterande Fig. S3). Envägsvariansanalys (ANOVA) och Dunnetts test utfördes med användning av GraphPad Prism (GraphPad Prism Software Inc., San Diego, CA, USA). p < skillnader; 0.05, p < 0.01, p < 0.001 ansågs vara statistiskt signifikanta.

Cistanche tubulosa extrakt

Diskussion

Till skillnad från de flesta eukaryota celler har växter en komplex cellvägg, vilket utgör en viktig barriär för exosomers rörelse. Som ett resultat frigör växtceller exosomer genom en serie multivesikulära kroppar smälta till plasmamembranet. De sekretoriska produkterna som frigörs av växtsekret deponeras i det periplasmatiska gapet intill plasmamembranet; när de ackumuleras genererar de ett tryck som gör att sekretet kan passera cellväggsbarriären. Som ett resultat kan utsöndrat material, inklusive exosomer, frigöras utan behov av energi. Växthärledda elbilar liknar i storlek eller större än naturligt förekommande exosomer från djurceller och liknar de som observerats i exosomal solrosvätska (50-200 nm) och Arabidopsis EV:er (50-300 nm). Cellulär upptagseffektivitet anses vara en nyckeldeterminant för effektivitet, eftersom målen för många terapeutiska medel är lokaliserade intracellulärt. Därför bestämde vi den optimala tidpunkten och koncentrationen av upptag av melanomceller och observerade snabb överföring av LEV och SEV till melanomceller inom 12 timmar.

TYR är ett glykoprotein som katalyserar omvandlingen av l-tyrosinas till L-DOPA, det hastighetsbegränsande steget i melaninsyntesen. Båda elbilarna uppvisar en anti-melanogen effekt, men den anti-melanogena effekten av LEV är betydligt större än den för SEV.

Melaninproduktionen regleras av -MSH-MC1R, och hämning av PKC är känd för att minska hud- och hårpigmentering. Men många genetiska, biokemiska och farmakologiska studier tyder på att -MSH-MC1R-signalvägen är en viktig drivkraft för melanogenes. Även om våra experiment inte visade en direkt interaktion mellan MITF och TYR, visades det att LEVs hämmar melanogenes genom att minska MITF-uttrycket genom den UV-beroende -MSHMC1R-vägen, vilket i sin tur minskar uttrycket av TYR, TRP-1, och TRP-2. Vi antar att TRP-familjens proteiner är indirekt kopplade till varandra, men ytterligare experiment kan krävas för att visa en direkt interaktion mellan dem. Dessutom visar rekonstruerade mänskliga hudmodeller att UV-inducerad melaninsyntes och melanininnehåll effektivt hämmas av LEV.

Cistanche dulcis

Slutsats

Våra resultat tyder på att LEV är kandidater för nya anti-melanogena läkemedel som minskar melanogenes genom att hämma uttrycket av melaninrelaterade proteiner. Resultaten bekräftade att LEV minskade MITF och därmed nedreglerade TRP i B16BL6 melanomceller. levs och arbutin hämmade TRY med 66 procent respektive 67 procent. Melaninhalten i LEVs-behandlad rekonstruerad hud minskade med 43 procent och 28 procent jämfört med den obehandlade negativa kontrollen respektive arbutin som positiv kontroll.

Baserat på de tidiga fynden tror vi att växtbaserade elbilar kan vara användbara som ett anti-melanogent medel för utveckling av naturlig kosmetika. Ytterligare forskning behövs i framtiden för att utveckla växtbaserade elbilar som en effektiv ingrediens för hudförbättring och det är nödvändigt att demonstrera säkerheten hos växtbaserade elbilar på mänskliga hudmodeller. Våra resultat tyder på att EV kan användas för att minska melanin och på så sätt ljusa upp huden. Däremot kan EV ha toxiska effekter på huden, och andra experiment som allergitester eller Ames-tester bör utföras.

REFERENSER

[1] Nosanchuk JD, Nimrichter L, Casadevall A, et al. En roll för vesikulär transport av makromolekyler över cellväggar i svamppatogenes. Commun Integr Biol. 2008;1(1):37–39.

[2] Robinson DG, Ding Y, Jiang L. Okonventionell proteinsekretion i växter: en kritisk bedömning. Protoplasma. 2016;253(1):31–43.

[3] Paiva EA. Hur passerar sekretoriska produkter växtcellväggen för att frigöras? En ny hypotes som involverar cykliska mekaniska effekter av protoplasten. Ann Bot. 2016;117(4):533–540.

[4] Hood JL, Scott MJ, Wickline SA. Maximerar exosom kolloidal stabilitet efter elektroporering. Anal Biochem. 2014;448(1):41–49.

[5] Rutter BD, Innes RW. Extracellulära vesiklar isolerade från bladapoplasten bär stressresponsproteiner. Plant Physiol. 2017;173(1):728–741.

[6] Luan X, Sansanaphongpricha K, Myers I, et al. Ingenjörsexosomer som raffinerade biologiska nanoplattformar för läkemedelsleverans. Acta Pharmacol Sin. 2017;38(6):754–763.

[7] Videira IF, Moura DF, Magina S. Mekanismer som reglerar melanogenes. En Bras Dermatol. 2013;88(1):76–83.

[8] Park HY, Lee J, Kapasi S, et al. Topisk applicering av en proteinkinas C-hämmare minskar hud- och hårpigmentering. J Invest Dermatol. 2004;122(1):159–166.

[9] Yamanishi DT, Graham M, Buckmeier JA, et al. Det differentiella uttrycket av proteinkinas C-gener i normala humana neonatala melanocyter och metastaserande melanom. Carcinogenes. 1991;12(1):105–109.

[10] Borovansky J, Riley PA. Melaniner och melanosomer: biosyntes, biogenes, fysiologiska och patologiska funktioner. Hoboken, NJ: Wiley-Blackwell; 2011

[11] D'Mello S, Finlay G, Baguley B, et al. Signalvägar i melanogenes. Int J Mol Sci. 2016;17(7):1–18.