Natalenamider A–C, cykliska tripeptider från The Termite-Associated Actinomadura Sp. RB99

Abstrakt:

Under senare år har undersökningar av insektsassocierade bakteriers biokemi ökat. I kombination med analytiska dereplikationsprocesser ger dessa studier en kraftfull strategi för att identifiera strukturellt och/eller biologiskt nya föreningar. Icke-ribosomalt syntetiserade cykliska peptider har ett brett bioaktivitetsspektrum med hög medicinsk potential.

Här rapporterar vi upptäckten av tre nya cykliska tripeptider: natalenamider A–C (föreningar 1–3). Dessa föreningar identifierades från odlingsbuljongen av den svampodlande termitassocierade Actinomadura sp. RB99 med en vätskekromatografi (LC)/ultraviolett (UV)/masspektrometri (MS)-baserad dereplikationsmetod. Kemiska strukturer för de nya föreningarna (1–3) fastställdes genom analys av omfattande spektroskopiska metoder, inklusive endimensionell (1H och 13C) och tvådimensionell (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC) kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR), tillsammans med högupplösta elektrosprayjoniseringsmasspektrometridata (HR-ESIMS). De absoluta konfigurationerna av de nya föreningarna klargjordes med hjälp av Marfeys analys. Genom flera bioaktivitetstester för tripeptiderna fann vi att förening 3 uppvisade signifikanta hämmande effekter på 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX)-inducerad melaninproduktion. Effekten av förening 3 liknade effekten av kojinsyra, en förening som ofta används som ett kosmetiskt material med en hudblekande effekt.

Ljus, slät och känslig hud har alltid varit målet för orientaliska kvinnor. Forskningen och utvecklingen av blekningsmedel för hudvårdsprodukter är huvudsakligen baserad på hämning av tyrosinasaktivitet.

Föreningar som innehåller bensenringar eller fenoliska hydroxylstrukturer har potentiella blekningseffekter, såsom det för närvarande vanligen använda blekmedlet arbutin, som kan utöva blekande effekter genom att hämma aktiviteten av tyrosinas.

Och vi fann att Cistanche deserticola har en blekande effekt. Den huvudsakliga aktiva ingrediensen i Cistanche deserticola, fenyletanoidglykosider, är en slags naturlig glykosidförening. Studier har funnit att fenyletanoidglykosider kan hämma aktiviteten av tyrosinas och produktionen av melanin i humana epidermala melanocyter och har en blekande effekt. medlets effektivitet.

Klicka cistanche tubulosa extrakt pulver

Nyckelord:

svamp växande termit; Actinomadura sp.; tripeptider; natalenamider A–C; hudblekande effekter.

1. Introduktion

Den kemiska analysen av skyddande bakteriesymbionter hos odlingsinsekter har rönt stor uppmärksamhet bland naturproduktkemister under de senaste åren [1–5]. Genom att använda toppmoderna kärnmagnetisk resonans (NMR)/masspektrometri (MS)-baserade dereplikationsprocesser och ekologiskt relevanta bioanalyser har en imponerande mängd strukturellt spännande naturprodukter, inklusive flera icke-ribosomalt syntetiserade cykliska peptider, upptäckts. från mikrobiella symbionter [6]. De mest framträdande exemplen inkluderar det antifungala dentigerumycinet, en cyklisk depsipeptid isolerad från en svamptillväxt-myraassocierad Pseudonocardia sp. [7], och gerumycinerna A–C, piperazinsyrabärande cykliska depsipeptider identifierade från Pseudonocardia sp. [8].

Cykliska peptider har visat sig uppvisa ett brett spektrum av biologiska aktiviteter, vilket främjar flera syntetiska tillvägagångssätt mot dessa farmakologiskt lovande strukturer [9-12]. Över 40 cykliska peptidläkemedel marknadsförs och används i stor utsträckning i kliniska miljöer, och ungefär ett nytt cykliskt peptidläkemedel kommer in på marknaden varje år, i genomsnitt [13].

Som en del av vår fortsatta strävan att identifiera strukturellt nya och / eller bioaktiva sekundära metaboliter från termitassocierade mikrober [14-17], fokuserade vi på den termitassocierade Actinomadura sp. RB99, isolerad från den svampväxande termiten, Macrotermes natalensis. Vår vätskekromatografi (LC)/ultraviolett (UV)/masspektrometri (MS)-baserad dereplication strategi gav potentiellt nya bioaktiva naturprodukter. I den här studien rapporterar vi isolering och kemisk identifiering av tre nya cykliska tripeptider, natalenamid A–C (föreningar 1–3, figur 1), med hjälp av en LC/UV/MS-baserad dereplikationsmetod samt deras biologiska utvärderingar för cytotoxiska , antiinflammatoriska och hudblekande aktiviteter.

2. Resultat och diskussion

2.1. Vätskekromatografi (LC)/Ultraviolett (UV)/Masspektrometri (MS)-baserad isolering av föreningarna 1–3

Actinomadura sp. RB99 isolerades från ytan av en termitarbetare (M. natalensis). Fylogenetisk analys av en nästan komplett 16S ribosomal ribonukleinsyra (rRNA)-sekvens tyder på att stam RB99 tillhör släktet Actinomadura, med närmaste granne Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T. Efterföljande LC/UV/MS-baserad analys av berikade kulturextrakt avslöjade en uppsättning karakteristiska UV-absorptioner med unika molekylära jontoppar innehållande kväveatomer.

För att identifiera respektive metaboliter och undersöka deras aktivitet, storskalig fermentering med optimerade tillväxtförhållanden (100 agarplattor från 2 L ISP2-agar, pH 6, 10 dagar vid 30 ◦C) och en etablerad upparbetnings- och förreningsprocedur var tillämpas [17]. Efterföljande LC-UV/MS-styrd fraktionering och repetitiv semi-preparativ högpresterande vätskekromatografi (HPLC) resulterade i isoleringen av tre metaboliter med ett unikt NMR/MS-mönster. Vi utförde tillväxt- och mediestudier med olika salt (NaCl, KBr 1–3 procent) och mediasammansättningar (ISP1-6 media) för att efterlikna den naturliga miljön och stimulera metabolitproduktion, vilket också ledde till närvaron av de tre nya metaboliter (se kompletterande figur S19).

2.2. Strukturell belysning av föreningarna

Natalenamid A (1) förvärvades som ett amorft pulver. Molekylformeln för 1 bestämdes vara C19H25N3O5 från den natriumadducerade molekyljonen vid m/z 398.1691 [M plus Na] plus (beräknad för C19H25N3O5Na, 398.1692) med användning av positiv-jon-mod högupplöst elektrospektrometry-joniseringsmass-HR ESIMS) data. Det infraröda (IR) spektrumet visade ett starkt absorptionsband vid 167 0 cm−1, vilket tyder på närvaron av amidgrupper i molekylen. Den detaljerade analysen av 1H NMR-data för 1 (tabell 1) indikerade de typiska signalerna för ett peptidskelett, som visade två metylsignaler (δH 0.91 (3H, d, J=7).{{29 }} Hz, H-3) och 0.92 (3H, d, J=7.0 Hz, H-4)), tre metylensignaler (δH 1,95 (IH, m, H-7a), 2,27 (IH, m, H-8a), 2,36 (IH, m, H-8b), 2,48 (IH , m, H{{50}}b), 2,97 (1H, dd, J=14.0, 8.0 Hz, H{{58} }a), och 3,20 (1H, dd, J=14.0, 5,0 Hz, H-12b)), fyra metinsignaler (δH 2,02 (1H) , m, H-2), 4,16 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1), 4,20 (1H, dd, J=8.5, 4,5 Hz, H-6) och 4,63 (1H, dd, J=8.0, 5,0 Hz, H-11)) och fem överlappande aromatiska protoner (δH 7,18 (1H, m, H-16), 7,23 (2H, m, H-14/18) och 7,24 (2H, m, H-15/17)).

13C NMR-spektrumet (tabell 1), med hjälp från HSQC- och HMBC-spektra, visade totalt 19 kolresonanser som är ansvariga för två metylsignaler (δC 18,9 och 19,9), tre metylensignaler (δC 27.0, 30.6 och 38.8), nio metinsignaler (δC 32.1, 55.6, 58.0, 60.4, 127.8, 129.5 (×2) och 130.6 (×2)), inklusive fem aromatiska kol, ett olefiniskt kol signal (5C 138,8) och fyra karbonylkolsignaler (5C 173,2, 173,3, 174,8 och 181,3). I kombination med ovanstående spektroskopiska data visade detaljerad inspektion av tvådimensionell (2D) NMR (1H-1H COSY, HSQC och HMBC-experiment) närvaron av tre aminosyror i 1: glutamat (Glu), fenylalanin ( Phe) och valin (Val) (Figur 2). Dessa aminosyrors kopplingsförmåga bestämdes av HMBC-korrelationerna av H-1/C-5 och C-19, H-11/C-10 och C{ {50}} och H-6/C-5 och C-10 (Figur 2).

För att identifiera den absoluta konfigurationen av 1, användes Marfeys metod för att bestämma stereokemin för -H-multiplar (C-1, C-6 och C-11). Syrahydrolysaten av 1 och standardaminosyror (L/D-Glu, Phe och Val) derivatiserades med 1-fluoro-2,4-dinitrofenyl-5-L-alanin amid (L-FDAA). Successivt analyserades den derivatiserade blandningen av 1 och standardaminosyrorna med LC/MS för att undersöka deras retentionstid. De absoluta konfigurationerna av Glu-, Phe- och Val-enheterna bestämdes alla vara L-former, baserat på retentionstiderna för L-FDAA-derivaten av 1 jämfört med de för standardaminosyrorna. Således klargjordes strukturen av 1 som den cykliska tripeptiden som visas i figur 1.

Natalenamid B (2) isolerades som ett amorft pulver. Dess molekylära formel (C20H27N3O5) härleddes från väte- och natriumtillförda molekylära jontoppar vid 390.2032 [M plus H] plus ((Plus (beräknat för C20H28N3, 390.2029) och 412.1849 [M plus NA] plus (beräknat för C20H27N3, 412848484848, respektive. Jämfört med molekylformeln och NMR-spektraldata för 1, verkade förening 2 ha en ytterligare CH2-grupp i peptidskelettet. Omfattande granskning av de endimensionella (1D) (1H och 13C NMR) och 2D NMR (1H–1H COSY, TOCSY, HSQC och HMBC) spektra av 2 avslöjade förekomsten av tre aminosyrarester: Glu, Phe och Leu (leucin). Sekvensen för dessa aminosyror konstruerades baserat på HMBC-korrelationerna av H-1/C-6 och C-20, H-12/C-11 och C -20 och H-7/C-6 och C-11 (Figur 2). För att bestämma den absoluta konfigurationen av 2 utfördes derivatisering av Glu-, Phe- och Leu-resterna med L-FDAA och analyserades sedan med LC/MS. I LC/MS-data detekterades L-Glu, L-Phe och L-Leu genom att jämföra retentionstiderna för L-FDAA-derivaten av 2 med de för standardaminosyrorna. Således fastställdes den kemiska strukturen av 2 som den cykliska tripeptiden som visas i figur 1.

HR-ESIMS-data i positiv mod för natalenamid C (3) visade väte- och natriumaddukterade molekyljoner vid 424,1870 [M plus H] plus (beräknat för C23H26N3O5, 424,1872) och 446,1694 [M plus Na] plus (beräknat för N3O35H2, beräknat för C23H26N3O5 424,1692). Detta antydde att dess molekylformel var C23H25N3O5. En detaljerad analys av 1D- och 2D-NMR-spektra för 3 indikerade att dess kemiska struktur liknade den för 2, förutom att Leu ersattes med Phe i 3. Kopplingen mellan de tre identifierade aminosyrorna i 3 verifierades med hjälp av HMBC-korrelationerna av H-1/C-9 och C-23, H-15/C-14 och C-23 och H-10/ C-9 och C-14 (Figur 2). Genom att tillämpa Marfeys metod på förening 3, klargjordes de absoluta konfigurationerna av -H-multiplarna (C-1, C-10 och C-15 till att vara en L-Glu och två L -Phe-enheter. Följaktligen bestämdes den fullständiga strukturen av 3 som visas i figur 1.

Natalenamider A–C är tricykliska peptider, förmodligen av icke-ribosomalt ursprung. För närvarande har flera bioaktiva cykliska tripeptider karakteriserats som naturliga produkter: cytotoxiska 17-ledade cykliska tripeptider (t.ex. OF4949 I–IV) isolerade från Penicillium rugulose [18]; antifungala sklerotomier A−K, identifierade från jäsningsbuljongen av halotoleranta bakterier [10]; och antiproliferativt psykrofilt E, isolerat från en blandad kultur av två marinalger-härledda svampstammar av släktet Aspergillus [19].

2.3. Biologiska aktiviteter hos föreningarna 1-3

Eftersom cykliska peptider har rapporterats uppvisa ett brett spektrum av biologiska aktiviteter utvärderades biologiska effekter av de isolerade cykliska tripeptiderna ({{0}}) med hjälp av tre bioaktiviteter. Cytotoxiciteten hos föreningar 1-3 undersöktes mot fyra cancercellinjer (MCE7 bröstcancerceller, HeLa livmoderhalscancerceller, A549 humana lungcancerceller och HepG2 levercancerceller) vid olika koncentrationer (0, 6,25 , 12,5, 25, 50 och 100 uM). Förening 1 påverkade inte cellviabiliteten för MCF--7-, HeLa- eller A549-celler. Emellertid minskade behandlingen av HepG2-celler med 100 M av förening 1 cellviabiliteten till 78,5 plus 3,2 procent (Figur 3). Förening 2 reducerade cellviabiliteten för HeLa- och A549-celler till 82.9  2.1 procent respektive 73.5=3.0 procent, men påverkade inte livsdugligheten för MCF-7 eller HepG2-celler (Figur 3). Förening 3 påverkade inte livsdugligheten för någon av cellinjerna (Figur 3).

Därefter användes RAW264.7-makrofager för att undersöka de antiinflammatoriska effekterna av de isolerade föreningarna. För att eliminera fel i produktionen av NO orsakade av förändrade cellöverlevnadshastigheter undersöktes icke-toxiska koncentrationer av varje förening. Som visas i figur 4 hade föreningarna 1–3 få cytotoxiska effekter i RAW264.7-celler (figur 4A–C) och utövade inga hämmande effekter på NO-produktion i lipopolysackarid (LPS)-stimulerade RAW264.7-celler (figur 4D–F) .

De hämmande effekterna av föreningarna 1–3 på melaninhalten i B16F10-celler undersöktes som bevis på deras hudblekande aktiviteter (Figur 5). Eftersom förändringar i cellviabilitet orsakar fel i produktionen och mätningen av melanin, undersökte vi först effekterna av föreningar 1–3 på B16F10-cellöverlevnad. Föreningarna 1–3 utövade inga cytotoxiska effekter i B16F10-celler vid någon av de använda koncentrationerna (Figur 5A–C). Vi utvärderade sedan de hämmande effekterna av föreningarna på 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX)-inducerad melaninproduktion i B16F10-celler (Figur 5D–F). IBMX, en välkänd stimulator av melanogenes, inducerar en signifikant ökning av melaninproduktionen efter en enda behandling i melanomceller. Bland de utvärderade föreningarna uppvisade förening 3 (vid 5–100 µM) signifikanta hämmande effekter på IBMX-medierad melaninsyntes på ett dosberoende sätt. Kojic acid, vår positiva kontroll, har använts i stor utsträckning som ett kosmetiskt material med hudblekande effekter [20]. Den hämmande effekten av förening 3 på IBMX-inducerad melaninproduktion liknade den för kojinsyra (Figur 5F), vilket tyder på att förening 3 fungerar som en potent hämmare av IBMX-inducerad melaninproduktion i B16F10-melanomceller.

Dessutom var förening 3 förorenad med ett litet antal föroreningar, som fastställdes vara fettsyraanaloger genom tolkning av NMR-spektroskopiska data och LC/MS-analys (Supplementary Materials, Figurer S11–S15 och S23). För att identifiera föroreningarnas aktivitet utfördes ytterligare experiment med fettsyraanalogerna för deras hämmande effekter på IBMX-inducerad melaninproduktion i B16F10-celler, vilket avslöjade att de testade föreningarna inte hade någon blekningseffekt (Supplementary Materials, Figur S24). Så även om vi inte kan utesluta att föroreningarna i förening 3 är ansvariga för den hämmande effekten på IBMX-inducerad melaninproduktion, verkar detta osannolikt.

3. Material och metoder

3.1. Allmänna experimentella förfaranden

Infraröda spektra förvärvades på en Bruker IFS-66/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, USA) spektrometer. Elektrosprayjoniseringen och HR-ESIMS-spektra mättes på en SI-2/LCQ DecaXP-vätskekromatografi (LC)-masspektrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). NMR-spektra, inklusive 1H–1H COSY, HSQC och HMBC-experiment, utfördes med en Varian UNITY INOVA 800 NMR-spektrometer (Varian, Palo Alto, CA, USA) som arbetar vid 800 MHz (1H) och 200 MHz (13C), med kemiska skift angivna i ppm (δ). Preparativ HPLC använde en Waters 1525 binär HPLC-pump med Waters 996 Photodiode Array Detector (Waters Corporation, Milford, CT, USA). Silikagel 60 (230–400 mesh, Merck, Kenilworth, NJ, USA) och RP-C18 silikagel (230–400 mesh, Merck, användes för kolonnkromatografi. Semi-preparativ HPLC använde ett Shimadzu Prominence HPLC-system med SPD{ {22}}A/20AV Series Prominence HPLC ultraviolet-visible (UV–Vis) Detektorer (Shimadzu, Tokyo, Japan). LC/MS-analyser utfördes på ett Agilent 1200 Series HPLC-system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) utrustad med en diod array-detektor och en 6130 Series ESI-masspektrometer med en analytisk Kinetex (4,6 × 100 mm, 3,5 µm). Merck förbelagda silikagel F254-plattor och RP-18 F254s-plattor användes för tunna Fläckar detekterades på TLC under UV-ljus eller genom upphettning efter sprayning med en anisaldehyd-svavelsyralösning.

3.2. Mikrobiellt material

Actinomadura sp. RB99 isolerades från ytan av en termitarbetare av släktet, M. natalensis, (koloni Mn103, GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) den 2 januari{ {13}}10. Biomaterial placerades i rena plastpåsar och bearbetades inom en dag efter insamling. Termiter tvättades i sterilt avjoniserat vatten och bakterier isolerades genom att de resulterande suspensionerna ströks ut på medium med lågt näringsinnehåll med kitin (per liter: 4 g kitin, 0,7 g K2HPO4, 0,3 g KH2PO4, 0,5 g MgSO4·5H2O, 0,01 g FeSO4·7H2O, 0,001 g ZnSO4, 0,001 g MnCl2 och 20 g agar) [21]. Isolat med Actinobacteria-liknande morfologi överfördes till ISP2-agar (per liter: 10 g maltextrakt, 4 g jästextrakt, 4 g glukos och 20 g agar) och subodlades tills rena isolat erhölls.

3.3. DNA-extraktion och polymeraskedjereaktionsförstärkning

Actinomadura sp. RB99 odlades i näringsrik flytande media ISP2 i fem till sju dagar vid 30 ◦C. Celler skördades och genomiskt DNA extraherades med GenJet genomiskt DNA-reningskit (#K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) enligt tillverkarens instruktioner med följande ändringar: (a) lysozymbehandling förlängdes till 40 minuter, och (b) proteinas K-behandling förlängdes till 40 min. DNA kvantifierades fotometriskt med hjälp av en Nanodrop Lite-spektrometer (Thermo Scientific).

För fylogenetiska studier amplifierades 16S rRNA-genen med användning av primeruppsättningen, 1492R/27F. Varje amplifieringsreaktion preparerades i en slutlig reaktionsvolym på 25 µL innehållande 7,25 µL destillerat vatten, 5 µL HF-buffert, 5 µL av varje primer (2,5 µM), {{10}},5 µL dNTPs (10 µM), 0,25 µL Phusion High-Fidelity DNA-polymeras (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) och 2 µL extraherat DNA (mall). Polymeraskedjereaktion (PCR) utfördes under följande betingelser: 98 ◦C under 38 s; 32 cykler på 98 ◦ i 30 s, 52 ◦ C i 45 s, 72 ◦ C i 1 min 20 s; och en slutlig förlängning av 72 ◦C i 8 min. PCR-produkten visualiserades genom agarosgelelektrofores, och PCR-reaktioner renades med användning av ett PCR-reningskit (Thermo Scientific). DNA-fragment sekvenserades vid GATC (Konstanz, Tyskland).

3.4. Sekvensering och artidentifiering

Sekvenser bedömdes för renhet och felmatchningar med hjälp av BioEdit [22]. Framåt- och bakåtsekvenserna som erhölls för varje stam sattes ihop med BioEdit och testades för chimärer med användning av DECIPHER (http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html). De resulterande sekvenserna deponerades i GenBank (accessionsnummer: KY558684). Blastanalyser med nästan kompletta 16S rRNA-sekvenser (1368 bp) utfördes med hjälp av databasen National Center for Biotechnology Information (NCBI) (referens-RNA-sekvenser). Resultaten indikerade att stam RB99 är en medlem av släktet Actinomadura. Sekvenser av de första 10 träffarna laddades ner från NCBI-databasen och justerades med 16S rRNA-sekvensen för Actinomadura sp. RB99 med hjälp av Sina-sekvensanpassningstjänsten [23]. Två olika fylogenetiska träd rekonstruerades med grannsammanfogning eller maximal sannolikhet algoritmer med hjälp av MEGA mjukvaruversion 7.0.26 [24-26]. Den evolutionära avståndsmodellen av Tamura och Nei användes för att generera evolutionära distansmatriser för algoritmerna för maximal sannolikhet och grannsammanfogning, med radering av fullständiga luckor och saknade data [27]. För algoritmen för maximal sannolikhet användes diskret gammafördelning (plus G), och hastighetsvariationsmodellen gjorde det möjligt för vissa platser att vara evolutionärt oföränderligt (plus I). För grannkopplingsalgoritmen modellerades hastighetsvariationen mellan platser med en gammafördelning (plus G). Konfidensvärdena för noder utvärderades genom bootstrap-analyser baserade på 1000 omsamplingssteg [28].

3.5. Extraktion och isolering

Actinomadura sp. RB99 odlades i 50 mL ISP2-buljong i sju dagar vid 30 ◦C (förodling) och användes för att ympa 100 ISP2-agarplattor. Plattorna inkuberades i 10 dagar vid 30 ◦C, skars i små bitar, konsoliderades och nedsänktes över natten i MeOH. MeOH-fasen filtrerades och indunstades under reducerat tryck. MeOH-extraktet (20 g) löstes i destillerat vatten (700 ml) och fördelades sedan med lösningsmedel med EtOAc (700 ml) tre gånger, vilket gav 1,1 g återstod. Den EtOAc-lösliga fraktionen (1,1 g) från MeOH-extraktet laddades på en silikagelkolonn (230–400 mesh) för kromatografi och eluerades med ett gradientlösningsmedelssystem av CH2Cl2-MeOH (100:1 till 1: 1, v/v). Detta gav sex fraktioner (A–F), som utsattes för LC-UV/MS-baserad analys. Dereplikationsanalys med användning av ett internt UV-spektralbibliotek antydde förekomsten av mindre peptidanaloger i fraktion E. Dessa visade ett enkelt UV-mönster vid cirka 220 nm och unika jontoppar med molekylformel innehållande kväveatomer. Den polära fraktionen E (233 mg) fraktionerades genom preparativ omvänd-fas HPLC (Phenomenex Luna C18, 250 × 21,2 mm id, 5 µm, Torrance, CA, USA) med användning av CH3CN/H2O (1:9 till 9:1, v /v, gradientsystem, flödeshastighet: 5 mL/min) för att ge fem delfraktioner (E1–E5). Underfraktion E2 (27 mg) renades med en semipreparativ omvänd fas HPLC (Phenomenex Luna C18, 250 × 10,0 mm id, 5 µm) med 33 procent MeOH/H2O (isokratiskt system, flödeshastighet: 2 ml/min. 20 förening 1 (5,8 mg, tR=57,0 min). Föreningar 2 (1,6 mg, tR=42,0 min) och 3 (1,5 mg, tR=55,0 min) isolerades från subfraktion E3 (15 mg) genom semi-preparativ omvänd fas HPLC som eluerar 43 procent MeOH/H2O (isokratiskt system, flödeshastighet: 2 ml/min).

3.5.1. Natalenamid A (1)

3.5.2. Natalenamid B (2)

3.5.3. Natalenamid C (3)

3.6. Syrahydrolys av föreningar 1–3

En mängd på totalt 0,4 mg av varje förening (1–3) hydrolyserades med 6 N HCl (500 µL) i 1 timme vid 110 ◦C. Efter kylning till rumstemperatur indunstades hydrolysat av 1–3 för att avlägsna spår av HCl. Destillerat vatten (500 µL) sattes till hydrolysatblandningarna och indunstades sedan för att avlägsna spår av HCl; denna process utfördes tre gånger.

3.7. Bestämning av den absoluta konfigurationen av aminosyror i 1–3

Hydrolysatblandningarna (1–3), såväl som standardaminosyrorna (L/D-Leu, Glu, Phe och Val), löstes i 1 N NaHCO3 (100 µL) och behandlades sedan med 50 µL L-FDAA (10 mg/ml i aceton). Successivt upphettades varje hydrolysat under 10 minuter vid 80 ◦C. Varje blandning släcktes med 2 N HCl (50 ul) och koncentrerades i vakuum. Återstoden löstes i 300 ul MeOH. Varje alikvot (5 µL) som erhölls från hydrolysatblandningarna injicerades direkt på LC/MS (Phenomenex Luna C18, 4,6 × 100 mm, 3,5 µm, flödeshastighet på 0,3 mL/min), och en full scan i positiv och negativ jonmoder (avsökningsintervall från m/z 100 till 1000) användes för att identifiera retentionstiderna för de L-FDAA-derivatiserade aminosyrorna.

Den mobila fasen, bestående av myrsyra i destillerat vatten ({{0}},1 procent v/v) (A) och acetonitril (B), bars med ett gradientlösningsmedelssystem enligt följande: 20–40 procent (B) i 10 minuter, 100 procent (B) isokratisk i 5 minuter och sedan 20 procent (B) isokratisk under 5 minuter, för att utföra en efterkörningstvättprocedur för kolonnen. Retentionstiderna för de L-FDAA-derivatiserade aminosyrorna som användes som standarder var 16,7 min (L-Glu, m/z 400 [M plus H] plus), 18,2 min (D-Glu, m/z 400 [M plus H] plus), 22,1 min (L-Val, m/z 370 [M plus H] plus), 25,1 min (D-Val, m/z 370 [M plus H] plus), 25,6 min (L-Phe, m/ z 418 [M plus H] plus), 27,0 min (D-Phe, m/z 418 [M plus H] plus), 25,5 min (L-Leu, m/z 384 [M plus H] plus) och 28,2 min (D-Leu, m/z 384 [M plus H] plus). Retentionstiderna för de derivatiserade hydrolysaten av 1–3 var L-Glu (16,9 min), L-Phe (25,7 min) och L-Val (22,5 min) från 1; L-Glu (16,7 min), L-Phe (25,7 min) och L-Leu (25,6 min) från 2; och L-Glu (16,9 min) och L-Phe (25,7 min) från 3.

3.8. Cytotoxiska analyser med användning av cancerceller

MCF7-, HeLa- och A549-celler köptes från American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). HepG2-celler köptes från Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). MCF7-celler odlades i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum. HeLa- och A549-celler odlades i Dulbeccos minimala essentiella medium (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, USA) kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum. HepG2-celler odlades i Minimum Essential Medium kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum. Odlingsförhållandena hölls vid 37 ◦C i en fuktad atmosfär innehållande 5 procent CO2. Cytotoxicitet testades på dessa fyra humana cellinjer (MCF7, HeLa, A549 och HepG2) med användning av EZ-CyTox cellviabilitetsanalyskit (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan). Kortfattat såddes 5 × 103 celler/brunn i 96-brunnsplattor. Efter 24 timmar behandlades cellerna med föreningar vid de angivna koncentrationerna. Efter 72 timmars inkubation användes EZ-CyTox cellviabilitetsanalyskit. Efter 2 timmars inkubation mättes absorbansen vid 450 nm med en referens vid 620 nm. Cellviabiliteten beräknades som en procentandel av kontrollen.

3.9. Antiinflammatorisk aktivitet

Musmakrofagen RAW264.7-cellinjen köptes från American Type Culture Collection. Celler odlades i DMEM kompletterat med 10 procent fetalt bovint serum (FBS), 100 enheter/ml penicillin och 100 µg/ml streptomycin och inkuberades vid 37 ◦C i en fuktad atmosfär med 5 procent CO2. Cellviabilitet mättes med användning av Ez-Cytox cellviabilitetsdetektionskit. Celler inkuberades i 96-brunnsplattor i en koncentration av 2500 celler per brunn under 24 timmar och behandlades med de angivna koncentrationerna av föreningarna 1–3 under 24 timmar. Därefter tillsattes Ez-Cytox-reagens till varje brunn. Den optiska densiteten vid 450 nm mättes efter 1 timme med användning av en mikroplattläsare (PowerWave XS; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) för att uppskatta cellviabilitet. I ett separat experiment inkuberades RAW264.7-celler i 96-brunnsplattor i en koncentration av 30,000 celler per brunn under 24 timmar. Efter serumsvält i 12 timmar förbehandlades cellerna med föreningarna 1–3 i 1 timme och stimulerades sedan med 1 µg/ml LPS i 24 timmar. Absorbansen av odlingsmedia i en Griess-reaktion mättes vid 540 nm med användning av en PowerWave XS-mikroplattläsare för att uppskatta NO-nivån.

3.10. Mätning av melanininnehåll

Musmelanomcellinjen, B16F10, köptes från American Type Culture Collection. Celler odlades i DMEM kompletterat med 10 procent FBS, 100 enheter/ml penicillin och 100 µg/ml streptomycin och inkuberades vid 37 ◦C i en fuktad atmosfär med 5 procent CO2. B16F10-celler inkuberades i 6 cm odlingsskålar vid 250,{12}} celler per brunn i DMEM kompletterat med 10 procent FBS, 100 µg/ml streptomycin och 100 U/ml penicillin under 24 timmar. Cellerna tvättades två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och stimulerades sedan med IBMX och inkuberades med olika koncentrationer av föreningarna 1–3 eller kojinsyra (positiv kontroll) i fenolrött fritt RPMI-medium kompletterat med 10 procent FBS, 100 enheter /ml penicillin och 100 µg/ml streptomycin under 24 timmar och 48 timmar. Absorbansen av odlingsmediet mättes vid 405 nm med användning av en PowerWave XS mikroplattläsare för att uppskatta melaninhalten. Resultaten uttrycks som veckförändring jämfört med kontrollen (celler som inte stimuleras av IBMX).

3.11. Statistisk analys

Alla data inklusive cellviabilitet, NO och melaninproduktion presenterades som medelvärde och standardavvikelse (SD). Alla analyser utfördes i tre exemplar och upprepades minst tre gånger. I denna studie inkluderades endast ett fåtal upprepningar av varje cellexperiment, så den icke-parametriska analysmetoden användes för statistisk analys. Kruskall–Wallis-testet användes för den statistiska analysen av varje variabel. SPSS-statistikpaketet användes för alla analyser (International Business Machines Corporation (IBM) SPSS-statistik version 21, Boston, MA, USA). Statistisk signifikans ansågs vara ett p-värde lägre än 0.05.

4. Sammanfattningar

Vår rapport ger en kemisk analys av mikrobiella isolat från en svampodlande termit. Tre nya cykliska tripeptider, natalenamider A–C (1–3), isolerades och karakteriserades strukturellt från odlingsbuljongen av den svampodlande termitassocierade Actinomadura sp. RB99 med hjälp av en LC-UV/MS-baserad dereplikeringsmetod. Alla de isolerade föreningarna utvärderades med avseende på biologiska aktiviteter med användning av cellbaserade analyser. Föreningarna 1 och 2 uppvisade svag cytotoxicitet mot HepG2- respektive HeLa/A549-celler. Ingen av de isolerade föreningarna visade signifikanta hämmande effekter på NO-produktion i LPS-stimulerade RAW264.7-celler. Förening 3 uppvisade signifikanta hämmande effekter på IBMX-medierad melaninsyntes på ett dosberoende sätt. Effekten liknade den hos kojinsyra, som används som ett kosmetiskt material med hudblekande effekter.

Erkännanden:

Vi är djupt tacksamma till Michael Thomas-Poulsen (Biologiska institutionen, Köpenhamns universitet, Danmark) för att han stödde vårt fältarbete.

Intressekonflikt:

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Referenser

1. Newman, DJ; Cragg, GM Naturliga produkter som källor till nya läkemedel från 1981 till 2014. J. Nat. Driva. 2016, 79, 629–661. [CrossRef] [PubMed]

2. Mishra, BB; Tiwari, VK Naturprodukter: En föränderlig roll i framtida läkemedelsupptäckt. Eur. J. Med. Chem. 2011, 46, 4769–4807. [CrossRef] [PubMed]

3. Beemelmanns, C.; Guo, H.; Rischer, M.; Poulsen, M. Naturliga produkter från mikrober associerade med insekter. Beilstein J. Org. Chem. 2016, 12, 314–327. [CrossRef] [PubMed]

4. Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Currie, CR; Clardy, J. Bakteriella symbionter i jordbrukssystem utgör en strategisk källa för upptäckt av antibiotika. J. Antibiot. 2014, 67, 53–58. [CrossRef] [PubMed]

5. Harvey, AL; Edrada-Ebel, R.; Quinn, RJ Återuppkomsten av naturliga produkter för läkemedelsupptäckt i genomiktiden. Nat. Rev. Drug Discov. 2015, 14, 111–129. [CrossRef] [PubMed]

6. Sattely, ES; Fischbachb, MA; Walsh, CT Total biosyntes: In vitro-rekonstitution av polyketid- och icke-ribosomala peptidvägar. Nat. Driva. Rep. 2008, 25, 757–793. [CrossRef] [PubMed]

7. Åh, D.; Scott, JJ; Currie, CR; Clardy, J. Mycangimycin, en polyenperoxid från en mutualist Streptomyces sp. Org. Lett. 2009, 11, 633–636. [CrossRef] [PubMed]

8. Sitt, CS; Ruzzini, AC; Van Arnam, EB; Ramadhar, TR; Currie, CR; Clardy, J. Variabla genetiska arkitekturer producerar praktiskt taget identiska molekyler i bakteriella symbionter av svampväxande myror. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, 13150–13154. [CrossRef] [PubMed]

9. Låg, KE; Ler, S.; Chen, KJ; Campbell, RL; Hickey, JL; Tan, J.; Scully, CCG; Davies, RL; Yudin, AK; Zaretsky, S. Rationell design av calpain-hämmare baserad på calpastatin-peptidomimetika. J. Med. Chem. 2016, 59, 5403–5415. [CrossRef] [PubMed]

10. Zheng, J.; Xu, Z.; Wang, Y.; Hong, K.; Liu, P.; Zhu, W. Cyclic Tripeptides från den halotoleranta svampen Aspergillus sclerotiorum PT06-1. J. Nat. Driva. 2010, 73, 1133–1137. [CrossRef] [PubMed]

11. Weerakkody, D.; Moshnikova, A.; El-Sayed, NS; Adochite, RC; Slaybaugh, G.; Golijanin, J.; Tiwari, RK; Andreev, OA; Parang, K.; Reshetnyak, YK Nya pH-känsliga cykliska peptider. Sci. Rep. 2016, 6, 31322. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhao, M.; Lin, HC; Tang, Y. Biosyntes av den -nitro-innehållande cykliska tripeptiden psykrofil. J. Antibiot. 2016, 69, 571–573. [CrossRef] [PubMed]

13. Zorzi, A.; Deyle, K.; Heinis, C. Cyklisk peptidterapi: dåtid, nutid och framtid. Curr. Opin. Chem. Biol. 2017, 38, 24–29. [CrossRef] [PubMed]

14. Kim, KH; Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Cao, S.; Poulsen, M.; Currie, CR; Clardy, J. Natalamycin A, ett ansamycin från en termitassocierad Streptomyces sp. Chem. Sci. 2014, 5, 4333–4338. [CrossRef] [PubMed]

15. Kang, HR; Lee, D.; Benndorf, R.; Jung, WH; Beemelmanns, C.; Kang, KS; Kim, KH Termisoflavones A–C, isoflavonoidglykosider från termitassocierade Streptomyces sp. RB1. J. Nat. Driva. 2016, 79, 3072–3078. [CrossRef] [PubMed]

16. Beemelmanns, C.; Ramadhar, TR; Kim, KH; Klassen, JL; Cao, S.; Wyche, TP; Hou, Y.; Poulsen, M.; Bugni, TS; Currie, CR; et al. Makrotermyciner A–D, glykosylerade makrolaktamer från en termitassocierad Amycolatopsis sp. M39. Org. Lett. 2017, 19, 1000–1003. [CrossRef] [PubMed]

17. Guo, H.; Benndorf, R.; Leichnitz, D.; Klassen, JL; Vollmers, J.; Görls, H.; Steinacker, M.; Weigel, C.; Dahse, HM; Kaster, AK; de Beer, ZW; et al. Isolering, biosyntes och kemiska modifieringar av rubteroloner A–F: Sällsynta tropolonalkaloider från Actinomadura sp. 5–2. Chem. Eur. J. 2017, 23, 9338–9345. [CrossRef] [PubMed]

18. Sano, S.; Ikai, K.; Katayama, K.; Takesako, K.; Nakamura, T.; Obayashi, A.; Ezure, Y.; Enomoto, H. OF4949, nya inhibitorer av aminopeptidas B. II. Belysning av struktur. J. Antibiot. 1986, 39, 1685–1696. [CrossRef] [PubMed]

19. Ciasullo, L.; Casapullo, A.; Cutignano, A.; Bifulco, G.; Debitus, C.; Hooper, J.; Gomez-Paloma, L.; Riccio, R. Renieramide, en cyklisk tripeptid från Vanuatu-svampen Reniera n. sp. J. Nat. Driva. 2002, 65, 407–410. [CrossRef] [PubMed]

20. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, GH Hypopigmenterande medel: En uppdaterad recension om biologiska, kemiska och kliniska aspekter. Pigm. Cell Melanoma Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

21. Visser, AA; Nobre, T.; Currie, CR; Aanen, DK; Poulsen, M. Utforska potentialen för aktinobakterier som defensiva symbionter i svampodlande termiter. Microb. Ecol. 2012, 63, 975–985. [CrossRef] [PubMed]

22. Hall, TA BioEdit: Ett användarvänligt redigeringsprogram och analysprogram för biologiska sekvenser för Windows 95/98/NT. Nukleinsyror Symp. Ser. 1999, 41, 95–98.

23. Pruesse, E.; Peplies, J.; Glöckner, FO SINA: Noggrann multipelsekvensjustering med hög genomströmning av ribosomala RNA-gener. Bioinformatik 2012, 28, 1823–1829. [CrossRef] [PubMed].

24. Saitou, N.; Nei, M. Grannsammanfogningsmetoden: En ny metod för att rekonstruera fylogenetiska träd. Mol. Biol. Evol. 1987, 4, 406-425. [PubMed]

25. Felsenstein, J. Evolutionära träd från DNA-sekvenser: A maximum likelihood approach. J. Mol. Evol. 1981, 17, 368-376. [CrossRef] [PubMed]

26. Kumar, S.; Stecher, G.; Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 för större datamängder. Mol. Biol. Evol. 2016, 33, 1870–1874. [CrossRef] [PubMed]

27. Tamura, K.; Nei, M. Uppskattning av antalet nukleotidsubstitutioner i kontrollregionen av mitokondrie-DNA hos människor och schimpanser. Mol. Biol. Evol. 1993, 10, 512-526. [PubMed]

28. Felsenstein, J. Confidens limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 1985, 39, 783–791. [CrossRef] [PubMed]

Exempeltillgänglighet:

Prover av föreningarna är inte tillgängliga från författarna.

For more information:1950477648nn@gmail.com