Isolering och kvantifiering av Ginsenoside Rh23, en ny anti-melanogen förening från bladen av Panax Ginseng

Abstrakt:

En ny ginsenosid, som heter ginsenoside Rh23 (1), och 20-O- -D-glukopyranosyl-3 ,6 , 12 ,20 ,25-pentahydroxydammar-23-en (2) isolerades från bladen av hydroponisk Panax ginseng. Föreningar isolerades genom olika kolonnkromatografi och deras strukturer bestämdes baserat på spektroskopiska metoder, inklusive högupplöst kvadrupol/flygtid masspektrometri (HR-QTOF/MS), kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi och infraröd (IR) spektroskopi . För att bestämma anti-melanogen aktivitet testades förändringen i melaninhalten i Melan-a-celler behandlade med identifierade föreningar.

Dessutom undersökte vi de melaninhämmande effekterna av ginsenoside Rh23 på pigmentering i en zebrafisk in vivo-modell. Förening 1 hämmade potent melanogenes i melan-a-celler med 37,0 procent melanogenesinhibering vid 80 µM och visade även hämning på kroppspigmenteringen i zebrafiskmodellen. Även om förening 2 visade något lägre hämmande aktivitet än förening 1, visade den också signifikant minskad melanogenes i Melan-a-celler och zebrafiskmodellen. Dessa resultat indikerade att föreningar isolerade från hydroponisk P. ginseng kan användas som nya hudblekande föreningar genom in vitro- och in vivo-systemen. Dessutom visade denna studie användbarheten av MS-baserad förening 1 för kvantitativ analys. Ginsenoside Rh23 (1) hittades i en nivå av 0,31 mg/g i blad av hydroponisk P. ginseng.

För melanin fann vi att Cistanche avsevärt kan nedreglera aktiviteten av tyrosinas, som är det huvudsakliga hastighetsbegränsande enzymet i biosyntesen av hudmelanin och är ett komplex av koppar och protein. Det kan hydroxylera tyrosin, det huvudsakliga råmaterialet för melaninproduktion i kroppen, för att producera L-dopa och sedan oxidera dopa till dopakinon. Dopakinon genomgår en rad metaboliska processer, omarrangeras och polymeriserar, och slutligen kombineras med Proteiner kombineras för att producera en serie melaninpigment som orsakar brunfärgning. Melanin är den viktigaste faktorn för att bestämma hudfärgen på människokroppen. Överdriven syntes kan orsaka bildandet av pigmenterade hudsjukdomar som fräknar, kloasma, åldersfläckar och melanom. Därför, genom forskningen om hämning av tyrosinasaktivitet, kan de effektiva ingredienserna för att hämma hudpigmentering sållas bort, så det kan ses att de totala glykosiderna av Cistanche deserticola har effekten att hämma hudpigmentering och blekande skönhet.

Klicka cistanche doseringsprodukt

Nyckelord:

ginsenosid Rh23; Panax ginseng; NMR; UPLC-QTOF/MS; zebrafisk; kvantitativ analys.

1. Introduktion

Panax ginseng CA Meyer är en mycket känd traditionell medicinsk ört i asiatiska länder. Panax härstammar från ett "universalmedel", vilket betyder ett botemedel mot sjukdomar. P. ginseng är en flerårig örtväxt som tillhör familjen Araliaceae [1]. Fyra till sex år gamla rötter av P. ginseng används främst för terapeutiska ändamål. Blommor blommar i juni, och bladen har en gomform. P. ginseng har huvudsakligen odlats i Östasien, inklusive Korea, Kina och Japan [2]. Hittills har många studier rapporterats om de kemiska beståndsdelarna i ginsengrötter, löv och bär; mer än 100 sorters ginsenosider har isolerats. Olika bioaktiviteter av P. ginseng rapporterades, såsom förbättring av immunmodulerande aktivitet, näringsberikande, förbättringar av leverfunktion, anti-diabetes, anti-cancer, anti-apoptotiska och antioxidanta aktiviteter [3-10].

För närvarande ökar gradvis intresset för välmåenderelaterade jordbruksprodukter av hög kvalitet, vilket leder till hydroponisk odling av ginseng. Hydroponisk odling har fördelarna med en enkel odlingsprocess och en kortare växtperiod än jordbearbetning. Hydroponisk ginseng behöver bara 2–4 ​​månader i ett system som kontrollerar temperaturen, är fritt från bekämpningsmedel, fuktigt, lätt, har ekologiska ingredienser etc. [11]. Bladen av jordodlingsginseng används inte för medicinska ändamål och funktionella grönsaker, medan bladen av hydroponisk ginseng kan användas.

In a previous study, the contents and composition of ginsenosides in different parts, such as leaves, roots, and fruits of ginseng, were investigated after a short-term hydroponic system [12]. The total ginsenoside content of the ginseng leaves was found to be significantly higher at 15.30%, while the content of the ginseng roots was at 1.27%. Additionally, the contents of the major ginsenosides components produced in the ginseng leave cultured in the hydroponic system were observed in the order of Rg1 > Rd > Re > Rc > Rb2 > Rg2 >Rbl > Rhl > Rf [11]. Sammanfattningsvis ledde hydroponiska tillstånd till högt ginsenosidinnehåll, och det totala ginsenosidinnehållet i bladen var betydligt högre än i rötter, vilket tyder på att ginsengblad kan vara en bra källa till funktionella grönsaker och medicinska örter.

Flera kända blekningsföreningar, såsom arbutin och kojinsyra, har undersökts för deras effektivitet för att minska melanogenes [13]. Tyvärr är det nödvändigt att hitta säkrare och mer effektiva hudblekande medel, på grund av kojinsyrans cancerframkallande potential och både säkerheten och biverkningarna av arbutin [14]. Därmed har en stor uppmärksamhet kontinuerligt undersökts utveckling av nya naturprodukter inom kosmetikaindustrin [15,16]. Flera studier har rapporterat hämning av melaninsyntes från P. ginseng odlad i jord [17–20].

Dessa studier rapporterades dock med välkända föreningar, såsom kanelsyra och fenolföreningar, och blekningsaktivitet har inte rapporterats från bladen av hydroponisk P. ginseng (HPGL). Vårt pågående arbete ledde till isoleringen av mindre ginsenosider från HPGL. Vanligtvis kan ginsenosider i mindre mängder eller spårmängder inte detekteras med HPLC. Annars är analystiden mycket lång, vilket inte är lämpligt för att kvalificera ginsenosider i ginsengkryddor [21,22]. För att snabbt kvantifiera nya föreningar bör en snabb och känslig metod, som noggrant kan detektera spårmängder av nya föreningar, upprättas. I den aktuella studien etablerades en känslig ultrahögpresterande vätskekromatografi i kombination med kvadrupol/flygtid masspektrometri (UPLC-QTOF-MS) metod för att kvantifiera den nya föreningen.

Baserat på ovanstående beskrivning, i detta arbete, avslöjades isolering och identifiering av en ny förening, inklusive fysikaliska egenskaper och kvantifiering, med spektroskopiska metoder, och deras anti-melanogena aktiviteter undersöktes genom in vitro och in vivo system.

2. Resultat och diskussion

Blad av hydroponisk Panax ginseng (HPGL) extraherades med vattenhaltig MeOH och fördelades i etylacetat (EtOAc), n-butanol (n-BuOH) respektive H2O-fraktioner. Upprepade SiO2- och ODS-kolonnkromatografier av n-BuOH-fraktionen gav en ny ginsenosid (1), och en sällsynt ginsenosid (2) isolerades från EtOAc-fraktionen av HPGL.

Förening 1, vitt pulver (metanol), visade en lila färg på TLC, genom att spruta 10 procent H2SO4 och värma. Molekylformeln bestämdes vara C37H64O10 från den kvasimolekylära jontoppen m/z 713,44723 [M plus COOH]− i negativ QTOF/MS. IR-spektrum antydde närvaron av en hydroxylgrupp (3377 cm−1) och en dubbelbindning (1647 cm−1). 1H-NMR-spektrumet (tabell 1 och tilläggsmaterial) visade två olefinmetinprotonsignaler (δH 6,02, 5,64), tre syresatta metinprotonsignaler (δH 4,38, 4,03, 3,49), en metoxiprotonsignal (δH 3) och åtta. singlettmetylprotonsignaler (δH 1,94, 1,55, 1,43, 1,33, 1,31, 1,14, 1,04, 0,92), vilket indikerar att förening 1 har en tetracyklisk triterpendel innefattande en dubbelbindning med transkonformation och tre hydroxylgrupper.

Dessutom bekräftas förening 1 vara en protopanaxatriol (PPT)-typ från det kemiska skiftet av en metylprotonsignal vid δH 1,94 (H-28). Det kemiska skiftet av H-28 i protopanaxadiol (PPD)-typ observeras vanligtvis vid ca δH 1,30 [23]. Dessutom observerades en hemiacetalprotonsignal (δH 5,15), och flera syresatta metiner och metylenprotonsignaler vid δH 4,45–3,95 som signalerna för en sockerdel. Från kopplingskonstanten för anomerprotonsignalen (J=7.6 Hz), var både hemiacetalprotonen och H-2 av sockerdelen i ett axiellt arrangemang. Kombinationen av ovan nämnda data drog slutsatsen att förening 1 var en protopanaxatriolaminoglykosid. 13C-NMR-spektrumet uppvisade 37 kolsignaler på grund av triterpen-, metoxi- och hexosgrupper. Två olefinmetinkol (δC 138,5 (C-24), 126,8 (C-23)), ett syresatt kvaternärt kol (δC 74,9 (C-25)), tre syresatta metinkol (δC) 78,5 (C-3), 7{{90}},3 (C-12), 67,7 (C-6)), ett metoxikol (δC 50,2 ( 25-OCH3)), och åtta metylkol (δC 31,9 (C-28), 26,3 (C-27), 26,1 (C-26), 23,0 (C{{ 57}}), 17,6 (C-18), 17,4 (C-19), 17,3 (C-30), 16,4 (C-29)) signaler observerades för aglykondel. NMR-data för förening 1 liknade de för förening 2, förutom det kemiska skiftet för ett syresatt kvaternärt kol, dvs C-25. Dessutom identifierades sockret som en -glukopyranos från kolsignalerna hemiacetal (δC 98,3, (C-10)), fyra syresatta metiner (δC 78,9 (C-30), 78,2 (C{{82) }}), 75,2 (C-20), 71,6 (C-40)), och en syresatt metylen (δC 63,0 (C-60)). I spektra för gradient heteronukleär multipelbindningskorrelation (gHMBC) observerades en långdistanskorrelation mellan den anomera protonsignalen (δH 5.15 (H-10)) och den syresatta kvaternära kolsignalen för aglykonet (δC 83.0 (C) -20)), vilket indikerar att -glukopyranos var kopplad till hydroxylen av C-20 (Figur 1).

Dessutom indikerade korrelationen mellan metoxiprotonsignalen (δH 3,18 (25-OCH3)) och den syresatta kvaternära kolsignalen (δc 74,9 (C-25)) att metoxin var kopplad till C{{ 7}} (Figur 1). Baserat på ovanstående data bestämdes den kemiska strukturen för 1 till 20-O- -D-glukopyranosyl-3 ,6 ,12 ,20 -tetrahydroxi-25- metoxydammar-23-en och namngiven som ginsenoside Rh23. Förening 2 identifierades vara 20-O- -D-glukopyranosyl-3 ,6 ,12 ,20,25- pentahydroxydammar-23-en från jämförelser av NMR och MS-data med de som rapporterats i litteraturen [23,24] (Figur 1). Föreningarna 1 och 2 isolerades för första gången från HPGL.

Renheten hos ginsenosid Rh23 fastställdes till mer än 99 procent genom normaliseringen av toppareorna detekterade med UPLC-analys. Eftersom UPLC-OTOF/MS har visat sig vara ett lämpligt verktyg för identifiering av ginsenosid Rh23, utfördes separationen av beståndsdelar i HPGL-extrakt av UPLC-OTOF/MS i negativt jonläge. Figur 2 visar ett typiskt totaljonkromatogram (TIC) av ginsenosid Rh23 och extrakt med massdetektion.

En linjär kalibreringskurva erhölls för ginsenosid Rh23 vid olika koncentrationsnivåer. Karakteristiken för kalibreringsdiagrammen är sammanfattade i tabell 2. Som framgår av tabellen visar ginsenosid Rh23 utmärkta korrelationskoefficienter. Detektorantal (relativ topparea) var linjärt beroende av provkoncentrationen inom intervallet 0.02–0,8 µg/ml för ginsenosid Rh23. LOD för ginsenoside Rh23 var 0.002 ppm. LOQ för ginsenosid Rh23 bestämdes till 0,005 ppm med UPLC-QTOF/MS i negativ jonläge. Mängden ginsenosid Rh23 i HPGL erhållen med användning av valideringsmetoder (tabell 2) var 0,319 mg/g.

För att bestämma anti-melanogen aktivitet studerades förändringen i melaninhalten i melan-a-celler behandlade med renade och identifierade föreningar. Melan-a-celler behandlades i 72 timmar med föreningarna 1 och 2 i koncentrationer från 0 till 80 µM, och cellviabiliteten utvärderades via ett CCK-8-cellviabilitetsanalyskit. Cellviabiliteten för föreningarna 1 och 2 vid 80 µM koncentration för melan-a-cell var över 98,1 procent respektive 97,8 procent (data visas ej). Dessa resultat indikerade att föreningarna 1 och 2 har en icke-cytotoxisk natur. Effekten av föreningarnas anti-melanogena aktiviteter visas i figur 3. Inhiberingen av melaninsyntesen av förening 1 vid 20, 40 och 80 µM var 8,4 procent, 15,6 procent och 37,0 procent jämfört med kontrollen. Förening 2 visade något lägre hämmande aktivitet än förening 1 vid 7,6 procent, 12,8 procent och 17,8 procent vid 20, 40 respektive 80 µM. Båda föreningarna hämmade melaninsyntesen på ett dosberoende sätt.

Noterbart visade förening 1 den högsta melaninhämmande aktiviteten, 37,0 procent vid 80 µM koncentration. Enligt uppgift uppvisade extraktet av radix ginseng vid 0–1000 µg/mL ingen signifikant hämning av melanin [19], och kanelsyra, ett vitmedel som huvudsakligen finns i P. ginseng, visade 29 procent hämning av melaninsyntesen vid 675 µM [20]. Jämfört med extraktet av radix ginseng och kanelsyra, visade förening 1 en kraftig hämmande aktivitet av melaninsyntesen och visade till och med en 1,2- gånger högre hämmande aktivitet av melaninsyntes vid en åtta gånger lägre koncentration jämfört med kumarsyra [ 17,20].

Zebrafisken är en mycket fördelaktig modellorganism för ryggradsdjur på grund av dess organsystem och gensekvenser som liknar människor [25]. Dessutom får användningen av zebrafiskembryon ökad uppmärksamhet eftersom de anses vara en ersättningsmetod för djurförsök [26]. Zebrafiskar har melaninpigment på ytan, vilket möjliggör enkel observation av pigmenteringsprocessen utan komplicerade experimentella procedurer [27].

Således undersökte vi de melanin-hämmande effekterna av förening 1 på pigmenteringen av zebrafisk. Vi använde PTU (N-fenyltiourea; en svavelinnehållande tyrosinashämmare) som en positiv kontroll (Figur 4B), som används flitigt i zebrafiskforskning [28,29]. Som visas i figur 4C, producerade D, 40 och 80 µM behandling med förening 1 en anmärkningsvärd hämning av zebrafiskens kroppspigmentering, vilket anmärkningsvärt minskade det totala melanininnehållet jämfört med kontrollvehikeln (Figur 4A).

I denna studie isolerade vi ny ginsenoside Rh23 (1) från hydroponiska P. ginseng-blad. Så långt mer än 100 ginsenosider har rapporterats från ginsengarter. Men 25-hydroxylatedginsenosider förekommer sällan i naturen, inklusive i ginsengväxter. Dessutom hade inte blekningsaktivitet rapporterats. Den hämmande aktiviteten av ginsenosid Rh23 visade 37 procent vid 80 uNkoncentrationen utan cellcytotoxicitet i melan-a-celler, medan ingen hämning av in vitro svamptyrosinasaktivitet observerades av ginsenosid Rh23 (data visas inte). Nyligen har extrakten eller renade ginsenosider från ginsengrötter och blad visat sig ha antioxidantegenskaper (30,31), medan vatten eller organiskt extrakt av ginseng har uppvisat rensande aktiviteter mot DPPH, superoxidanjon och hydroxylradikal (32). Därför kan vår nya ginsenoside Rh23 isolerad från bladen av hydroponisk P. ginseng ha nedreglerat tyrosinas genom sin antioxidativa egenskap. Dess melanogenes roll har dock inte undersökts ännu. Därför är det i ytterligare studier nödvändigt att bestämma de exakta mekanismerna för ginsenosid Rh23-verkan på regleringen av melaninsyntesen.

3. Experimentell

3.1. Allmän

Kieselgel 60 och LiChroprep RP-18 hartser användes för kolonnkromatografi (Merck, Darmstadt, Tyskland). Kieselgel 60 F254 (Merck) och RP-18 F254S (Merck) användes som fasta faser för TLC-experiment. Detektion av fläckar på TLC-plattan utfördes genom observation under en UV-lampa (Spectroline, modell ENF-240 C/F, Spectronics Corp., New York, NY, USA) eller genom att spruta 10 procent vattenhaltig H2SO4 på den utvecklade plattan följt av uppvärmning. Optiska rotationer mättes med en JASCO P{10}} digital polarimeter (Tokyo, Japan). Smältpunkter erhölls med användning av en Fisher-Johns Melting Point Apparatus (Fisher scientific company, Pittsburgh, PA, USA) med ett mikroskop. Ultravioletta spektra mättes på en Shimadzu modell UV-1601 spektrofotometer (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan). IR-spektra erhölls från en Perkin Elmer Spectrum One FT-IR-spektrometer (Buckinghamshire, UK). NMR-spektra registrerades på en Varian Inova AS 400-spektrometer (400 MHz, Varian, Palo Alto, CA, USA). UPLC-QTOF/MS-analys utfördes med användning av en Waters Xevo G2-S-serie (Waters Corp., Milford, MA, USA) som arbetade i negativ jonläge.

3.2. Växtmaterial

Hydroponisk Panax ginseng odlades i växthuset av Department of Herbal Crop Research i Eumseong, Chungbuk-provinsen enligt protokollet för "ginseng GAP standard odlingsguide" [11,33] utvecklad av Rural Development Administration, Republiken Korea. Ett år gamla ginsengfröplantor som vägde 0,8 till 1 g köptes från Department of Herbal Crop Research, National Institute of Horticultural and Herbal Science (NIHHS), Rural Development Administration (RDA) och lagrades i en kammaren vid låg temperatur (1–2 ◦C) före användning. Ginsengplantornas rötter transplanterades till näringsbad och odlades i det hydroponiska systemet. Efter tre månaders odling drogs de hydroponiska ginsengerna ut för skörd. De skördade hydroponiska ginsengplantorna tvättades rena från damm med vatten och sorterades i löv och rötter, som sedan torkades i 72 timmar i en frystork (FD8512, Ilshin Biobase Co., Yangju, Korea). Ett kupongprov (NIHHS14-03) deponerades i herbariet vid Department of Herbal Crop Research, NIHHS, RDA, Eumseong, Republiken Korea.

3.3. Extraktion och isolering

De torkade och pulveriserade bladen av hydroponisk P. ginseng (HPGL, 6 kg) extraherades med 80 procent MeOH (30 L × 3) vid rumstemperatur under 24 timmar. Extrakten filtrerades genom filterpapper och indunstades under reducerat tryck vid 45 ◦C för att ge 1,4 kg extrakt. Extraktet hälldes i H2O (3 L) och extraherades med EtOAc (3 L × 3) och n-BuOH (2,6 L × 3), i tur och ordning. Varje skikt koncentrerades under reducerat tryck för att erhålla EtOAc (75 g), n-BuOH (470 g) och H2O (855 g) fraktioner.

n-BuOH-fraktionen (HPGLB, 130 g) applicerades på silikagelkolonnen (φ 13 × 17 cm) och eluerades med CHCl3–MeOH–H2O (8:3:1, 9{{42} } L → 6:4:1, 110 L) för att ge 20 fraktioner (HPGLB1 till HPGLB20). Fraktioner HPGLB3 och HPGLB4 kombinerades (18,9 g, Ve/Vt=0.05–0.12) och fraktionerades ytterligare över silikagelkolonnen (φ 8 × 15 cm, CHCl3–MeOH–H2O=12:3:1, 14 L) för att ge 14 fraktioner (HPGLB3-1 till HPGLB3-14). Fraktioner HPGLB3-4 och HPGLB3-5 kombinerades (1,27 g, Ve/Vt {{40}}.09–0.16) och fraktionerades ytterligare över ODS-kolumnen (φ 4 × 7 cm, MeOH–H2O=2:1, 2,6 L) för att ge nio fraktioner (HPGLB3-4-1 till HPGLB3-4-9). Fraktion HPGLB3-4-3 (119,4 mg, Ve/Vt=0.14–0.26) fraktionerades ytterligare över ODS-kolonnen (φ 2,5 × 7 cm, MeOH–H2O=1:1, 1 L) för att ge nio fraktioner (HPGLB3-4-3-1 till HPGLB3-4-3-9) inklusive förening 1 (HPGLB3-4-3-7, 10,5 mg, Ve/Vt=0.42–0.55, TLC Rf=0.40 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0.50 (Kieselgel 60 F254, CHCl3–MeOH–H2O {{90} }:3:1)). Fraktioner HPGLB5 till HPGLB7 kombinerades (24,0 g, Ve/Vt=0.12–0,22) och fraktionerades ytterligare över silikagelkolonnen (φ 7 × 12 cm, CHCl3–MeOH–H2O=10: 3:1, 10 L → 6:4:1, 9 L) för att ge 16 fraktioner (HPGLB5-1 till HPGLB5-16). Fraktion HPGLB5-6 (323,1 mg, Ve/Vt=0,28–0,31) fraktionerades ytterligare över ODS-kolonnen (φ 3 × 14 cm, MeOH–H2O=3:2, 1,2 L → 3:1, 1,5 L) för att ge tio fraktioner (HPGLB5-6-1 till HPGLB5-6-10) inklusive förening 2 (HPGLB5-6-5, 10,1 mg, Ve/Vt=0 .21–0.23, TLC Rf=0.50 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0.45 (Kieselgel 60 F254, CHCl3– MeOH–H2O=7:3:1)).

3.4. Spektroskopiska data

Förening 1. Vitt pulver, smp: 138–140 ◦C; []25D plus 17,4◦ (c=0.39, MeOH); IR (CaF2-fönster): 3377, 2932, 1382 cm-1; negativ QTOF/MS m/z 713,44723 [M plus COOH]- (beräknat för C37H64O10, 668,4499); 1H- och 13C-NMR-data, se tabell 1.

Förening 2. Vitt pulver, smp: 133–136 ◦C; []25D plus 20,2◦ (c=0.50, MeOH); IR (CaF2-fönster): 3359, 2929, 1384 cm-1; negativ QTOF/MS m/z 699,48311 [M plus COOH]- (beräknat för C36H62O10, 654,4323);1H- och 13C-NMR-data, se tabell 1.

3.5. Kvantitativ analys av ny förening 1 med användning av UPLC-QTOF/MS

En standardstamlösning av förening 1 framställdes genom att lösa 1,00 mg vardera i 1 ml metanol för att ge en koncentration av 1,00 mg/ml och hölls vid 4 ◦C. Standardstamlösningen (1) späddes med metanol för att erhålla kalibreringslösningar med intervallen 0.{{10}}2–0,8 µg/ml, respektive. Ett gram HPGL-extrakt vägdes noggrant och löstes upp i fasta volymer (10 mL) metanol, filtrerades genom ett 0.20 mm filterpapper och kyldes vid 4 ◦C . UPLC utfördes med användning av en Waters ACQUITY H-klass UPLC (Waters Corp., Milford, MA, USA) med en ACQUITY BEH C18-kolonn (2,1 x 100 mm, 1,7 µm). De mobila faserna bestod av vatten (A) med 0,1 procent myrsyra (v/v) och acetonitril (B) med 0,1 procent myrsyra (v/v). Elueringsgradienten var som följer: 0–4 min, B 10–30 procent; 4–15 min, B 30–60 procent ; 15–16 min, B 60–100 procent ; 16–19 min, B 100–10 procent . Flödeshastigheten var 0,45 ml/min och injektionsvolymen var 2 µL för varje körning.

Därefter utfördes HR-MS-analys med användning av en Waters Xevo G2-S QTOF MS (Waters Corp., Milford, MA, USA) som arbetade i negativ jonläge. Masspektrometrarna utförde alternerande hög- och lågenergiskanningar som kallas MSE-insamlingsläge. Noggranna massmätningar erhölls med användning av ett automatiserat kalibreringssystem innehållande Leucin-enkefalin, m/z 554.262 (ESI neg.-läge) som en intern referens. Optimala driftsparametrar ställdes in enligt tabell 3.

3.6. Cell kultur

Melan-a-melanocyter är en högpigmenterad, immortaliserad, en normal murin melanocytcellinje som härrör från C57BL/6-möss. Melan-a-cellerna som användes i denna studie erhölls från Dr. Dorothy Bennett (St. George's Hospital, London, Storbritannien). Celler odlades vid 37 ◦C i en atmosfär av 95 procent luft, 10 procent CO2 i RPMI 1640-medium kompletterat till en slutlig koncentration med 10 procent värmeinaktiverat fetalt bovint serum, 1 procent penicillin/streptomycin och 200 nM PMA. Cellviabiliteten bestämdes med CCK-8 cellräkningskit-8 (Dojindo Lab., Kumamoto, Japan).

3.7. Melaninanalys

Melan-a-celler behandlades med föreningar i 72 timmar och sedan löstes cellerna i 1 N NaOH vid 60 ◦C under 30 min. Därefter mättes lysaten vid 450 nm med användning av en spektrofotometer. Data normaliserades till proteininnehållet i cellysaten. Cellysaten bearbetades därefter för bestämning av proteinkoncentrationen med användning av ett BCA-proteinanalyskit (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA).

3.8. Ursprung och underhåll av föräldrafisk

Vuxna zebrafiskar erhölls från en kommersiell återförsäljare och 10–15 fiskar hölls i en 5 L akryltank med följande villkor: 28,5 ◦C, med en 14/10 timmars ljus/mörkercykel. Zebrafiskar matades tre gånger om dagen, sex dagar i veckan, med TetraMin flingfoder kompletterat med levande artemia salina. Embryon erhölls från naturlig lek som inducerades på morgonen genom att tända ljuset. Insamlingen av embryon slutfördes inom 30 minuter. Alla experimentella protokoll och procedurer godkändes och genomfördes enligt de godkända riktlinjerna och föreskrifterna från Animal Ethics Committee of Chungnam National University (CNU-00866).

3.9. Behandling av föreningar och fenotypbaserad utvärdering

Synkroniserade embryon samlades in och arrangerades med pipett (7–9 embryon per brunn i 24-brunnsplattor innehållande 1 mL embryomedium). Testföreningar löstes i 0,1 procent DMSO och sattes sedan till embryomediet från nio till 72 timmar efter befruktning (hpf) (63 timmars exponering). Effekterna på pigmenteringen av zebrafisk observerades under stereomikroskopet. Tillfällig omrörning, såväl som ett utbyte av mediet, utfördes dagligen för att säkerställa en jämn fördelning av föreningarna. I alla experiment användes 0.2 mM 1-fenyl-2-tiourea (PTU) för att generera transparent zebrafisk utan att störa utvecklingsprocessen [33] och ansågs vara en positiv standardkontroll. Fenotypbaserade utvärderingar av kroppspigmentering dekorionerades med pincett, bedövades i trikainmetansulfonatlösning (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), monterade i 3 procent metylcellulosa på en 35 mm skål (SPL Lifesciences, Pocheon, Korea), och fotograferad under stereomikroskopet MZ16 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Tyskland).

4. Sammanfattningar

I denna studie isolerades ginsenosid Rh23 (1) från hydrofoniska Panax ginsengblad tillsammans med 20-O- -D-glukopyranosyl-3 ,6 ,12 ,20 ,25- pentahydroxydammar-23-en (2). Vi har generellt varit framgångsrika i vårt försök att få den hypopigmentära effekten av föreningar från hydroponisk P. ginseng. Ginsenosid Rh23 och 20-O- -D-glukopyranosyl-3 ,6 ,12 ,20,25-pentahydroxydammar23-en har hämmande aktiviteter på melaninbiosyntesen utan cytotoxiska effekter i melan-a-cell. Dessutom förbättrade ginsenoside Rh23 depigmenteringen av zebrafisken som en alternativ djurmodell. Minskningen av melaninhalt och pigmentering i kroppen kan ha potential för blekningsaktivitet och den icke-cytotoxiska effekten är den mer gynnsamma punkten eftersom säkerheten är en primär faktor för blekningsmedel i kosmetiska produkter.

Baserat på våra nuvarande resultat är det därför viktigt att nya hydrofoniska P. ginseng-föreningar kan användas som ett potentiellt effektivt hudbelysningsmedel. Ytterligare studier kommer att belysa de exakta mekanismerna för ginsenosid Rh23-verkan på regleringen av melaninsyntesen och förhållandet mellan strukturella egenskaper hos ginsenosid Rh23 och melanogenes, för att fastställa om det är ett potentiellt blekningsmedel för den kosmetiska industrin. Fördelarna med hybrid Q-TOF-masspektrometri inkluderar inte bara kvalitetsdetekteringsförmåga och känslighet, utan också noggrann mätning, vilket gör strukturella förklaringar enklare. Den kan användas för kvalitativ och kvantitativ bestämning av mindre eller nya föreningar, vilket hjälper till att förbättra kvalitetskontrollen av ginsengkryddor.

Tilläggsmaterial:

1H-NMR- och 13C-NMR-spektra på 1 är tillgängliga i tilläggsmaterialet.

Erkännanden:

Detta arbete utfördes med stöd av "Cooperative Research Program for Agriculture Science and Technology Development" (PJ01136203), Rural Development Administration, Republiken Korea. Vi tackar Cheol-Hee Kim (Chungnam National University) för att de delar zebrafiskanläggningen.

Författarbidrag:

DYL och N.-IB utformade och designade experimenten; H.-GK och Y.-GL isolerade föreningarna; DYL klargjorde strukturerna; I.-BJ bidrog till beredningen av växtmaterial; JHK genomförde den biologiska analysen och hjälpte till med förberedelsen av manuskriptet; JWL och B.-RC utförde NMR och UPLC-QTOF/MS för proverna; G.-SK bistod vid revisionen av manuskriptet; och DYL skrev uppsatsen och ledde forskningsprojektet. Alla författare läste och godkände det slutliga manuskriptet.

Intressekonflikt:

Författarna förklarar inga intressekonflikter. De grundande sponsorerna hade ingen roll i utformningen av studien; insamling, analyser eller tolkning av data; skrivande av manuskriptet; eller beslutet att publicera resultaten.

Referenser

1. Ben, EW; Michael, W. Läkeväxter i världen. I Shinilbooks; Timber Press Inc.: Portland, OR, USA, 2007.

2. Park, JD; Rhee, DK; Lee, YH Biologiska aktiviteter och kemi av saponiner från Panax ginseng CA Meyer. Phytochemistry 2005, 4, 159–175. [CrossRef]

3. Kwon, SJ; Chung, DK Den immunförstärkande effekten av bergsklänningsginseng, bergsodlad ginseng och Panax ginseng. J. Orient. Neuropsykiatri 2004, 15, 89–101.

4. Gillis, CN Panax ginsengfarmakologi: En kväveoxidlänk? Biochem. Pharmacol. 1997, 54, 1–8. [CrossRef]

5. Kang, KS; Yamabe, N.; Kim, HY; Yokozawa, T. Effekt av solginseng-metanolextrakt på lipopolysackarid-inducerad leverskada hos råttor. Phytomedicine 2007, 14, 840–845. [CrossRef] [PubMed]

6. Jiang, S.; Ren, D.; Li, J.; Yuan, G.; Li, H.; Xu, G.; Han, X.; Du, P.; An, L. Effekter av förening K på hyperglykemi och insulinresistens hos råttor med typ 2-diabetes mellitus. Fioterapia 2014, 95, 58–64. [CrossRef] [PubMed]

7. Kim, HS; Lee, EH; Ko, SR; Choi, KJ; Park, JH; Im, DS Effekter av ginsenoside Rg3 och Rh2 på proliferationen av prostatacancerceller. Båge. Pharm. Res. 2004, 27, 429–435. [CrossRef] [PubMed]

8. Nocerino, E.; Amato, M.; Izzo, AA Ginsengs afrodisiakum och adaptogena egenskaper. Fitoterapia 2000, 71, S1–S5. [CrossRef]

9. Keum, YS; Park, KK; Lee, JM; Chun, KS; Park, JH; Lee, SK; Kwon, HJ; Surh, YJ Antioxidant och antitumörfrämjande aktiviteter av metanolextraktet av värmebearbetad ginseng. Cancer Lett. 2000, 150, 41–48. [CrossRef]

10. Kim, GS; Lee, SE; Nej, HJ; Kwon, H.; Lee, SW; Kim, SY; Kim, YB Effekter av naturliga bioaktiva produkter på tillväxten och ginsenosidinnehållet i Panax ginseng odlad i ett aeroponiskt system. J. Ginseng Res. 2012, 36, 430–441. [CrossRef] [PubMed]

11. Choi, SY; Cho, CW; Lee, YM; Kim, SS; Lee, SH; Kim, KT Jämförelse av ginsenosid- och fenolingrediensinnehåll i hydroponiskt odlade ginsengblad, frukter och rötter. J. Ginseng Res. 2012, 36, 425–429. [CrossRef] [PubMed]

12. Matsuda, H.; Nakamura, S.; Kubo, M. Studier av nagelbandsläkemedel från naturliga källor. II. Hämmande effekter av Prunus-växter på melaninbiosyntesen. Biol. Pharm. Tjur. 1994, 17, 1417–1420. [CrossRef] [PubMed]

13. Duncan, CL; Foster, EM Effekt av natriumnitrit, natriumklorid och natriumnitrat på groning och utväxt av anaeroba sporer. Appl. Microbiol. 1968, 16, 406–411. [PubMed]

14. Shimizu, K.; Yasutake, S.; Kondo, R. En ny stilben med tyrosinashämmande aktivitet från Chlorophora utmärker sig. Chem. Pharm. Tjur. 2003, 51, 318–319. [CrossRef] [PubMed]

15. Park, SH; Kim, DS; Kim, WG; Ryoo, IJ; Lee, DH; Va, CH; Youn, SW; Yoo, ID; Park, KC Terrin: En ny melanogeneshämmare och dess mekanism. Cell. Mol. Livet 2004, 61, 2878–2885. [CrossRef] [PubMed]

16. Kong, YH; Jo, YO; Cho, CW; Son, DW; Park, SJ; Rho, JH; Choi, SY Hämmande effekter av kanelsyra på melaninbiosyntesen i huden. Biol. Pharm. Tjur. 2008, 31, 946–948. [CrossRef] [PubMed]

17. Hwang, EY; Choi, SY Kvantitativ analys av fenolföreningar i olika delar av Panax ginseng CA Meyer och dess hämmande effekt på melaninbiosyntesen. Koreanska J. Med. Crop Sci. 2006, 14, 148–152.

18. Im, SJ; Kim, KN; Yun, YG; Lee, JC; Mun, YJ; Kim, JH; Woo, WH Effekt av radix ginseng och radix trichosanthis på melanogenesen. Biol. Pharm. Tjur. 2003, 26, 849–853. [CrossRef] [PubMed]

19. Hwang, EY; Kong, YH; Lee, YC; Kim, YC; Yoo, KM; Jo, YO Jämförelse av innehållet av fenolföreningar mellan vit och röd ginseng och deras hämmande effekt på melaninbiosyntesen. J. Ginseng Res. 2006, 30, 82–87.

20. Zhang, YC; Pi, ZF; Liu, CM; Song, FR; Liu, ZQ; Liu, SY Analys av lågpolära ginsenosider i ångad Panax ginseng vid hög temperatur med HPLC-ESI-MS/MS. Chem. Res. Haka. Univ. 2012, 28, 31–36.

21. Xie, YY; Luo, D.; Cheng, YJ; Ma, JF; Wang, YM; Liang, QL; Luo, GA Ångframkallade kemiska omvandlingar och holistisk kvalitetsbedömning av röd ginseng härledd från Panax ginseng med hjälp av HPLC-ESI-MS/MSn-baserad flerkomponentkvantifieringsfingeravtryck. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 8213–8224. [CrossRef] [PubMed]

22. Liu, GY; Li, XW; Wang, NB; Zhou, HY; Wei, W.; Gui, MY; Yang, B.; Jin, YR Tre nya triterpensaponiner av dammarane-typ från bladen av Panax ginseng CA Meyer. J. Asian Nat. Driva. Res. 2010, 12, 865–873. [CrossRef] [PubMed]

23. Xing, Q.; Liang, T.; Shen, G.; Wang, X.; Jin, Y.; Liang, X. Omfattande HILIC x RPLC med masspektrometridetektion för analys av saponiner i Panax notoginseng. Analytiker 2012, 137, 2239–2249. [CrossRef] [PubMed]

24. Kärlek, DR; Pichler, FB; Dodd, A.; Copp, BR; Greenwood, DR Teknik för skärm med hög genomströmning: Nutid och framtid med zebrafisk. Curr. Opin. Biotechnol. 2004, 15, 564–571. [CrossRef] [PubMed]

25. Uwe, S.; Stefan, S.; Pobert, G.; Petra, G.; Henner, H.; Sepand, R.; Axel, S.; Ingrid, S.; Carsten, W.; Hilda, W.; et al. Zebrafiskembryon som ett alternativ till djurförsök - En kommentar till definitionen av början av ett skyddat livsstadium i djurskyddsbestämmelser. Reprod. Toxicol. 2012, 33, 128–132.

26. Chio, TY; Kim, JH; Ko, DH; Kim, CH; Hwang, JS; Ahn, S.; Kim, SY; Kim, CD; Lee, JH; Yoo, TJ Zebrafish som en ny modell för fenotypbaserad screening av melanogena regulatoriska föreningar. Pigment Cell Res. 2007, 20, 120–127. [CrossRef] [PubMed]

27. Elsalini, OA; Rohr, KB Fenyltiourea stör sköldkörtelfunktionen vid utveckling av zebrafisk. Dev. Genes Evol. 2003, 212, 593–598. [PubMed]

28. Lee, DY; Cha, BJ; Lee, YS; Kim, GS; Nej, HJ; Kim, SY; Kang, HC; Kim, JH; Baek, NI Potentialen hos mindre ginsenosider isolerade från bladen av Panax ginseng som hämmare av melanogenes. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 1677–1690. [CrossRef] [PubMed]

29. Li, J.; Huang, M.; Teoh, H.; Man, RY Panax quinquefolium saponiner skyddar lågdensitetslipoproteiner från oxidation. Life Sci. 1999, 64, 53–62. [CrossRef]

30. Li, TSC; Mazza, G.; Cottrell, AC; Gao, L. Ginsenosider i rötter och blad av amerikansk ginseng. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 717-720. [CrossRef]

31. Jung, CH; Seog, HM; Choi, IW; Park, MW; Cho, HY Antioxidantegenskaper hos olika lösningsmedelsextrakt från vilda ginsengblad. LWT 2006, 39, 266–274. [CrossRef]

32. National Institute of Crop Science. Ginseng GAP Standard Odlingsriktlinje; National Institute of Crop Science, Rural Development Administration: Suwon, Korea, 2009.

33. Karlsson, J.; Von Hofsten, J.; Olsson, PE Generating transparent zebrafish: En förfinad metod för att förbättra detektion av genuttryck under embryonal utveckling. Mar. Biotechnol. 2001, 3, 522–527. [CrossRef] [PubMed]

Exempeltillgänglighet:

Prover av föreningarna 1 och 2 är tillgängliga från författarna.

Dae Young Lee 1 ID , Hyoung-Geun Kim 2 , Yeong-Geun Lee 2 , Jin Hee Kim 3 , Jae Won Lee 1 ID , Bo-Ram Choi 1 , In-Bae Jang 1 , Geum-Soog Kim 1 och Nam-In Baek 2,*

1 Institutionen för växtodlingsforskning, National Institute of Horticultural and Herbal Science, RDA, Eumseong 27709, Korea; dylee0809@gmail.com (DYL); jaewon3@gmail.com (JWL); bmcbr@korea.kr (B.-RC); ikanet@korea.kr (I.-BJ); kimgs0725@korea.kr (G.-SK)

2 Institutionen för orientalisk medicin bioteknologi, Kyung Hee University, Yongin 17104, Korea; zwang05@naver.com (H.-GK); lyg629@nate.com (Y.-GL)

3 College of Herbal Bio-industry, Daegu Haany University, Gyeongsan 38610, Korea; gonogo1@nate.com

Mottaget: 28 november 2017; Godkänd: 26 januari 2018; Publicerad: 29 januari 2018

For more information:1950477648nn@gmail.com