Hur minskar Cistanche-extrakt inflammatorisk hyperplasi

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Minskning av inflammatorisk hyperplasi i tarmen hos möss som är utsatta för tjocktarmscancer genom vattenextrakt av Cistanche deserticola

Yamin Jia, 1,2 et al

Cistanchedeserticola har ofta använts i traditionell kinesisk medicin för att behandla många hälsoproblem, inklusive irritabel tarm eller förstoppning. Denna studie utformades för att testa effektiviteten av ett vattenextrakt av C. deserticola för att förebygga kolorektal cancer i en musmodell. Polysackaridrikt vattenextrakt av C. deserticola framställdes genom att koka dess stampulver i destillerat vatten. Tgfb1Rag2 nollmöss användes som en experimentell modell. Här visade vi att utfodring av vattenextrakt av C. deserticola signifikant minskade antalet slemhinnorhyperplasioch intestinal Helicobacter-infektion hos möss. Denna gynnsamma effekt korrelerade med betydande stimulering av immunsystemet, vilket framgår av förstoringen av mjältarna med ett ökat antal mjältmakrofager och naturliga mördarceller, och med mer potent cytotoxicitet hos splenocyter. In vitro vattenextrakt av C. deserticola ökade cytotoxiciteten hos naiva splenocyter mot en human koloncancercellinje, och i makrofagkulturer uppreglerade kväveoxidsyntas II-uttrycket och stimulerade fagocytos. Sammanfattningsvis visar våra data att oral administrering av C. deserticola-extrakt minskarinflammatoriskhyperplastiskpolyper och helicobacter-infektion hos möss genom dess immunstimulerande aktivitet, vilket tyder på att C. deserticola-extrakt kan ha potential att förebygga tarminflammationssjukdomar inklusive kolorektal cancer. Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd.

Nyckelord: örtimmunmodulering;Cistancheextrahera; polysackarider; helicobacter;inflammatoriskhyperplasi; kolorektal cancer.

Cistancheextraherakan minskaInflammatoriskhyperplasi

INTRODUKTION

Kolorektal cancer är den tredje vanligaste cancerformen hos män och den andra bland kvinnor i världen och rankar den fjärde vanligaste dödsorsaken i cancer (8 procent av alla cancerdödsfall; Ferlay et al., 2010). Epidemiologiska studier tyder på att många riskfaktorer förknippade med denna sjukdom, inklusive genetiska (t.ex. familjehistoria av tjocktarmscancer) (Strate och Syngal, 2005) och kostfaktorer (t.ex. rött kött och lågfiber; Chao et al., 2005; Park et al., 2005; Park et al. al., 2005), ochinflammatorisktarmsjukdomar (IBD; Eaden et al., 2001; von Roon et al., 2007; Lukas, 2010). Hittills, trots de många nya cellgifter och förbättrade kirurgiska och radioterapeutiska tekniker som används för behandling av denna sjukdom (Cunningham et al., 2010), är en stor del av patienterna med kolorektal cancer fortfarande obotliga; cirka 608 000 dödsfall från denna sjukdom uppskattas över hela världen under 2008 (Ferlay et al., 2010). Därför behövs nya terapier, och en kandidat är immunterapi. Olika immunoterapeutiska tillvägagångssätt har utvärderats för behandling av kolorektal cancer, och resultaten hittills är uppmuntrande (Burgdorf et al., 2009). Växtbaserade polysackarider har visats ha specifik immunreglerande aktivitet (Jiang et al., 2010), vilket tyder på att dessa växtbaserade produkter skulle kunna användas som ett specifikt immunstimulerande adjuvans mot kolorektal cancer.

Cistanchedeserticola Ma, känd som Rou Cong Rong i kinesisk örtmedicin, har inkluderats i örtformler för många hälsoproblem, inklusive impotens, sjuklig leukorré och irritabel tarm/förstoppning (Jiang och Tu, 2009). Experimentella studier har avslöjat olika biologiska aktiviteter av olika extrakt av C. deserticola; fenyletanoidglykosidextraktet av denna ört har antiutmattningsaktivitet hos möss (Cai et al., 2010) och smärtstillande och anti-inflammatoriskeffekter hos gnagare (Lin et al., 2002), medan dess polysackarider stimulerar T- och B-lymfocytproliferation i lymfocytkulturer (Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Emellertid har effektiviteten av polysackaridextrakt av C. deserticola vid stimulering av immunsvar in vivo inte undersökts ännu.

Rag2^-/-möss saknar mogna T- och B-lymfocyter och på den blandade bakgrunden (~97 procent 129 S6 och ~3 procent CF-1) utvecklar spontant inflammationsassocieradhyperplasii tarmen (Engle et al., 1999). Genetisk introduktion av Tgfb1 (transformerande tillväxtfaktor b1 (TGF-b1) gen) nollallelen till denna mössstam resulterar i ytterligare progression avhyperplasitill adenom och karcinom (Engle et al., 2002), och den patogena mikrofloraberoende koliten krävs för utvecklingen av tjocktarmscancer (Engle et al., 2002), vilket tyder på att denna mössstam utgör en idealisk modell för undersökning av en potentiell terapi vid behandling av inflammation/IBD-inducerad kolorektal cancer. I denna studie demonstrerar vi för första gången effekten av polysackaridrikt vattenextrakt av C. deserticola för att minskainflammatoriskhyperplasii denna modell.

MATERIAL OCH METODER

Polysackaridrikt vattenextrakt av C. deserticola-preparat.

Herbal C. deserticola skördades av Dr. Y. Guo (China Agricultural University) i den autonoma regionen Inre Mongoliet, Kina. Pulvret av hela torkade stjälkar (300 g) kokades i dubbeldestillerat vatten två gånger: först under 1 timme i 500 ml vatten, följt av en uppsamling av supernatanten, sedan under 45 minuter i 400 ml vatten. Supernatanterna filtrerades genom ett Whatman-filterpapper (medelsnabbt) efter varje kokningstid och slogs samman. Extraktlösningen torkades genom lyofilisering och hölls vid 80 C. Slutprodukten var cirka 10 g (utbyte: ~3 procent).

Möss och cellkulturer. TGF-b1-defekta möss (Tgfb1 plus /- Rag2^-/-) på blandad bakgrund (~97 procent 129 S6 och ~3 procent CF-1) mottogs från en avelskoloni som hölls under patogenfria förhållanden i djuranläggningen vid Jack Bell Research Center (Vancouver, BC). Dessa möss härstammar från Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) Repository (National Cancer Institute i Frederick, MD, USA). C57BL/6 J (B6) möss (hane, 8–10 veckor gamla) köptes från Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Alla djuren för experimenten hölls under konventionell inhysning och diet (5001 Rodent Diet, LabDiet) efter avvänjning vid 4 veckors ålder, och örtbehandling och provtagning utfördes i enlighet med Canadian Council on Animal Care riktlinjer under
protokoll godkända av Animal Use Subcommittee vid University of British Columbia.

Både SW480 human kolonadenokarcinomcellinjen och RAW 246.7 musleukemisk makrofagcellinje odlades i Dulbeccos modifierade Eagle's Medium (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) innehållande 10 procent fetalt nötkreatur serum (FBS) (komplett DMEM-medium) vid 37-C i en fuktad 5 procent CO2/95 procent luftinkubator. Splenocyter isolerades genom att försiktigt krossa mjältfragment i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), följt av avlägsnande av erytrocyter med användning av lysbuffert (0,15 M NH4Cl, 1,0 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 6,8). Efter tvättning med PBS igen suspenderades splenocyter i RPMI 1640-medium kompletterat med 10 procent FBS (komplett RPMI-medium).

Cistancheextraherakan minskaInflammatoriskhyperplasi

Extraktbehandling.

Örtextraktet, kallatCistancheextraherai denna studie, framställdes slutligen genom rekonstituering av torkat pulver med steriliserat dubbeldestillerat vatten och innehöll 2–3 procent (vikt/vikt) fenyletanoider, 65–70 procent (vikt/vikt) polysackarider, och 0.6–1 procent (vikt/vikt) av protein baserat på följande analyser: antalet fenyletanoider bestämdes genom absorbans vid 332 nm med användning av en tidigare beskriven spektrofotometri (Ouyang et al., 2005); innehållet av polysackarider mättes med användning av en standardfenolsvavelsyrametod (Dubois et al., 1956) efter etanolfällning; och protein bestämdes genom Bio-Rad proteinanalys enligt tillverkarens protokoll (Bio-Rad Lab, Hercules, CA, USA). Cistanche-extraktdosen var 0,4 g/kg/dag baserat på vår pilotstudie. Det genomsnittliga vattenintaget per vuxen mus och dag var cirka 4 mL, och om 1 mL dricksvatten innehöll 3 mgCistancheextraheravarje mus fick oral administrering av 12 mg av extraktet per dag. Baserat på det faktum att den genomsnittliga kroppsvikten för en vuxen mus var 30 g, dricksvattnet innehållande 3 mg/mlCistancheextraheragav en dos på 0,4 g/kg/dag till mössen. Mössen behandlades genom att ge dricksvatten ad labium innehållande 3 mg/mlCistancheextraherasom fylldes på minst en gång varannan dag, från två månaders ålder under tre månader i ett konventionellt rum på djurvårdsinrättningen.

Histologisk gradering av kolorektal cancer.

I slutet av den tre månader långa behandlingen skördades både tunn- och tjocktarmsvävnader och öppnades i längdriktningen, följt av att försiktigt spola ut innehållet med PBS. Totalt sex bitar (vardera 2 cm långa) av tarmvävnad från varje mus samlades: tre från tunntarmen vid proximala, mitten och distala ställen; två från tjocktarmen på proximala och distala platser och en från blindtarmen. Alla vävnader fixerades i 10 procent formalin och bäddades in i paraffin. Varje sektion färgades med hematoxylin och eosin (HE) för histologisk gradering av kolorektal cancer. Sjukdomsgraderingen utfördes enligt de patologiska egenskaperna hoshyperplasiadenom eller karcinom inom varje prov, såsom tidigare beskrivits (Engle et al., 1999) på ett blindtestsätt. Det totala antalet av varje patologisk förändring (hyperplasiadenom och karcinom) räknades i två sektioner av tarmvävnaden för varje mus.

Cistancheextraherakan minskaInflammatoriskhyperplasi

Detektion av Helicobacter hepaticus (H. hepaticus) i musavföring.

För att undersöka effekten avCistancheextraherapå tillväxten av patologisk mikroflora i tarmen, bestämdes H. hepaticus i feces genom polymeraskedjereaktion (PCR) med artspecifika 16S rDNA-primrar såsom beskrivits tidigare (Shames et al., 1995). Ungefär 200 mg färsk avföring löstes i 1 μL PBS och inkuberades vid 50 grader i 30 minuter, följt av centrifugering vid 8000 rpm i 10 minuter. Supernatanten (200 ml) samlades upp och blandades med en lika stor mängd proteinas K-lösning innehållande 5 procent (v/v) av 18,7 mg/ml proteinas K-lösning (Fermentas Canada, Burlington, ON, Kanada) i en smältbuffert (50 μM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M EDTA, 0,5 procent natriumdodecylsulfat), och inkuberades vid 70 C i 30 minuter. DNA:t i den resulterande lösningen extraherades med användning av QIAprep Miniprep-kitet enligt tillverkarens protokoll (QIAGEN, Mississauga, ON, Kanada).
Polymeraskedjereaktionsamplifiering av bakteriellt DNA utfördes i en blandning innehållande {{0}}.75 μL av 10 PCR-buffert, 0.5μL av 50 mM MgCl2, 0,5 μL av varje primer (sense: 5'-GCA TTT GAA ACT GTT ACT CTG; anti-sense: 5'-GGG GAGCUUGAAAACAG, 100 mM vardera), 0,5 μL Taq-polymeras, 18,75 μL H2-nukleas och-fritt H2-nukleas 1μL okvantifierad feces-DNA-lösning. PCR-blandningen upphettades vid 94 grader i 5 minuter, följt av 40 cykler av denaturering vid 94 grader under 1 minut, hybridisering vid 55 grader i 1,25 minuter och förlängning vid 72 grader i 1,5 minuter. PCR avslutades med ett förlängningssteg på 10 minuter vid 72 grader. Den resulterande PCR-produkten (25 μL) utsattes för elektrofores på en 1-procentig agarosgel i Tris-acetat-EDTA (TAE)-buffert innehållande 0,5 mg/ml etidiumbromid och visualiserades under UV-ljus.

Bestämning av makrofager och naturliga mördarceller (NK).

Procentandelen av makrofager och NK-celler i splenocytsuspension bestämdes genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) analys. En miljon splenocyter i FACS-buffert inkuberades med lämplig antikroppskombination för olika fenotyper av celler i is: anti-CD3-fluoresceinisotiocyanat (FITC) och anti-CD49b-fykoerytrin (PE) (BD Biosciences, Mississauga, ON, Kanada) för CD3 CD49b plus NK-celler, och rått-anti-mus F4/80 plus som en primär antikropp och anti-rått-IgG-FITC som en sekundär antikropp (eBioscience, San Diego, CA, USA) för F4/80 plus makrofager. Intensiteten av fluorescens för varje typ av cell mättes med hjälp av flödescytometri och analyserades genom jämförelse med bakgrundskontroller med användning av CELLQUEST programvara (BD Biosciences).

Kalcein-acetoximetyl (calcein-AM) cytotoxicitetsanalys.

Den lytiska aktiviteten hos effektorsplenocyter mot mål-SW480-celler utvärderades genom calcein-AM-cytotoxicitetsanalys med användning av ett samodlingssystem som beskrivits tidigare (Neri et al., 2001). I korthet märktes SW480-celler med fluorescerande färgämne calcein-AM enligt följande: 1 x 10⁶celler/ml SW480-celler i komplett DMEM-medium inkuberades med 15 μM calcein-AM vid 37 grader med tillfällig skakning. Efter 30 minuters inkubation tvättades cellerna noggrant med ett komplett DMEM-medium för att avlägsna det extracellulära färgämnet. De fluorescerande färgämnesmärkta SW480-cellerna i komplett DMEM-medium (0,2 x 10⁶celler/{{0}},25 ml/brunn) såddes i 24-brunnsplattor. Baserat på de olika förhållandena (12:1, 6:1, 3:1 och 1,5:1) av E (effektor): T (mål), splenocyter i 0,25 ml komplett RPMI-medium per brunn sattes till brunnarna med målceller i tre exemplar. Samkulturer inkuberades vid 37 grader i 5 procent CO2 under 24 timmar. Supernatanter uppsamlades efter att plattan snurrats vid 2000 rpm under 5 min. Calcein-AM-frisättning till supernatanten bestämdes med användning av en mikroplattspektrofluorimeter (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Labsystems) vid en emission av 527 nm under excitation vid 485 nm. Målcellerna, inkuberade med en blandning av 0,25 ml komplett DMEM-medium och 0,25 ml komplett RPMI-medium, användes som bakgrundskontroller eller kontroller för spontan frisättning, och i närvaro av 2 procent användes Triton X-100 som maximala utlösningskontroller. Cytotoxiciteten för splenocyter beräknades enligt följande:

Mätning av kväveoxid (NO). Kväveoxid utsöndrad från celler oxiderades snabbt till nitrit i odlingsmediet. Därför bestämdes nitratkoncentrationer i mediet med Griess-metoden som ett mått på NO-produktion. RAW264.7-celler (0.25 x 10⁶

celler/brunn i 0,5 mL komplett DMEM-medium) i 24-brunnsplattor stimulerades medCistancheextrahera(50–200 mg/ml) och lipopolysackarid (LPS) (10 ng/ml) som en positiv kontroll. Efter 24 timmars behandling blandades först 50 ml odlingssupernatant med 50 ml 1 procent
sulfanilamid i 5 procent fosforsyra i 96-brunnsplattor i tre exemplar och inkuberades i 10 min, sedan tillsattes 50 ml 0,1 procent naftyletylendiamin-dihydroklorid i destillerat vatten per brunn. Absorbansen avlästes vid 550 nm efter inkubation under 10 minuter, och nivån av NO/nitrit beräknades med användning av en standardkurva med kända natriumnitritkoncentrationer.

Cistancheextraherakan minskaInflammatoriskhyperplasi

Western blot.

Cellulära nivåer av kväveoxidsyntas II (NOS 2 eller iNOS) undersöktes med Western blot som beskrivits tidigare (Du et al., 2006). Kortfattat fraktionerades proteinprover (ungefär 100 mg/prov) med 7 procent SDS-PAGE och överfördes till nitrocellulosamembranet. NOS II-proteinbanden identifierades med primär polyklonal anti-NOS II-antikropp från kanin (N-20) (1:500 spädning; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA) och sekundär get-anti-kanin-IgG-antikropp ( 1:10000 spädning; Vector Laboratory, Burlingame, CA, USA). NOS II-protein-antikroppskomplexet visualiserades med en förbättrad kemiluminescensanalys (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England). Blots reprobed med anti-b-aktin IgG (Sigma-Aldrich Canada, Oakville, ON, Kanada) för bekräftelse av laddat protein i varje prov.

Fagocytosanalys. Fagocytos mättes genom mängden fluorescensmärkta latexpärlor (SigmaAldrich Canada, L-3030, karboxylatmodifierad, medelstorlek 2 mm) uppslukade av RAW264.7-celler som beskrivits tidigare (Wu et al., 2{{ 9}}07). I korthet såddes RAW264.7-celler (0,1 106 celler/0,5 ml/brunn) i komplett DMEM-medium i 24-brunnsplattor och stimulerades med 100 mg/ml avCistancheextraheraeller komplett DMEM-medium endast som kontroll. Efter stimulering över natten sattes 2,5 ml fluorescerande latexpärlor per brunn till makrofagkulturerna och inkuberades under 2 timmar. För flödescytometrianalys lossades cellerna genom pipettering efter tvättning i PBS, och intensiteten av fluorescensen hos fagocytiska celler mättes med en flödescytometer och analyserades genom jämförelse med bakgrundskontroller (inga pärlor) med CELLQUEST-programvara (BD Biosciences).

Statistisk analys.

Data presenterades som medelvärde plus -standardavvikelse (SD). Variansanalys (ANOVA) eller Students t-test utfördes som lämpligt för att jämföra data mellan grupper. Ett p-värde på < 0.05="" ansågs="">

RESULTAT

Behandling medCistancheextraheraminskar frekvensen avhyperplasioch H. hepaticus infektion i tarmen Under behandlingsperioden (3 månader) övervakades kroppsvikten och dricksvattenintaget en gång varannan dag hos möss i den extraktbehandlade gruppen jämfört med den vehikelbehandlade gruppen, ingen signifikant skillnad var noteras (data visas inte). Histologisk analys visade dock att oral administrering avCistancheextraktminskat antalet avsevärtinflammatoriskhyperplasii tarmen (Fig. 1), vilket framgår av det faktum att möss som fick vatten med extrakt hade färrehyperplasi(5.00 plus -2.83/mus, n=15) än de som dricker vanligt vatten eller fordon (7.53 plus -3.09/mus, n {{9 }}) (utdrag vs. fordon: p=0.0133, t-test). Skillnaden i antalet adenom och karcinom mellan extrakt- och vehikelbehandlade möss var inte statistiskt signifikant eftersom endast ett fåtal möss hade dessa stadier av patologiska förändringar (data visas ej).

Figur 1. Minskning av incidensen av hyperplasi genom behandling med vattenextrakt av C. deserticola (Cistancheextrahera). Tgfb1 plus /-Rag2-/- möss matades medCistancheextraherai dricksvatten (Extraktgruppen) jämfört med de med enbart vanligt dricksvatten (Fordonsgruppen). Cancerskador i tarmen undersöktes med histologi med en H&E-färgning. (A) En typisk bild av den friska vävnadssektionen. (B) En typisk bild av hyperplasi i sektionen, indikerad med en pil. (C) Antalet hyperplasi i tarmen hos varje djur räknades med histologi (p=0.0133, extrakt mot vehikel, n=15). Denna figur är tillgänglig i färg online på wileyonlinelibrary.com/journal/ptr

Mikrobiellt innehåll i tarmen, särskilt H. hepaticus-infektion, har visat sig vara nödvändigt för utvecklingen av alla stadier av tjocktarmscancer inklusive hyperplasi i Rag2^-/- möss (Engle et al., 2002; Erdman et al., 2003). Att undersöka om behandlingen medCistancheextraktminskad patologisk mikroflora i tarmen, förekomst av H. hepaticus i avföringen från mössen som behandlats medCistancheextraherabestämdes med PCR jämfört med vehikelkontroller. I varje experiment behandlades tre möss per bur med Cistanche-extrakt eller vehikel. Avföringsproverna samlades in i slutet av en 14-h över natten efter att buren rengjorts. Som visas i fig. 2 detekterades H. hepaticus 16S rDNA i feces effektivt med PCR-tekniken. I tre separata försök (tabell 1) kom endast 20–40 procent av proverna frånCistanche-extrahera-behandlade möss detekterades som PCR-positiva, medan 60–80 procent från vehikelkontrollerna var positiva (extrakt vs. vehikel: p=0.0189, t-test, n=3), vilket tyder på att behandling med Cistanche-extrakt minskade intestinal H. hepaticus-infektion hos möss.

Behandling med Cistanche-extrakt ökar antalet mjältmakrofager och NK-celler

Immunsvaret spelar en nyckelroll för att eliminera helicobacter-infektion. För att undersöka omCistanche extraherabehandling påverkade immunsystemet hos dessa möss med benägna tjocktarmscancer, storleken på mjältarna (12 möss i varje grupp) och antalet splenocyter (sex möss slumpmässigt valda från varje grupp) bestämdes i slutet av behandlingen. Mjältarna från 12 möss i varje grupp vägdes, de andra tre mössen i det initiala experimentet inkluderades inte. Som illustreras i tabell 2,Cistanche-extrahera-behandlade möss (0.055 plus -0.022 g/mjälte) var tyngre än i vehikelgruppen (0.038 plus -0.01 g/mjälte; extrakt vs. fordon: p=0.04, t-test). Dessa data stöddes ytterligare av en ökning av antalet splenocyter hos möss som behandlats medCistancheextrahera, indikerat med 7,095 plus -1.353 (x10⁶ celler/mjälte) jämfört med 2,941 plus -1,492 (x10⁶celler/mjälte) kontrollmöss i fordonet (extrakt vs. vehikel: p=0.002, t-test).

För att ytterligare utvärdera omCistancheextraherabehandling påverkade en viss undertyp av splenocyter hos möss, antalet mjält-NK-celler (CD3)^-CD49b^plusceller) och makrofager (FT/80^plusceller) räknades genom FACS-analys. Procentandelen CD3^-CD49b^plusceller i splenocyterna avCistanche-extrahera-behandlade möss (32,06 plus -2,13 procent ) skilde sig inte signifikant från de hos vehikelbehandlade möss (28,47 plus -2,74 procent ; extrakt vs. vehikel: p=0. 3741, t-test, n=6), men det totala antalet NK-celler i mjälten påCistanche-extrahera-behandlade möss (2,22 plus - 0.44x10⁶/spleen) var högre än kontrollgruppen i fordonet (0.83 plus -0.17x10⁶/mjälte; extrahera vs. fordon: p=0.01, t-test, n=6; Fig. 3B). Liknande resultat sågs vid undersökning av mjält-FT/80 plus-celler; som i mjält-NK-cellpopulationen, skillnaden i andelen mjält-FT/80 plus-celler mellan extraktbehandlade möss (35,25 plus -7.28 procent ) och vehikelkontrollmöss (31,74 plus -5). 07 procent) var inte signifikant (extrakt vs. vehikel: p=0.407, n=6), men det totala antalet mjältmakrofager i den extraktbehandlade gruppen (2.439 plus -0 .452x10⁶celler/mjälte) var högre än i kontrollgrupper (1,114 plus -0.685x10⁶celler/mjälte; extrahera vs. fordon: p=0.001, t-test, n=6; Fig. 3D). Sammantaget tyder dessa data på att behandlingen medCistancheextraherakan öka det totala antalet, men inte procent eller andel, av subtyper av effektorsplenocyter, NK-celler och makrofager i mjältarna.

Figur 3. Ökning av antalet mjält-NK-celler och makrofager genom behandlingen medCistancheextrahera. NK-celler eller makrofager i splenocytsuspension bestämdes genom FACS-analys med en kombinationsfärgning av FITC-anti-CD3e-antikropp och APC-anti-CD49b/Pan-NK-cellmarkör (för NK-celler) eller med en enda färgning av FITC-anti- FT/80 (för makrofager). (A) En representativ graf över andelen NK-celler från mjälten (CD3^-CD49b^plus) i splenocyterna hos möss som behandlats medCistancheextraherakontra fordon. (B) Det totala antalet NK-celler per mjälte. Data presenteras som medelvärde plus -SD i varje grupp (p= 0.01, n= 6). (C) En representativ graf över procentandelen mjältmakrofag (FT/80 plus ) i splenocyterna hos möss som behandlats medCistancheextraherakontra fordon. (D) Det totala antalet makrofager per mjälte. Data presenteras som medelvärde plus -SD i varje grupp (p= 0.001, n=6).

Behandling med Cistanche-extrakt stimulerar splenocytcytotoxicitet in vivo och in vitro

Immunsvaret berodde inte bara på antalet splenocyter utan också på deras funktion, såsom cytotoxicitet. Effekten avCistancheextraherabehandling av splenocyternas funktion (dvs cytotoxicitet) undersöktes i samodlingar med SW480-celler. Som visas i Fig. 4A, cytotoxiciteten hos splenocyter från möss behandlade medCistancheextraheravar högre än för celler från vehikelbehandlade möss, vilket indikeras av 39,38 plus -2,64 procent av kalcein-AM-frisättningen i samkulturerna av extraktbehandlade splenocyter med SW480-celler vid en 6 :1-förhållande, 51,11 plus -2,6 procent vid ett förhållande på 3:1 och 57,33 plus -2,53 procent vid ett förhållande på 1,5:1, jämfört med 27.75- 0.18 procent i samkulturerna av vehikelbehandlade splenocyter med SW480-celler i ett förhållande på 6:1, 40.97 =-2.85 procent vid ett förhållande på 3:1 och 45.16 plus -0.18 procent vid ett 1,5:1-förhållande (extrakt vs. fordon: p < 0,0001,="" tvåvägs="" anova).="" för="" att="" ytterligare="" bekräfta="" den="" stimulerande="" effekten="">Cistancheextraherapå splenocytcytotoxicitet, cytotoxiciteten avCistanche-extrahera-behandlade naiva splenocyter från B6-möss, innehållande funktionella T- och B-celler, undersöktes i samodlingarna med SW480-celler. Såsom visas i fig. 4B, tillägg avCistancheextrahera(100 mg/ml) ökade signifikant kalcein-AM-frisättningen i samkulturerna på ett splenocytberoende sätt: 57,64 plus -3,41 procent vid ett förhållande på 12:1, 52,25 plus { {11}},77 procent i förhållandet 6:1 och 45,72 plus -2,43 procent vid förhållandet 3:1, jämfört med 14,36 plus -0,05 procent vid förhållandet 12:1 , 20,67 plus -2,03 procent vid ett förhållande på 6:1 och 23,1 plus -3,73 procent vid ett förhållande på 3:1 i ostimulerade samkulturer (extrakt vs. vehikel: p < 0,0001,="" två="" -way="" anova).="" dessa="" resultat="" tyder="" på="">Cistancheextraherastimulerar den lytiska aktiviteten hos splenocyter. Anledningen till att mindre cytotoxicitet sågs när fler effektorsplenocyter tillsattes är okänd. En möjlighet var att nivån av calcein-AM-frisättning i detta samodlingssystem kanske inte exakt återspeglar målcellsdöden eftersom calcein-AM kunde återabsorberas av effektorsplenocyter efter en lång inkubationsperiod.

Cistanche-extrakt aktiverar makrofager

Aktivering av makrofager är en av de kritiska immunsvaren mot infektion och tumörutveckling (Mantovani et al., 2002, 2008). För att ytterligare avslöja insikt i de mekanismer genom vilkaCistancheextraherabehandling minskad tarmhyperplasi och mikrobiellt innehåll, effekten avCistancheextraherapå NO-produktion och fagocytos av makrofager, RAW264.7-celler, undersöktes. Som visas i Fig. 5A uppreglerades proteinuttryck av NOS II i kulturer efter inkubation medCistancheextrahera. Dessa resultat stöddes ytterligare av ökningen av NO-produktionen iCistanche-extrakt-stimuleradkulturer (Fig. 5B), bevisas av 3,88 plus -0,13 mM nitrit i 50 mg/mlCistancheextraherastimulerade RAW264.7-cellkulturer jämfört med 0.11 plus -0.12 mM nitrit i ostimulerade kontrollkulturer (envägs ANOVA, p.<>

Fagocytos är en cellulär process för att uppsluka fasta partiklar, såsom bakterier. Såsom visas i fig. 5C och D, tillägg avCistancheextraktstimulerad makrofagfagocytos, vilket indikeras av att fler fagocytiska celler (9,8 plus -0,1 procent) finns iCistanche-extrahera-stimulerade makrofagkulturer jämfört med de (5,2 plus -0,4 procent) i vehikelstimulerade kulturer (extrakt vs. vehikel: p=0.0007, t-test, n=3) efter 2 timmars inkubation. Dessa data tyder på detCistancheextraherakan direkt aktivera makrofager genom uppreglering av lokal NO-produktion och stimulering av makrofagfagocytos i tarmen hos möss.

DISKUSSION

Föreliggande studie visar för första gången att oral administrering avCistancheextraheraminskar avsevärt frekvensen av hyperplasi och H. hepaticus-infektion i tarmen hos möss med benägna tjocktarmscancer. Den gynnsamma effekten avCistancheextraherabehandling är associerad med en ökning av antalet och cytotoxicitet hos mjältens NK-celler och makrofager. In vitro tillsats avCistancheextraherastimulerar NO-produktion och fagocytos i makrofager. TGF-b1 bristfällig Rag2^-/-möss har visats utveckla tjocktarmscancer (hyperplasi, adenom eller adenokarcinom) från 3 till 6 månaders ålder, och det har visats attinflammatoriskfoci är alltid associerade med dessa tumörframkallande lesioner (Engle et al., 1999). Ytterligare studier har visat att hos dessa möss krävs utveckling av tjocktarmscancer för närvaron av infektion av patogen mikrobiell flora eftersom tjocktarmscancer helt elimineras genom att inhysa möss under bakteriefria förhållanden (Engle et al., 2002) och H. hepaticus infektion inducerar också kolit och tjocktarmscancer i Rag2-/-möss (Erdman et al., 2003). På liknande sätt hos människor är mikrobiell status och värdimmunitet nyckelfaktorerna för progression av IBD (Fiocchi, 1998), och gastriskt karcinom har rapporterats vara associerat med H. pylori-inducerad kronisk infektion eller inflammation (Parsonnet et al., 1991; El-Omar och Malfertheiner, 2001). Resultaten från dessa studier tyder på att gastrointestinala infektioner kan spela en avgörande roll i utvecklingen av tjocktarmscancer. Således kan inriktning på gastrointestinal infektion bli en terapeutisk strategi för förebyggande eller behandling av tjocktarmscancer såväl som IBD. Vår studie visar för första gången att oral administrering avCistancheextraheraminskar frekvensen avinflammatoriskhyperplasii tarmen, och antalet H. hepaticus i avföringen hos möss med brist på TGF-b1. Den gynnsamma effekten avCistanche extraherakan bero på dess aktivering av makrofager, vilket ses av en ökning av både NO-produktion och fagocytos efter behandling medCistancheextrahera(Fig. 5), vilket kan begränsa den intestinala patogena mikrofloran inklusive helicobacter (Mantovani et al., 2002, 2008). Som en konsekvens, lesionen avinflammatoriskhyperplasireducerades.

En mängd olika bioaktiva föreningar har identifierats i extrakten av C. deserticola, inklusive fenyletanoidglykosider och polysackarider (Jiang och Tu, 2009). Fenyletanoidglykosiderna är cytoskyddande, vilket indikeras av det faktum att dessa föreningar förhindrar celldöd i odlade hepatocyter och cerebellära granulneuroner (Xiong et al., 1998; Pu et al., 2003). Medan polysackarider stimulerar mitogeninducerad T- och B-lymfocytproliferation (Wu och Tu, 2005; Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Det har dokumenterats väl att växtbaserade polysackarider modulerar immunsvaret (Jiang et al., 2010).Cistancheextraherainnehåller 2–3 procent fenyletanoider och 65–70 procent polysackarider, vilket tyder på att den immunmodulerande effekten avCistancheextraherabehandling kan bero på den immunreglerande aktiviteten hos polysackarider, majoriteten av bioaktiva substanser i Cistanche-extrakt. Emellertid kräver dess målimmunceller (t.ex. makrofager eller NK-celler, eller båda) och molekylära vägar ytterligare undersökning. Dessutom visar en färsk studie att administrering av växtbaserade fenyletanoidacetonid, en av de bioaktiva fenyletanoider i extraktet av C. deserticola (Xiong et al., 1996; Jiang och Tu, 2009), har en gynnsam effekt på minskningen av dextran. sulfat-natrium-inducerad kolit hos möss (Hausmann et al., 2007), vilket visar att fenyletanoider (2–3 procent) iCistancheextraherakan åtminstone delvis bidra till dess effektivitet i minskningen avinflammatoriskhyperplasi, vilket också kräver utvärdering i framtiden.
Sammanfattningsvis är kolorektal cancer en av de vanligaste cancerformerna i världen och kan förebyggas i de flesta fall. Användningen av icke-toxiska örtextrakt kan erbjuda en effektiv strategi för att förebygga utveckling av kolorektal cancer, och kan även användas som ett kemo-adjuvans, vilket kan gynna förbättringen av kemoterapeutisk anticancereffektivitet och/eller minskningen av kemoterapeutiken. bieffekter. Data som presenteras i denna studie visar tydligt att behandlingen med vattenextrakt av C. deserticola minskar hyperplasi och H. hepaticus-infektion i tarmen hos möss med benägna tjocktarmscancer. Helicobacter-infektion eller tarminflammationhyperplasiär en riskfaktor för utveckling av kolorektal cancer. Vår nuvarande studie indikerar att användningen av denna ört kan ha potential för att förebygga och behandla kolorektal cancer, särskilt för de individer som har IBD.

Bekräftelse

YM fick stöd av ett doktorandstipendium från China Scholarship Council.

Intressekonflikt

Författarna har ingen intressekonflikt.

Cistancheextraherakan minskaInflammatoriskhyperplasi

Från: 'Minskning avInflammatoriskHyperplasii tarmen i tjocktarmscancer-benägna möss genom Vatten-extrakt avCistanchedeserticola' av Yamin Jia,1,2 et al

---Upphovsrätt © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. Phytother. Res. 26: 812–819 (2012) DOI: 10.1002/ptr.3637

REFERENSER

Burgdorf SK, Nielsen HJ, Rosenberg J. 2009. Immunterapi vid kolorektal cancer. Scand J Gastroenterol 44: 261–268.
Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. 2010. Den antitrötthetsaktivitet av fenyletanoidrikt extrakt frånCistanchedeserticola. Phytother Res 24: 313–315.
Chao A, Thun MJ, Connell CJ, et al. 2005. Köttkonsumtion och risk för kolorektal cancer. JAMA 293: 172–182.
Cunningham D, Atkin W, Lenz HJ, et al. 2010. Kolorektal cancer. Lancet 375: 1030–1047.
Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. 2007. Strukturell karaktärisering och immunologisk aktivitet av två kallvatten extraherbara polysackarider frånCistanchedeserticola YC. Ma. Carbohydr Res 342: 1343-1349.
Du C, Guan Q, Diao H, Yin Z, Jevnikar AM. 2006. Kväveoxid inducerar apoptos i renala tubulära epitelceller genom aktivering av kaspas-8. Am J Physiol Renal Physiol 290: F1044–1054.
Dubois M, Gilles KAJK, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Kolorimetriska metoder för bestämning av sockerarter av besläktade ämnen. Anal Chem 28: 350-356.

Eaden JA, Abrams KR, Mayberry JF. 2001. Risken för kolorektal cancer vid ulcerös kolit: en metaanalys. Gut 48: 526–535.
El-Omar EM, Malfertheiner P. 2001. Helicobacter pylori och magcancer. Curr Opin Gastroenterol 17(Suppl 1): S24-S27.
Engle SJ, Hoying JB, Boivin GP, ​​Ormsby I, Gartside PS, Doetschman T. 1999. Transforming growth factor beta1 undertrycker icke-metastaserande tjocktarmscancer i ett tidigt stadium av tumörbildning. Cancer Res 59: 3379–3386.
Engle SJ, Ormsby I, Pawlowski S, et al. 2002. Eliminering av tjocktarmscancer i möss med brist på bakteriefri transformerande tillväxtfaktor-beta 1-. Cancer Res 62: 6362–6366.
Erdman SE, Poutahidis T, Tomczak M, et al. 2003. CD4 plus CD25 plus regulatoriska T-lymfocyter hämmar mikrobiellt inducerad tjocktarmscancer hos Rag2-deficienta möss. Am J Pathol 162: 691–702.
Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. 2010. Uppskattningar av den globala bördan av cancer 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 127: 2893–2917.
Fiocchi C. 1998.Inflammatorisktarmsjukdom: etiologi och patogenes. Gastroenterology 115: 182–205.
Hausmann M, Obermeier F, Paper DH, et al. 2007. In vivo-behandling med växtbaserade fenyletanoiden akteosid lindrar tarminflammation vid dextransulfatnatrium-inducerad kolit. Clin Exp Immunol 148: 373-381.
Jiang MH, Zhu L, Jiang JG. 2010. Immunreglerande verkan av polysackarider från kinesisk örtmedicin. Expert Opin Ther Targets 14: 1367–1402.
Jiang Y, Tu PF. 2009. Analys av kemiska beståndsdelar iCistanchearter. J Chromatogr A 1216: 1970–1979.
Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CR. 2002. Antinociceptiv och anti-inflammatoriskaktivitet orsakad avCistanchedeserticola hos gnagare. J Ethnopharmacol 83: 177-182.
Lukas M. 2010.Inflammatorisktarmsjukdom som en riskfaktor för kolorektal cancer. Dig Dis 28: 619–624.
Mantovani A, Allavena P, Sica A, Balkwill F. 2008. Cancerrelaterad inflammation. Nature 454: 436–444.
Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. 2002. Makrofagpolarisering: tumörassocierade makrofager som ett paradigm för polariserade M2 ​​mononukleära fagocyter. Trends Immunol 23: 549–555.
Neri S, Mariani E, Meneghetti A, Cattini L, Facchini A. 2001. Calcein-acetoximetyl cytotoxicitetsanalys: standardisering av en metod som tillåter ytterligare analyser av återvunna effektorceller och supernatanter. Clin Diagn Lab Immunol 8: 1131–1135.
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Wang YC. 2005. Förbättrad produktion av fenyletanoidglykosider avCistanchedeserticola-celler odlade i en bioreaktor med inre luftbro med en siktare. Enzyme Microb Technol 36: 982–988.
Park Y, Hunter DJ, Spiegelman D, et al. 2005. Kostfiberintag och risk för kolorektal cancer: en samlad analys av prospektiva kohortstudier. JAMA 294: 2849–2857.
Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, et al. 1991. Helicobacter pylori-infektion och risken för magkarcinom. N Engl J Med 325: 1127–1131.
Pu X, Song Z, Li Y, Tu P, Li H. 2003. Acteosid frånCistanchesalsa hämmar apoptos av 1-metyl-4-fenylpyridiniumjon i cerebellära granulneuroner. Planta Med 69: 65–66.
Shames B, Fox JG, Dewhirst F, Yan L, Shen Z, Taylor NS. 1995. Identifiering av utbredd Helicobacter hepaticus-infektion i avföring i kommersiella muskolonier genom odling och PCR-analys. J Clin Microbiol 33: 2968-2972.
Strate LL, Syngal S. 2005. Ärftliga kolorektalcancersyndrom. Cancer orsakar kontroll 16: 201–213.
Von Roon AC, Reese G, Teare J, Constantinides V, Darzi AW, Tekkis PP. 2007. Cancerrisken hos patienter med Crohns sjukdom. Dis Colon Rectum 50: 839–855.
Wu TF, Hsu CY, Huang HS, Chou SP, Wu H. 2007. Proteomisk analys av pycnogenoleffekter i RAW 264.7-makrofager avslöjar induktion av cathepsin D-uttryck och förstärkning av fagocytos. J Agric Food Chem 55: 9784-9791.
Wu XM, Gao XM, Tsim KW, Tu PF. 2005. En arabinogalaktan isolerad från stjälkarna avCistanchedeserticola inducerar proliferationen av odlade lymfocyter. Int J Biol Macromol 37: 278–282.
Wu XM, Tu PF. 2005. Isolation and characterization of alpha-(1-->6)-glukaner frånCistanchedeserticola. J Asian Nat Prod Res 7: 823–828.
Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. 1998. Hepatoskyddande aktivitet av fenyletanoider frånCistanchedeserticola. Planta Med 64: 120–125.
Xiong Q, Kadota S, Tani T, Namba T. 1996. Antioxidativa effekter av fenyletanoider frånCistanchedeserticola. Biol Pharm Bull 19: 1580-1585.