Hur minskar Cistanche-polysackarid melanogenes och minskar oxidativ stress?

För mer information vänligen kontakta:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola polysackarid inducerar melanogenes i melanocyter och minskar oxidativ stress

1 Institutionen för dermatologi, Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Kina

2 Institutionen för urologi, Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Kina

3Medicine Experimental Center, Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Kina

Cistanchedeserticolahar många effekter, klicka här för att veta mer

Abstrakt: Som huvuddelen av pigmenteringsrubbningar är huddepigmenteringssjukdomar som vitiligo och achromic naevus mycket vanliga och får mer uppmärksamhet nu. Patogenesen av depigmentering inkluderar dysfunktion och förlust av melanocyter, som möjligen orsakas av ärftlighet, autoimmunitet och oxidativ stress. Bland dem,oxidativ stressspelar en nyckelroll; dock kan få kliniska behandlingar hantera oxidativ stress. Som rapporterats,Cistanchedeserticola polysackarid(CDP) är en effektiv antioxidant; baserat på det utvärderade vi dess roll i melanocyter och avslöjade ytterligare mekanismerna. I denna studie fann vi att CDP kunde främja melanogenes i humana epidermala melanocyter (HEM) och musmelanom B16F10-celler, det inducerade också pigmentering i zebrafisk. Dessutom kunde CDP aktivera den mitogenaktiverade proteinkinas (MAPK) signalvägen, och sedan uppreglera uttrycket av mikroftalmiassocierad transkriptionsfaktor (MITF) och nedströms generna TYR, TRP1, TRP2 och RAB27A. Annars fann vi att CDP kunde dämpa H2O2-inducerad cytotoxicitet och apoptos i melanocyter. Ytterligare bevis visade att CDP kunde förbättra NRF2/HO-1 antioxidantvägen och ta bort intracellulär ROS. Sammanfattningsvis kan CDP främja melanogenes och förhindra melanocyter från oxidativ stressskada, vilket tyder på att CDP hjälper till att upprätthålla den normala statusen för melanocyter. Således kan CDP vara ett nytt läkemedel för behandling av depigmenteringssjukdomar.

NYCKELORD:

Cistanche deserticola polysackarid, depigmenteringssjukdom, melanocyt, melanogenes, NRF2,oxidativ stress

1. INTRODUKTION

Huddepigmenteringssjukdomar, såsom vitiligo och achromic naevus, kännetecknas av fläckvis eller omfattande huddepigmentering.1 Även om hudskador sällan orsakar allvarliga fysiska skador, påverkar de patientens utseende och skapar en allvarlig psykologisk börda, även psykiska störningar.2 stora patologiska förändringar i depigmentering inkluderar dysfunktion och förlust av melanocyter, vilket i hög grad påverkar melaninsyntesen och transporten3, vilket leder till otillräcklig ackumulering av melanin i huden.

Mekanismerna involverade i depigmentering är för närvarande okända, men studier har identifierat några relaterade faktorer. Å ena sidan beror melanocytfunktionen delvis på mikroftalmiassocierad transkriptionsfaktor (MITF), som är välkänd för att främja uttrycket av melanogenesrelaterade gener inklusive tyrosinas (TYR), tyrosinasrelaterat protein 1 (TRP1), tyrosinasrelaterat protein 2 (TRP2), ras-relaterat protein Rab-27a (RAB27A) och fascin actin-bundling protein 1 (FSCN1).4 Bland dessa gener spelar TYR en nyckelroll i melaninsyntesen genom att oxidera l-dopa till dopaquinon.5 Å andra sidan tyder studier på en kombination av flera faktorer som kan vara ansvariga för förlust av melanocyter, inklusive ärftlighet, miljö, autoimmunitet och oxidativ stress.6-9 Bland dessa faktorer anses oxidativ stress vara den viktigaste .

Mekanismerna föroxidativ stresssom orsakar depigmentering har delvis avslöjats; överbelastning av reaktiva syrearter (ROS) är en nyckelfaktor.10 ROS-överbelastning vid depigmentering innebär en obalans mellan pro- och antioxidantsystemen.11 Ett av de element som deltar i denna obalans är kärnfaktor-erytroid 2-relaterat faktor 2/antioxidantresponselement (NRF2/ARE) antioxidantvägsnedsättning.12 Vägen består av NRF2 och antioxidativa enzymer som hemoxygenas-1 (HMOX-1, HO-1) , katalas (CAT), glutationperoxidas 1 (GPX1) och NAD(P)H kinondehydrogenas 1 (NQO1).13 När melanocyter exponeras för överdriven ROS kan NRF2 translokera in i kärnan och binda till den bevarade ARE och sedan främja uttrycket av antioxidantenzymer. I vissa depigmenteringssjukdomar, såsom vitiligo, kan dock en försämrad NRF2/ARE-antioxidantväg inte effektivt eliminera ROS.14 Kliniska terapier som vanligtvis används vid depigmentering inkluderar topikala eller systemiska kortikosteroider, calcineurinhämmare, smalbandigt ultraviolett B (NBUVB; 3111) , 308-nm excimerljus, autolog epidermal transplantation och behandling av traditionell kinesisk medicin (TCM). Kortikosteroider och kalcineurinhämmare kan minska onormal immunaktivering,15 medan fototerapier används som förstahandsbehandlingar; i synnerhet stimulerar NBUVB melanocytproliferation och T-cellsdestruktion,16 medan 308-nm excimerljus inducerar apoptos av T-celler.17 Dessutom är effekterna av TCM-terapier relaterade till att främja melanogenes.18 I viss mån är dessa metoder är till hjälp för att förbättra depigmentering, men att kontrollera sjukdomsprogression är fortfarande en utmaning. Det är nödvändigt att utveckla nya terapier, särskilt för oxidativ stress, som tidigare försummades.

Cistanche deserticolaär känd som 'ökenginseng'.19 Dess komponenter är användbara vid etanol-inducerad leverskada och tarminflammatoriska hyperplasi; det kan också användas som ett reagens mot trötthet, antiinflammation och tumör.20-22 Nyligen rapporterade Guo et al.Cistanche deserticola polysackarid(CDP), en av dess huvudkomponenter, hade antioxidant och leverskyddande aktivitet20; ytterligare två studier identifierade dess roll i att skydda celler från en skada vid syre-glukosbrist/reperfusion och osteoporos-tillstånd.23,24 Emellertid har CDP:s roll vid depigmenteringssjukdomar inte klarlagts. Här syftade vi till att bekräfta om CDP coxidativ stresskan påverka melanogenesen och skydda melanocyter från oxidativ stress.

2.|MATERIAL OCH METODER

2.1|Kemikalier och antikroppar

Cistanche deserticolapolysackarid(CDP) och l-dopa köptes från Yuanye Biotec (renhet större än eller lika med 98 procent; Shanghai, Kina). Väteperoxid (H2O2), dimetylsulfoxid (DMSO), NaOH, Triton X-100, 4,5-dimetyltiazol-2-yl-2,5-difenyltetrazoliumbromid ( MTT), och ett Annexin V-FITC Apoptos Detection Kit köptes från Sigma-Aldrich. 4 procent neutral paraformaldehyd köptes från Biosharp (Hefei, Kina); och ett immunfluorescensfärgningskit (Alexa Fluor 488) och 2,7-diklorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) köptes från Beyotime Biotec (Shanghai, Kina). En Fontana-Masson Stain Kit och en Nucleoplasmic Protein Extraction Kit köptes från Sloarbio (Peking, Kina). Humant melanocyttillväxttillskott (HMGS), Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) och medium 254 köptes från Gibco. Fetalt bovint serum (FBS) köptes från BI (Kibbutz Beit-Haemek, Israel). Primära antikroppar för -aktin, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK,

p38, p-p38, NRF2 och HO-1 köptes från Cell Signaling Technology, en primär antikropp för MITF köptes från St John's Laboratory, en primär antikropp för p-MITF köptes från Affinity Biosciences, en primär antikropp för GAPDH köptes från Bioworld, och primär antikropp för TRP1 köptes från EMD Millipore.

2.2| Cellodling och behandling

Musmelanom B16F10-celler odlades i medium DMEM kompletterat med 10 procent FBS och 1 procent penicillin-streptomycin antibiotikumblandning. Humana epidermala melanocyter (HEM) separerades från mänsklig förhud (se vår tidigare studie25) och odlades i medium 254 kompletterat med HMGS, 5 procent FBS och 1 procent penicillin-streptomycin antibiotikablandning. Alla celler odlades i en våt inkubator vid 37 grader med 5 procent CO2. CDP löstes i DMSO och späddes

med medium före användning var den slutliga koncentrationen av DMSO lägre än 0,1 procent . H2O2 späddes med mediet före användning.

2.3|Odling och behandling av zebrafisk

Zebrafiskembryona och mediet köptes från EzeRinka Biotech. Det experimentella protokollet godkändes av etikkommittén vid Central South University. Zebrafisken odlades i 12-brunnsplattor vid 37 grader borta från ljus och behandlades med olika koncentrationer av CDP. Ett inverterat mikroskop användes för att observera och registrera melaninerna i zebrafiskarnas huvuden och svansar dagligen. Efter observation bytte vi medium och lade till CDP igen. Melanintätheten i svansarna på zebrafisk mättes med bild J, och värdena presenteras som integrerade optiska densiteter (IOD).

2.4| Cellviabilitet

Cellviabiliteten mättes med användning av en MTT-analys. För att undersöka cytotoxiciteten hos CDP implanterades HEM och B16F10-celler i 96-brunnsplattor med en densitet av 2 × 1{{30}}3 celler/brunn och odlades tills cellerna fästes vid plattor. Cellerna behandlades sedan med olika koncentrationer (0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 och 320 ug/ml) av CDP under 24, 48 eller 72 timmar. Före mätningen tillsattes 20 μL MTT till varje brunn och plattorna inkuberades vid 37 grader i 4 timmar. Efter det kasserade vi supernatanten och tillsatte 160 μL DMSO till varje brunn för att lösa formazankristallerna. Absorbansvärdet vid 490 nm mättes med en multimodplattläsare (PerkinElmer). För att undersöka effekten av CDP i det H2O2--inducerade cytotoxicitetstillståndet, pläterades HEMs och B16F10-celler i 96-brunnsplattor med en densitet av 4 × 103 celler/brunn. Cellerna behandlades med olika koncentrationer av CDP (0, 20, 40 eller 80 ug/ml) i 24 timmar, vid vilken tidpunkt vi tillsatte H2O2 (slutkoncentrationer: 500 μm för HEMs och 1,0 mm för B16F10-celler) till varje brunn och inkuberade cellerna i ytterligare 24 timmar. Vi satte upp CDP-behandlade och negativa kontrollgrupper (NC). Detektionsstegen var desamma som tidigare beskrivits.

2,5|NaOH-analys av melaninhalt

Cellerna odlades i {{0}} mm petriskålar och behandlades med CDP i olika koncentrationer (0, 20, 40 och 80 ug/ml) i 48 timmar, digererades sedan med trypsin och samlades i 1. 5-mL rör. Vi tvättade cellerna två gånger med dubbeldestillerat vatten, återsuspenderade dem i 1 mL etanol och vortexade dem för att frigöra melaninet. Vi centrifugerade sedan (200 g, 5 minuter) blandningen och kasserade supernatanten, tillsatte 1 ml 10 procent DMSO (utspädd med 1 mm NaOH-lösning) i varje rör och suspenderade sedimentet. Vi inkuberade suspensionen i ett vattenbad vid 80 grader i 1 timme för att lösa upp melaninet. Slutligen överförde vi 200 μL av vätskan till en 96-brunnsplatta och använde en multimode-plattläsare för att mäta absorbansvärdet vid 470 nm.

2.6|Tyrosinasaktivitetsmätningar

Cellerna odlades i {{0}}mm petriskålar och behandlades med CDP före mätning, digererades med trypsin och samlades upp i 1,5-ml rör och tvättades två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) ). Vi flyttade 106 celler från varje prov till ett nytt rör och kasserade supernatanten efter centrifugering, tillsatte sedan 1 ml 0,5 procent Triton X-100 till cellpelleten och lagrade blandning vid 0 grader i 15 minuter. Därefter tillsatte vi 1 mL l-dopa (1 mm, utspädd med 0.1 M fosfatbuffert) som substrat och blandade lösningen, flyttade 200 μL av blandningen till en 96-brunnsplatta omedelbart och mätte absorbansvärdet (A0) vid 475 nm med användning av multimode-plattläsare, upprepande av mätningen efter 10 minuter (A10). Tyrosinasaktiviteten beräknades med (A10-A0)/105, och resultaten uttrycks som en procentandel (procent) mot den negativa kontrollen.

2.7| Fontana-Masson melaninfärgning

Cellerna odlades i 12-brunnsplattor tills de uppnådde 50 procents densitet. Efter behandling fixerades cellerna med 4 procent neutral paraformaldehyd under 30 minuter och tvättades med destillerat vatten. Vi tillsatte sedan 500 μL Fontana ammoniak-silverlösning till varje brunn och lagrade plattorna i mörker i 16 timmar för att färga melaninet. Därefter tvättade vi cellerna med destillerat vatten fem gånger (1 minut varje gång) och blötlade dem i 500 μL hyposulfit i 5 minuter; slutligen tog vi bort hyposulfiten och sköljde cellerna igen med destillerat vatten i 1 minut. Vi använde sedan ett inverterat mikroskop för att observera och registrera melaninerna.

2.8|RNA-extraktion och kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion

Cellerna odlades i 6-brunnsplattor. Efter behandling digererades cellerna med trypsin och samlades upp i 1,5-mL rör. Vi tvättade cellerna två gånger med PBS, tillsatte sedan 1 ml lyseringsbuffert, vortexade blandningen och placerade rören på is i 5 minuter för att lysera cellerna helt. RNA:t extraherades med ett Total RNA Kit (Omega Bio-Tek) och omvänt transkriberades (RT) med ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). Kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (PCR) utfördes med användning av KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO). Reaktionsvolymen för RT-blandningen var 20 μL, medan reaktionsvolymen för PCR-blandningen var 20 μL (cDNA 1-8 μL, MIX 10 μL, primer F 1 μL, primer R 1 μL, tillsätt DEPC H2O till 20 μL ). Experimenten utfördes enligt protokollen. Sekvenserna för primrarna är listade i tabell S1.

2.9|Proteinextraktion och Western blotting/immunfluorescens

Cellerna odlades i 100-mm petriskålar. Efter behandling digererades cellerna med trypsin och samlades upp i 1,5-mL rör. Vi tvättade cellerna två gånger med PBS och tillsattes sedan i 500 μL RIPA-lysbuffert (Thermo Fisher) kompletterad med 1 mm fenylmetylsulfonylfluorid (Thermo Fisher) och 1:100 utspädd fosfatasinhibitorcocktail (Roche). Kärn- och cytoplasmaproteinet extraherades med användning av Nucleoplasmic Protein Extraction Kit enligt tillverkarens protokoll. Vi placerade rören på is i 30 minuter och vortexade dem var 5:e minut för att helt lysera cellerna. Vi centrifugerade cellerna (200 g, 4 grader, 15 minuter), flyttade supernatanten till ett nytt rör och mätte koncentrationen av totalt protein med hjälp av ett BCA-proteinanalyskit (KeyGEN Biotec). Vi kokade proteinerna med 5x laddningsbuffert (Beyotime Biotec, Kina) vid 100 grader i 10 minuter och lagrade dem sedan vid -80 grader. Polyakrylamidgelelektroforesmetoden (PAGE) användes i Western blotting, och 20 ug protein från varje grupp separerades och överfördes till ett polyvinylidenfluoridmembran. Efter antigenblockering inkuberade vi membranet i en 1:1000 utspädd primär antikropp i 16 timmar vid 4 grader, tvättade sedan membranet med PBST och inkuberade det i 1:10 000 utspädd fluorescerande sekundär antikropp i 1 timme vid 37 grader . Fluorescensintensiteten detekterades med användning av ett Odyssey CLx Imaging System (LI-COR). Immunofluorescens utfördes med användning av Immunofluorescence Staining Kit (Alexa Fluor

488) med en 1:100 utspädning av den primära antikroppen.

2,10|Cellapoptosmätning

Cellerna odlades i {{0}} mm petriskålar och behandlades med olika koncentrationer (0, 20, 40 och 80 ug/mL) av CDP under 24 timmar, och H2O2 tillsattes ( slutkoncentrationer: 500 μm för HEMs, 1,0 mm för B16F10-celler) till varje brunn och inkuberas i ytterligare 24 timmar. Vi sätter även upp CDP-behandlade och NC-grupper. Efter behandling smälte vi cellerna med EDTA-fritt trypsin och samlade dem i rör, tvättade sedan cellerna två gånger med PBS och återsuspenderade dem i 100 μL PBS. Cellerna färgades med ett Annexin V-FITC Apoptos Detection Kit enligt protokollet och detekterades med flödescytometri (FCM). FlowJo-mjukvaran användes för att analysera apoptoshastigheten.

2.11| Intracellulär ROS-mätning

Cellerna odlades i {{0}}brunnsplattor och behandlades med olika koncentrationer (0, 20, 40 och 80 ug/mL) av CDP under 24 timmar, till vilken vi tillsatte H2O2 (slutkoncentrationer: 500 μm för HEM,

1.0 mm för B16F10-celler) till varje brunn, inkuberade dem för en annan

24 timmar och sätta upp CDP-behandlade och NC-grupper. Efter behandling tvättade vi cellerna två gånger med PBS för att avlägsna allt medium och FBS, spädde sedan DCFH-DA-sonden till 1:1000 med medium och satte den till varje brunn. Vi inkuberade cellerna vid 37 grader i 30 minuter och tvättade dem tre gånger med ett serumfritt medium. Vi använde en

inverterat fluorescensmikroskop för att observera och registrera fluorescensen, använde sedan ImageJ för att mäta fluorescensintensiteten.

2.12|Statistik och analys

Data i detta arbete presenteras som medelvärde ± standardavvikelse (SD), och den statistiska analysen utfördes med GraphPad Prism (version 7.0) eller SPSS (version 22.0), och Students t-test eller envägsvariansanalys (ANOVA) användes för flera gruppjämförelser. Gråvärdet för WB-proteinbanden standardiserades med GAPDH eller -aktin. Värden på P < 0,05="" ansågs="" signifikanta.="" alla="" experiment="" upprepades="" minst="" tre="">

3|RESULTAT

3.1|CDP inducerade melanogenes i HEMs och B16F10-celler

Innan vi började använde vi MTT-analysen för att undersöka den potentiella cytotoxiciteten av CDP på ​​HEM och musmelanom B16F10-celler. Cellerna behandlades med CDP vid olika koncentrationer under 24, 48 eller 72 timmar. HEM-viabilitetstestning visade att när koncentrationerna var lägre än 32 0 ug/mL, hade CDP ingen inverkan på cellviabiliteten; viabiliteten minskade emellertid signifikant när koncentrationen nådde 320 ug/ml vid 24, 48 och 72 timmar (P < 0,05;="" figur="" 1a).="" viabiliteten="" för="" b16f10-celler="" minskade="" också="" vid="" 48="" och="" 72="" timmar="" när="" cdp="" nådde="" 320="" ug/ml="" (p="">< 0,01)="" men="" ingen="" förändring="" sågs="" vid="" lägre="" koncentrationer="" (figur="" ib).="" vi="" undersökte="" sedan="" preliminärt="" cdp:s="" roll="" i="" melanogenes="" och="" jämförde="" dess="" effekter="" med="" effekterna="" av="" -melanocytstimulerande="" hormon="" (-msh;="" koncentrationer:="" 20,="" 100="" och="" 400="" nm)="" och="" dmso="" (0,1="" procent)="" i="" hem.="" resultaten="" av="" melaninfärgning,="" tyrosinasaktivitet="" och="" melanininnehållsanalyser="" antydde="" att="" cdp="" var="" jämförbar="" med="" -msh="" för="" att="" främja="" melanogenes,="" medan="" 0,1="" procent="" dmso-behandling="" inte="" gjorde="" någon="" skillnad="" (figur="">

Vi förfinade vår utforskning ytterligare i enlighet med detta. HEM:erna behandlades med CDP i olika koncentrationer (20, 40 och 80 ug/ml) under 48 timmar; melaninfärgning, melaninhalt och tyrosinasaktivitetsanalyser utfördes, och alla visade signifikanta ökningar efter CDP-behandling på ett koncentrationsberoende sätt som nådde en topp i 80 ug/ml-gruppen (P < 0,05,="" figur="" 2a-c)="" .="" vi="" mätte="" sedan="" mrna-="" och="" proteinnivåerna="" för="" melanogenesrelaterade="" gener="" (mitf,="" tyr,="" trp1,="" trp2,="" rab27a="" och="" fscn1).="" cdp="" ökade="" signifikant="" mrna-nivåerna="" för="" dessa="" gener="" i="" hems="" (p="">< 0,05;="" figur="" s2a).="" dessutom="" ökade="" nivåerna="" av="" mitf-,="" tyr-,="" trp1-="" och="" rab27a-proteiner,="" liksom="" förhållandet="" mellan="" fosforylerad="" mitf="" och="" total="" mitf="" (p="">< 0,05),="" medan="" trp2="" och="" fscn1="" inte="" visade="" någon="" skillnad="" (figur="" 2d,="" e).="" resultaten="" indikerade="" att="" cdp="" kan="" främja="" melanogenes="" och="" uppreglera="" uttrycket="" av="" melanogenesrelaterade="" gener="" i="" humana="">

Dessutom återverifierade vi effekterna av CDP igen med B16F10-celler och fann att melanininnehållet i B16F10-celler ökade signifikant (P <.01; figur="" s2b).="" dessutom="" cdp="">

3.2|CDP främjade melanogenes i zebrafisk

För att undersöka om CDP kunde främjamelanogenesin vivo använde vi embryon från zebrafisk. Zebrafiskembryona delades in i fyra grupper och behandlades kontinuerligt med enbart medium (NC) eller CDP i olika koncentrationer (20, 40 och 80 ug/ml); densiteten och fördelningen av melaningranulat observerades och registrerades varje dag. När zebrafiskembryona växte, fann vi att melanintätheten gradvis ökade i huvuden och svansarna. På den 3:e dagen var skillnaderna mellan grupperna urskiljbara och skillnaden fortsatte att öka tills vi avslutade experimentet på den 6:e dagen (Figur 3A). Vi använde bild J för att mäta melanintätheten i svansarna på zebrafisk; melanintätheten i de CDP-behandlade grupperna var signifikant högre än den i kontrollgruppen (P < 0,05;="" figur="">

3.3|CDP-aktiverad MAPK-signalväg i HEMs och B16F10-celler

För att avslöja de mekanismer genom vilka CDP främjademelanogenes, behandlade vi HEM med CDP i olika koncentrationer (20, 40 och

80 ug/mL) i 48 timmar och undersökte sedan de fosforylerade och totala nivåerna av ERK-, JNK- och p38-proteinerna i MAPK-signalvägen. Såsom mätt med Western blotting ökade p-ERK-, p-JNK- och p-p38-nivåerna efter CDP-behandling (P < 0,05),="" medan="" de="" totala="" nivåerna="" av="" dem="" inte="" förändrades="" (figur="" 4a,="" b).="" experimenten="" upprepades="" med="" b16f10-celler="" och="" de="" fosforylerade="" nivåerna="" av="" erk-,="" jnk-="" och="" p38-proteinerna="" ökade="" (p="">< 0,05),="" men="" de="" totala="" mapk-nivåerna="" ändrades="" inte="" (figur="" 4c,="" d),="" i="" överensstämmelse="" med="" resultaten="" i="" hems.="">

3.4|CDP-försvagad H2O2-inducerad

cytotoxicitet och apoptos i HEMs och B16F10-celler

Vi använde H2O2 för att simuleraoxidativ stressmiljö och ytterligare utforskade CDP:s roll i melanocyter underoxidativ stress. Den slutliga koncentrationen av H2O2 som användes i HEM var 500 μm, medan den i B16F10-celler var 1,0 mm. För att undersöka effekten av CDP på ​​H2O2-inducerad cytotoxicitet förbehandlade vi HEM och B16F10-celler med CDP i olika koncentrationer (20, 40 och 80 ug/mL) i 24 timmar, tillsatte sedan H2O2 och fortsatte att behandla dem i 24 timmar innan observationen och MTT-analysen utförs.

H2O2 orsakade uppenbar membranblåsning och cellkrympning i HEM, i de CDP-förbehandlade grupperna lindrades situationen. Behandling med CDP enbart hade ingen effekt (Figur 5A). MTT-analysen visade ett liknande resultat genom att H2O2-behandling minskade HEM-viabiliteten, medan CDP signifikant förbättrade denna skadliga effekt

3,5|CDP-fångad H2O2-inducerad intracellulär ROS i HEMs och B16F10-celler

För att undersöka mekanismerna för CDP för att minska H2O2-inducerad cytotoxicitet och apoptos, upptäckte vi ytterligare den intracellulära ROS i HEMs och B16F10-celler med en DCFH-DA-fluorescens

4|DISKUSSION OCH SLUTSATSER

I denna studie undersökte vi rollen av CDP i HEMs och B16F10-celler. För första gången fann vi att CDP kunde marknadsföramelanogenesi melanocyter och främja pigmentering hos zebrafisk. Ett efterföljande experiment visade att MAPK-signalvägen aktiverades under CDP-behandling. Vi undersökte vidare dess roll ioxidativ stressoch fann att CDP kunde dämpa H2O2--inducerad cytotoxicitet och apoptos i melanocyter; Samtidigt kan CDP aktivera NRF2/HO-1 antioxidantvägen och avlägsna intracellulär ROS underoxidativ stressbetingelser.

Mitogenaktiverat proteinkinas är en viktig väg involverad i regleringen av MITF, en nyckeltranskriptionsfaktor som främjar uttrycket avmelanogenes-relaterade gener och påverkar därefter melaninsyntes och transport.26,27 I vår studie ökade aktiveringen av ERK, JNK och p38 i melanocyter signifikant efter CDP-behandling; under tiden uttrycken av MITF/p-MITF och MITF-driven TYR, TRP1, TRP2 och RAB27A

uppreglerades i enlighet med detta. Därför föreslår vi att CDP kan

främjamelanogenesvia aktivering av MAPK-vägen, men hur CDP aktiverar MAPK är fortfarande okänt. Enligt nyare studier är toll-like receptor 4 (TLR4) starkt uttryckt i melanocyter och involverad i melanogenes.28,29 TLR4 är ett viktigt transmembranprotein som specifikt kan binda lipopolysackarid (LPS)30; studier rapporterade att LPS kan inducera melanogenes.29 Intressant nog flerapolysackariderextraherad från växter eller svampar som enligt rapporter aktiveras TLR och nedströms signalvägar såsom MAPK och nukleär faktor kappa beta (NF-κB).31,32 Därför misstänker vi att CDP kan kännas igen och bindas av TLR, aktiverar sedan nedströms MAPK-signalen- ling väg och främjarmelanogenes. Dessutom är nukleotidbindande oligomeriseringsdomänliknande receptorer (NLR) kända för att känna igen intracellulära ligander och driva aktiveringen av MAPK- och NF-KB-signalvägar.33,34 Som rapporterats kan polysackarider som extraherats från Ganoderma lucidum och Astragalus komma in i celler och påverka NLR.35,36 Det är således möjligt att CDP kan komma in i melanocyter och reglera MAPK-signalvägen via NLR. Det behövs dock ytterligare studier för att verifiera denna hypotes.

Vissa studier har hittills rapporterat användningen av växtbaseradepolysackarideri melanogenes för att hämma melaninproduktion.37,38 Emellertid i denna studie främjade CDP melanogenes i

melanocyter, och denna effekt bekräftades ytterligare efter jämförelse med -MSH. CDP är också ett slagspolysackaridextraherat från örter, misstänker vi att den motsatta effekten av CDP kan vara relaterad till de strukturella skillnaderna mellan CDP och andrapolysackarider. Polysackarider bildas genom polymerisation av monosackarider men varierar i monosackaridtyp, monosackaridsammansättning, glykosidbindning, sidokedjestruktur och molekylvikt39,40; dessa faktorer tros bestämma deras biologiska funktioner.41 Befintliga studier har föreslagit strukturen för CDP och föreslagit att CDP-strukturen därefter påverkar dess funktion.42 Sålunda behövs fler bevis för att helt förstå CDP och bekräfta vår hypotes.

Melanogenes är en viktig skyddsmekanism för att göra motstånd

ultraviolett skada och upprätthålla kroppens homeostas43; samtidigt

tid, utsätts melanocyter lätt för ogynnsamma miljöer som ROS-överbelastning.11 Det är känt att ROS deltar i att främjamelanogenes, en av mekanismerna är att aktivera MAPKs.44 Men studier avslöjade också att denna effekt endast existerar inom en viss ROS-nivå, medan ROS-överbelastning försämrar melanogenesen avsevärt.45 Relationen mellan ROS, MAPK och melanogenes varierar under olika förhållanden, alltså, balansen mellan pro- och antioxidantsystem är självklart viktig. Vid depigmenteringssjukdomar som vitiligo kommer ett obalanserat antioxidantsystem och okontrollerbar ROS-överbelastning att skada melanocyter och minska cellviabiliteten.11,46 I denna studie använde vi olika koncentrationer av H2O2 för att simulera ROS-överbelastningen i celler, och HEM visade sämre tolerans mot H2O2 än B16F10-celler. När melanocyter utsattes för H2O2-behandling blev deras livsduglighet och apoptoshastighet sämre, men

CDP-förbehandling kan delvis vända trenden. Samtidigt rensades ROS. Som rapporterats är aktivering av NRF2/ARE-antioxidationsvägar en viktig metod för ROS-rening i hudceller.14 I våra experiment uppreglerades proteinnivåerna av NRF2 och HO-1 i melanocyter efter H2O2-behandling utan CDP; detta betyder att H2O2-inducerasoxidativ stresskan aktivera NRF2/HO-1-vägen, men den är otillräcklig för att upprätthålla en redoxbalans och skydda cellen från skador. CDP-förbehandling förbättrade emellertid NRF2/HO-1-antioxidationsvägen och återställde balansen. Således föreslår vi att CDP kan skydda melanocyter från oxidativ stressskada genom att aktivera NRF2/HO-1 antioxidationsvägen och rensa ROS.

Vi fann att CDP-behandling enbart inte har någon inverkan på ROS eller NRF2/HO-1 i melanocyter. Detta resultat tyder på att CDP kan påverka redoxbalansen under oxidativ stress, men inte normala förhållanden. Dessutom regleras antioxidationsvägen NRF2/HO-1 av signalvägarna PI3K, NF-KB och MAPK.47,48 I vår studie kunde CDP aktivera MAPK-signalvägen. Det är möjligt att CDP kan aktivera NRF2/HO-1-vägen via uppreglerande MAPK:er. Som Slominski rapporterade är melanocyter stresssensorer involverade i ett regulatoriskt nätverk, och deras funktioner kan förändras snabbt som svar på miljön.49 Vi föreslår att CDP:s roll påverkas av melanocyternas status, det kan främja melanogenes utan att påverka antioxidanten. system under normala förhållanden men återställ redoxbalansen underoxidativ stressbetingelser. Därför kan melanocytfunktionen och överlevnaden upprätthållas på två olika sätt av CDP. CDP hjälper melanocyter att upprätthålla homeostas, vilket också är en viktig funktion av melanogenes.50,51

Sammanfattningsvis kan CDP främjamelanogenesav melanocyter

via aktivering av MAPK-signalvägen. CDP kan förbättra melanocytöverlevnaden genom att aktivera NRF2/HO-1 antioxidantvägen och avlägsna intracellulär ROS under oxidativ stress. Våra resultat är meningsfulla eftersom de visar att CDP både kan främjamelanogenesoch skydda melanocyter frånoxidativ stressskada, som möjligen är ansvarig för melanocytdysfunktion och förlust. Resultaten av denna studie indikerar att CDP kan vara ett nytt läkemedel vid behandling av depigmenteringssjukdomar.

TACK

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 81703101), New Xiangya Talent Projects of Third Xiangya Hospital of Central South University (nr JY201623 och nr 20170301), Natural Science Foundation of Hunan Province ( nr. 2018JJ3788 och nr. 2018JJ3793) och Project of Hunan hälsokommission (nr. C2019173). Dr Yibo Hu utförde huvuddelen av studien och skrev manuskriptet; Professor Jing Chen och Qinghai Zeng designade studien och vägledde manuskriptskrivningen; Professor Jinhua Huang, Lihua Huang och Hong Xiang gav tekniskt stöd och analyserade data; Dr. Yixiao Li, Ling Jiang, Yujie Ouyang, Yumeng Li, Lun Yang och Xiaojiao Zhao bidrog till en del av experimenten.

INTRESSEKONFLIKT

Författarna bekräftar att det inte finns några intressekonflikter.

DATA TILLGÄNGLIGHET

Data som stöder resultaten av denna studie är tillgängliga från motsvarande författare på rimlig begäran.

REFERENSER

1. Bleuel R, Eberlein B. Terapeutisk hantering av vitiligo. J Dtsch Dermatol Ges. 2018;16:1309-1313.

2. Taieb A, Meurant JM. Ska vi prioritera psykologiska ingrepp i hanteringen av vitiligo? J Eur Acad Dermatol Venereol. 2018;32:2053-2054.

3. Picardo M, Dell'Anna ML, Ezzedine K, et al. Vitiligo. Nat Rev Dis Primers. 2015;1:15011.

4. Slominski A, Tobin DJ, Shibahara S, Wortsman J. Melaninpigmentering i däggdjurshud och dess hormonella reglering. Physiol Rev. 2004;84:1155-1228.

5. Slominski A, Zmijewski MA, Pawelek J. L-tyrosin och L-dihydroxifenylalanin som hormonliknande regulatorer av melanocytfunktioner. Pigment Cell Melanoma Res. 2012;25:14-27.

6. Spritz RA. Delade genetiska samband som ligger bakom generaliserad vitiligo och autoimmun sköldkörtelsjukdom. Sköldkörteln. 2010;20:745-754.

7. Lin X, Tang LY, Fu WW, Kang KF. Barndomsvitiligo i Kina: kliniska profiler och immunologiska fynd i 620 fall. Am J Clin Dermatol. 2011;12:277-281.

8. Boehncke WH, Brembilla NC. Autoreaktiva T-lymfocyter vid inflammatoriska hudsjukdomar. Front Immunol. 2019;10:1198.

9. Iannella G, Greco A, Didona D, et al. Vitiligo: Patogenes, kliniska varianter och behandlingsmetoder. Autoimmun Rev. 2016;15:335-343.

10. Forrester SJ, Kikuchi DS, Hernandes MS, et al. Reaktiva syrearter i metabolisk och inflammatorisk signalering. Circ Res. 2018;122:877-902.

11. Denat L, Kadekaro AL, Marrot L, et al. Melanocyter som anstiftare och offer för oxidativ stress. J Invest Dermatol. 2014;134:1512-1518.

12. Qiu L, Song Z, Setaluri V. Oxidativ stress och vitiligo: Nrf2-ARE

signaleringsanslutning. J Invest Dermatol. 2014;134:2074-2076.

13. Hayes JD, Dinkova-Kostova AT. Nrf2 regulatoriska nätverk ger ett gränssnitt mellan redox och intermediär metabolism. Trender Biochem Sci. 2014;39:199-218.

14. Marrot L, Jones C, Perez P, Meunier JR. Betydelsen av Nrf2

väg i (foto)-oxidativ stressrespons i melanocyter och keratinocyter i den mänskliga epidermis. Pigment Cell Melanoma Res. 2008;21:79-88.

15. van Geel N, Speeckaert R, Mollet I, et al. In vivo vitiligo-induktion och terapimodell: en dubbelblind, randomiserad klinisk prövning. Pigment Cell Melanoma Res. 2012;25:57-65.

16. Nicolaidou E, Antoniou C, Stratigos A, Katsambas AD. Smalband ultraviolett B-fototerapi och 308-nm excimerlaser vid behandling av vitiligo: en recension. J Am Acad Dermatol. 2009;60:470-477.

17. Novak Z, Bonis B, Baltas E, et al. Xenonklorid ultraviolett B-laser

är effektivare vid behandling av psoriasis och för att inducera T-cellapoptos än smalbandig ultraviolett B. J Photochem Photobiol B Biol. 2002;67:32-38.

18. Xu P, Su S, Tan C, et al. Effekter av vattenhaltiga extrakt av Eclipse herba, Polygoni multiflora radix-preparator och Rehmanniae radix-preparator på melanogenes och migration av mänskliga melanocyter. J Etnopharmacol. 2017;195:89-95.

19. Wang T, Zhang X, Xie W.Cistanche deserticolaYC Ma, "Desertginseng": en recension. Am J Chin Med. 2012;40:1123-1141.

20. Guo Y, Cao L, Zhao Q, et al. Preliminära karakteriseringar, antioxidant och leverskyddande aktivitet avpolysackaridfrånCistanche deserticola. Int J Biol Macromol. 2016;93:678-685.

21. Cai RL, Yang MH, Shi Y, et al. Antitrötthetsaktivitet av fenyletanoidrikt extrakt frånCistanche deserticola. Phytother Res. 2010;24:313-315.

22. Zhang H, Xiang Z, Duan X, et al. Antitumör och antiinflammatoriska effekter av oligosackarider frånCistanche deserticolaextrakt vid ryggmärgsskada. Int J Biol Macromol. 2019;124:360-367.

23. Liu Y, Wang H, Yang M, et al.Cistanche deserticola polysackariderskydda PC12-celler mot OGD/RP-inducerad skada. Biomed Pharmacother. 2018;99:671-680.

24. Song D, Cao Z, Liu Z, et al.Cistanche deserticola polysackariddämpar osteoklastogenes och benresorption genom att hämma RANKL-signalering och produktion av reaktiva syrearter. J Cell Physiol. 2018;233:9674-9684.

25. Fu C, Chen J, Lu J, et al. Nedreglering av TUG1 främjar melanogenes och UVB-inducerad melanogenes. Exp Dermatol. 2019;28:730-733.

26. Johannessen CM, Johnson LA, Piccioni F, et al. Ett program för melanocythärstamning ger resistens mot hämning av MAP-kinasvägar. Natur. 2013;504:138-142.

27. Vachtenheim J, Borovansky J. "Transkriptionsfysiologi" av pigmentbildning i melanocyter: central roll för MITF. Exp Dermatol. 2010;19:617-627.

28. Yu N, Zhang S, Zuo F, et al. Odlade humana melanocyter uttrycker funktionella tollliknande receptorer 2–4, 7 och 9. J Dermatol Sci. 2009;56:113-120.

29. Ahn JH, Park TJ, Jin SH, Kang HY. Humana melanocyter uttrycker funktionell Toll-liknande receptor 4. Exp Dermatol. 2008;17:412-417.

30. Reed SG, Carter D, Casper C, et al. Korrelat av GLA-familjens adjuvansaktiviteter. Semin Immunol. 2018;39:22-29.

31. Guo MZ, Meng M, Feng CC, et al. En novellpolysackariderhållen från Craterellus cornucopioides förbättrar immunmodulerande aktivitet i immunsuppressiva mössmodeller via reglering av TLR4-NF-kappaB-vägen. Matfunktion. 2019;10(8):4792-4801.

32. Wei W, Xiao HT, Bao WR, et al. TLR-4 kan förmedla signalvägar för AstragaluspolysackaridRAP inducerade cytokinuttryck av RAW264.7-celler. J Etnopharmacol. 2016;179:243-252.

33. Chen H, Yang D, Han F, et al. Den bakteriella T6SS-effektorn EvpP förhindrar NLRP3-inflammasomaktivering genom att hämma den Ca(2 plus )-beroende MAPK-Jnk-vägen. Cellvärd mikrob. 2017;21:47-58.

34. Levy M, Shapiro H, Thaiss CA, Elinav E. NLRP6: en mångfacetterad in-Nate immunsensor. Trender Immunol. 2017;38:248-260.

35. Chen YS, Chen QZ, Wang ZJ, Hua C. Antiinflammatoriska och hepatoprotektiva effekter av Ganoderma lucidumpolysackaridermot koltetraklorid-inducerad leverskada hos Kunming-möss. Farmakologi. 2019;103:143-150.

36. Tian Z, Liu Y, Yang B, et al. Astragaluspolysackariddämpar murin kolit genom hämning av NLRP3-inflammasomen. Planta Med. 2017;83:70-77.

37. Jiang L, Huang J, Lu J, et al. Ganoderma lucidumpolysackaridminskar melanogenes genom att hämma de parakrina effekterna av keratinocyter och fibroblaster via IL-6/STAT3/FGF2-vägen. J Cell Physiol. 2019;234:22799-22808.

38. Cai ZN, Li W, Mehmood S, et al. Effekten avpolysackaridFMP-1 från Morchella esculenta om melanogenes i B16F10-celler och zebrafisk. Matfunktion. 2018;9:5007-5015.

39. Zhang C, Li Z, Zhang CY, et al. Molekylära egenskaper och bioaktiviteter avpolysackariderfrån alfalfa (Medicago sativa L.). Näringsämnen. 2019;11:1181.

40. Coconi Linares N, Di Falco M, Benoit-Gelber I, et al. Närvaron av spårkomponenter breddar avsevärt det molekylära svaret hos Aspergillus niger på guargummi. Ny bioteknik. 2019;51:57-66.

41. Ma H, Zhang K, Jiang Q, et al. Karakterisering av växtpolysackariderfrån Dendrobium officinale genom multipla kromatografiska och masspektrometriska tekniker. J Chromatogr A. 2018;1547:29-36.

42. Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. Strukturell karakterisering och immunologisk aktivitet av två kallvatten extraherbarapolysackariderfrånCistanche deserticolaYC Ma. Carbohydr Res. 2007;342:1343-1349.

43. Slominski AT, Zmijewski MA, Plonka PM, et al. Hur UV-ljus berör hjärnan och det endokrina systemet genom huden, och varför. Endokrinologi. 2018;159:1992-2007.

44. Schalke S. Nya data om hyperpigmenteringsstörningar. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2017;31(Suppl 5):18-21.

45. Glassman SJ. Vitiligo, reaktiva syrearter och T-celler. Clin Sci. 2011;120:99-120.

46. ​​Ristow M. Att reda ut sanningen om antioxidanter: mitohormesis förklarar ROS-inducerade hälsofördelar. Nat Med. 2014;20:709-711.

47. Balogun E, Hoque M, Gong P, et al. Curcumin aktiverar hemoxygenas-1-genen via reglering av Nrf2 och det antioxidantreagerande elementet. Biochem J. 2003;371:887-895.

48. Paine A, Eiz-Vesper B, Blasczyk R, Immenschuh S. Signaling to

hemoxygenas-1 och dess antiinflammatoriska terapeutiska potential.

Biochem Pharmacol. 2010;80:1895-1903.

49. Slominski A, Paus R, Schadendorf D. Melanocyter som "sensoriska" och regulatoriska celler i epidermis. J Theor Biol. 1993;164:103-120.

50. Slominski RM, Zmijewski MA, Slominski AT. Melaninpigmentets roll i melanom. Exp Dermatol. 2015;24:258-259.

51. Slominski A, Kim TK, Brozyna AA, et al. Melanogenes roll i regleringen av melanombeteende: melanogenes leder till stimulering av HIF-1alfa-uttryck och HIF-beroende åtföljande vägar. Arch Biochem Biophys. 2014;563:79-93.