Hur spelar de aktiva ingredienserna i Cistanche Tubulosa en roll vid Alzheimers sjukdom?

JIANHUA YANG1*, BOWEI JU1,2*, YAO YAN1, HUANHUAN XU1, SHANSHAN WU1, DANDAN ZHU1, DANDAN CAO1 och JUNPING HU2

Abstrakt.Den föreliggande studien syftade till att undersöka de neuroprotektiva effekterna avfenyletanoidglykosider(PhGs) på H2O2- och -amyloidpeptid (A)1-42-inducerad skada på PC12-celler som en in vitro-modell avAlzheimers sjukdom (AD). De optimala induktionsbetingelserna etablerades genom screening av olika inkubationstider och -koncentrationer. PC12-celler behandlades med 0.5 µM A 1-42 och H2O2 i närvaro av PhGs under 24 timmar och cellviabiliteten utvärderades sedan med en MTT-analys; frisättning av laktatdehydrogenas (LDH) och innehåll av malondialdehyd (MDA) mättes också. De optimala förutsättningarna för att etableraADmodell var behandlingen av PC12-celler med 0.5 µM A 1-42 under 48 timmar, eller med 25 µM H2O2 löst i DMEM med PBS. PhG vid koncentrationer på 5, 25 och 50 µg/ml ökade livsdugligheten och minskade LDH- och MDA-frisättning av PC12-celler skadade med A 1-42 eller H2O2. Sammanfattningsvis har modellen för A 1-42- och H2O2-inducerad PC12-cellskada framgångsrikt etablerats. PhG visades ha en signifikant neuroprotektiv effekt mot A 1-42- eller H2O2-inducerad cellskada.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cistanche tubulosa har många effekter, klicka här för att veta mer

Introduktion

Alzheimers sjukdom (AD), en neurodegenerativ störning med de kliniska egenskaperna progressiv minnesförlust och kognitiv funktionsnedsättning (1), är den vanligaste orsaken till demens i världen (2). De finansiella kostnaderna är enorma på grund av förekomsten av AD (3). Därför är det angeläget att utveckla lämpliga medel för att hantera och förebyggaAD.

Patogenesen avADär nära förknippad med ansamling av neurofibrillära trassel och senila plack (SP) i drabbade hjärnregioner (4,5). -amyloidpeptid (A ), huvudkomponenten i SP, har rapporterats ha en orsakande roll i utvecklingen avADsom har en toxisk effekt på neuronala celler (6). A-fragment, inklusive A 1-40, A 25-35 och A 1-42, har genererats genom uppdelningen av amyloidprekursorprotein (7). Neurotoxiciteten för A 1-42 visade sig vara betydligt högre än den för A 25-35 och A 1-40, och A 1-42 kan inducera enADmodell (1,8-10). Oxidativ stress kan vara involverad i patogenesen avADoch är den huvudsakliga mekanismen bakom A-inducerad neurotoxicitet (11-13). Flera studier antydde att A 1-42 orsakade intracellulär ackumulering av reaktiva syrearter (ROS), vilket ledde till lipid- och proteinoxidation, DNA-skada och aktivering av cellcykelkontrollpunktsignalering (1,14,15). För stora mängder H2O2 kan leda till oxidativ skada och inducera apoptos av PC12-celler (16). Därför kan inriktning på oxidativ stress vara ett lovande tillvägagångssätt för utveckling av terapeutiska strategier för att hämma A-inducerad neurotoxicitet i AD.

Herba (H.)Cistanche, en kinesisk örtmedicin som vanligen används i Kina för att ge näring till njurarna och fylla på essens och blod, har använts för att behandla minnesförlust och senil förstoppning (17). Fenyletanoidglykosid (PhG), en av huvudbeståndsdelarna i H.Cistanche, förbättrar försämringen av neuronal apoptos orsakad av A 25-35 via dess antioxidanteffekter (18,19). En tidigare studie identifierade fem huvudkomponenter från totalt PhG, nämligenakteosid2'-acetylakteosid,echinakosidcistanosider och isoakteosid (20). Bland dessa komponenter,akteosidochechinakosidhar rapporterats ha neuroprotektiva effekter på A 25-35- eller H2O2-inducerad neurotoxicitet (21-23). Till exempel föreslog Wu et al (24) att acteosid ochechinakosid

Nyckelord:fenyletanoidglykosider, PC12-celler, H2O2, -amyloidpeptid1-42, neuroskydd, cistanche

Material och metoder

Förberedelse av PhG. Totala PhGs extraherades från H.Cistanchesom tidigare beskrivits (25). Den lufttorkade stammen av H.Cistanchepulveriserades och extraherades genom perkolering med 80 procent EtOH. Perkolatet indunstades under reducerat tryck, följt av återsuspension i en lämplig mängd H2O2 (1{{20}}0 µmol/l). Blandningen isolerades på en SP-825 makroporös hartskolonn (Mitsubishi Chemical, Tokyo, Japan) och eluerades med 0, 30, 50, 70 och 90 procent EtOH i vatten. För att erhålla den PhG-rika fraktionen koncentrerades 30-50 procent EtOH-eluenter och torkades under reducerat tryck. Ultraviolett (UV) spektrofotometri utfördes för att bestämma den totala PhGs. Innehållet av echinakosid och akteosid bestämdes med högtrycksvätskekromatografi enligt ett tidigare protokoll (26). En Hypersil ODS-2-kolonn (4,6x250 mm, 5 µm; Dalian Elite Analytical Instruments, Co., Ltd., Dalian, Kina) användes och hölls vid rumstemperatur. De mobila faserna var metylcyanider och vatten innehållande 0,4 procent fosforsyra (v/v; Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland). Flödeshastigheten var 0,75 ml/min och våglängden inställdes på 333 nm.

Cellodling och läkemedelsbehandling. PC12 råttfeokromocytomcellinjen tillhandahölls av Dr He Chunhui, Medical School, Xinjiang Medical University (Urumqi, Kina). Celler odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium med hög glukoshalt (DMEM; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) innehållande 10 procent fetalt bovint serum (Sangon Biotech Co. Ltd., Shanghai, Kina) , 100 U/ml penicillin och 100 U/ml streptomyciner i en inkubator vid 37˚C innehållande 5 procent CO2 och 95 procent luft. Efter att ha nått 80 procent sammanflöde behandlades cellerna med 0,25 procent trypsin och passerades.

För att eliminera störningen av läkemedlet i sig på tillväxten av PC12-celler, utfördes ett toxicitetsexperiment. I korthet såddes PC12-celler (3x104 celler/ml) i 96-brunnsplattor med 100 µl/brunn och inkuberades vid 37˚C över natten. Efter att ha kasserat supernatanten tillsattes 200 µl komplett DMEM i blankgruppen, medan celler i interventionsgrupperna behandlades med PhGs i olika doser (5, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 och 200 µg/ ml). Efter inkubation av cellerna vid 37˚C i 48 timmar tillsattes 20 µl MTT-lösning (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) till varje brunn. Efter inkubation under 4 timmar kasserades supernatanten och 150 ul dimetylsulfoxid tillsattes per brunn, följt av omrörning i 10 minuter. Värdena för optisk densitet (OD) vid 490 nm detekterades med användning av en ELISA-plattläsare.

En 1-42-inducerad PC12-cellskada. En 1-42-peptid köpt från Bioss Biotech (Beijing, Kina) löstes i vatten (100 µg/ml). Därefter inkuberades blandningen vid 37°C i 4 dagar och lagrades vid 4°C före användning.

PC12-celler såddes i 96-brunnsplattor (3xl04 celler i 100 µl per brunn). Efter odling i 24 timmar för vidhäftning tillsattes 50 µl A 1-42 vid olika slutkoncentrationer (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5 eller 2 µM) löst i serumfritt DMEM, följt av inkubation i 24, 48, 72 eller 96 timmar. Cellviabiliteten utvärderades med en MTT-analys. Den optimala A 1-42-koncentrationen var 0,5 fastställd till µM.

PC12-celler (3xl04 celler per brunn) behandlades med olika doser av PhG (0, 0.5, 5, 25 eller 50 µg/ml) i närvaro av 0,5 µM A 1-42 i 24 timmar. Cellviabiliteten utvärderades med en MTT-analys.

H2O2-inducerad PC12-cellskada. PC12-celler ströks ut sådda i 96-brunnsplattor (3xl04 celler i 100 µl per brunn). Efter odling i 24 timmar för vidhäftning tillsattes 100 µl H2O2 i olika slutkoncentrationer (0, 25, 50, 100, 200, 300, 400 och 500 µM) löst i DMEM med eller utan PBS (0,01 mol/l), följt av inkubation i 24 timmar. Cellviabiliteten utvärderades med en MTT-analys. Den optimala H2O2-koncentrationen och lösningsmedlet bestämdes för att etablera in vitro-modellen av AD.

PC12-celler (3xl04 celler per brunn) behandlades med olika doser av PhG (0, 0,5, 5, 25 och 50 µM). Efter odling i 24 timmar för vidhäftning, behandlades PC12-celler med 100 µl H2O2 löst i DMEM med PBS i närvaro av PhGs i 24 timmar. Cellviabiliteten utvärderades med en MTT-analys.

Laktatdehydrogenas (LDH) frisättningsanalys. Cellskada utvärderades genom att mäta LDH-aktiviteten i supernatanten av PC12-celler med användning av ett LDH-kit enligt tillverkarens protokoll (kat. nr. 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kina). I korthet tillsattes dubbeldestillerat H2O, 0,2 µmol/ml pyrodruvsyra, matrisbuffert och koenzym I-buffert i sekvens 48 timmar efter läkemedelsbehandling. Efter inkubation vid 37˚C i 15 minuter tillsattes 2,4-dinitro-fenylhydrazin. Därefter tillsattes 250 ul av en 0,4 M NaOH-lösning till varje brunn. Supernatanten uppsamlades efter inkubation under 30 minuter vid rumstemperatur. Absorbansen vid 450 nm mättes sedan med en mikroplattläsare.

Mätning av malondialdehyd (MDA). MDA mättes i supernatanten av PC12-celler med användning av ett kommersiellt kit (kat.nr 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) enligt tillverkarens protokoll. Kortfattat tillsattes dehydrerad alkohol och andra reagens i ordning, följt av inkubation i ett vattenbad vid 95˚C i 40 min. Blandningen centrifugerades vid 1 006 xg och 25°C under 10 minuter efter kylning. Supernatanten användes sedan för att bestämma MDA-halten. Absorbansen mättes därefter med en mikroplattläsare vid 532 nm.

Bedömning av skyddande effekter av echinakosid och acteosid mot AD in vitro. PC12-celler såddes med en densitet av 3xl 04 celler/brunn i 96-brunnsplattor (100 µl/brunn). Celler inkuberades med läkemedel inklusive echinakosid (kat. nr. 111670-200503; National Institutes for Food and Drug Control, Peking, Kina) och acetonid (kat. nr. 111530-200505; National Institutes for Food and Drug Control ) vid olika koncentrationer (0,5, 25 och 50 µg/ml). Därefter behandlades cellerna med A 1-42 eller H2O2 i 24 timmar och cellviabiliteten mättes med en MTT-analys.

Statistisk analys. Värden uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse. Elevens t-test användes för jämförelser mellan grupper. Statistiska analyser utfördes med SPSS 18.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Resultat

Kvantifiering av PhG från H. Cistanches. UV-spektra avPhGsextraheras samt standardlösningar avechinakosidochakteosidregistrerades och resultaten visade att UV-spektra var konsekventa (Fig. 1). UV-spektrofotometri

visade att PhG-halten var 87,6 procent. HPLC-resultaten visade att halten av echinakosid och akteosid var 37,7 respektive 17,8 procent (fig. 2).

Bestämning av den ideala PhG-koncentrationen. Jämfört med blankgruppen hade PhG vid 75, 100, 125, 150, 175 och 200 µg/ml en signifikant hämmande effekt på PC12-celler (P<0.05), while="" phg="" at="" 5,="" 25="" and="" 50="" µg/ml="" showed="" low="" toxicity="" on="" pc12="" cells,="" and="" the="" cell="" viability="" was="">80 procent (fig. 3). Således användes PhG i koncentrationerna 5, 25 och 50 µg/ml för behandling av PC12-celler i efterföljande experiment på grund av att cellviabiliteten inte påverkades.

En 1‑42‑inducerad PC12-cellskada. Jämfört med den i kontrollgruppen var cellviabiliteten i skadegruppen 0.5 µM A 1-42 63 procent (P<0.05). the="" cell="" viability="" was="" decreased="" by="" aβ1-42="" in="" a="" concentration-dependent="" manner,="" and="" the="" viability="" was=""><50% in="" the="" 1,="" 1.5,="" and="" 2="" µm="" aβ1-42="" injury="" groups="" (fig.="" 4).="" thus,="" treatment="" with="" 0.5="" µm="" aβ1-42="" for="" 48="" h="" was="" determined="" to="" be="" the="" optimal="" condition="" for="" establishing="" the="" in="" vitro="" ad="">

Aktiviteten hos PC12-celler behandlade med 0.5 µM A 1-42 i närvaro av säkra doser av PhGs (5, 25 och 50 µg/ml) under 24 timmar bestämdes också. Jämfört med modellgruppen (P<0.01), phgs="" showed="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" rescued="" by="" phgs="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="">

H2O2-inducerad PC12-cellskada. Viabiliteten för PC12-celler behandlade med 25 µM H2O2 löst i DMEM med PBS var 56,43 procent. Viabiliteten för PC12-celler behandlade med 200 µM H2O2 löst i DMEM utan PBS var 71,64 procent (tabell I). Således valdes PC12-celler behandlade med 25 µM H2O2 löst i DMEM med PBS som det optimala villkoret för att etablera AD-modellen.

Jämfört med kontrollgruppen var cellviabiliteten i modellgruppen 48,8 procent (P<0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" phgs="" had="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" dose-dependently="" increased="">

PhGs och livsdugligheten för PC12-celler behandlade med PhG vid koncentrationer av 5, 25 och 50 µg/ml var 54, 57 respektive 64 procent (tabell II).

PhGs hämmar skadeinducerad LDH-frisättning av PC12-celler. Jämfört med kontrollgruppen ökade LDH-innehållet i supernatanten av skadade PC12-celler, vilket hämmades av PhGs på ett koncentrationsberoende sätt. Detta resultat indikerade att PhGs har en signifikant neuroprotektiv effekt på PC12-celler (Fig. 6).

Tabell I. Cellviabilitet (procent) efter H2O2-behandling.

Tabell II. Cellviabilitet efter läkemedelsinterferens.

hämmas av PhGs på ett koncentrationsberoende sätt. Detta resultat indikerade att PhG har en signifikant neuroprotektiv effekt på PC12-celler (Fig. 7).

PhG och dess komponenter echinacoside och acteosid räddar livsdugligheten hos skadade PC12-celler. Jämfört med modellgruppen ökade behandling med akteosid signifikant livsdugligheten för A 1-42-skadade PC12-celler på ett dosberoende sätt. PhG och echinakosid ökade också signifikant livsdugligheten för A 1-42-skadade PC12-celler vid alla testade koncentrationer (Fig. 8A).

**P<0.05, vs.="" model="" group.="" aβ,="" â-amyloid="" peptide;="" phgs,="" phenylethanoid="" glycosides;="" ech,="" echinacoside;="" as,="">

Jämfört med modellgruppen ökade acteosid signifikant livsdugligheten för PC12-celler behandlade med H2O2. PhG ökade också livsdugligheten för PC12-celler behandlade med H2O2, medan effekten inte var signifikant vid koncentrationer på 5 och 25 µg/ml (Fig. 8B). Dessutom ökade echinakosid cellviabiliteten vid 25 µg/ml.

Sammanfattningsvis utövade akteosid, PhG och echinakosid betydande neuroprotektiva effekter på PC12-celler utsatta för skada med A 1-42 eller H2O2.

Diskussion

Oxidativ stress är den huvudsakliga mekanismen bakom A-medierad neurotoxicitet i AD (11-13). Därför kan inriktning på oxidativ stress representera ett tillvägagångssätt för behandling av AD. I den föreliggande studien etablerades framgångsrikt en in vitro-modell av AD innefattande A 1-42- och H2O2-inducerad PC12-cellskada. Resultaten av MTT-, LDH- och MDA-analyserna visade att PhG ökade cellviabiliteten och minskade LDH- och MDA-frisättning av PC12-celler utsatta för skada. Man kan dra slutsatsen att PhG har betydande neuroprotektiva effekter på PC12-celler.

För att minska effekterna av PhGs själva på PC12-celltillväxt och förhindra onormal proliferation, bestämdes den säkra dosen av PhGs i en screeninganalys. Resultaten visade att PhG vid 75, 100, 125, 150, 175 och 200 µg/ml hade en signifikant hämmande effekt på PC12-celler (P<0.05,><0.01), while="" cell="" viability="" remained="">80 procent vid koncentrationer av 5, 25 och 50 µg/ml. Således var PhG vid koncentrationen 5, 25 och 50 µg/ml säkra för PC12-celler.

Skadan av A {{0}} påverkades av vissa faktorer, inklusive lösningsmedlet, inkubationstid och produktkvalitet. I föreliggande studie löstes en 1-42-peptid i vatten (100 µg/ml) och inkuberades vid 37˚C i 4 dagar i en CO2-inkubator före användning. PC12-celler behandlades med A 1-42 i koncentrationer av 0,5, 1, 1,5 och 2 µM. Resultaten visade att cellviabiliteten minskade med ökningen av A 1-42, och viabiliteten var<50% in="" the="" 1,="" 1.5,="" and="" 2="" µm="" aβ1-42="" injury="" groups.="" thus,="" treatment="" of="" pc12="" cells="" with="" 0.5="" µm="" aβ1-42="" for="" 48="" h="" was="" determined="" to="" be="" the="" optimal="" condition="" for="" establishing="" the="" ad="" model.="" aβ25-35="" has="" been="" commonly="" used="" to="" establish="" ad="" models="" due="" to="" its="" low="" cost="" and="" simple="" operation="" (27-29).="" the="" neurotoxicity="" of="" aβ1-42="" is="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" aβ25-35,="" and="" aβ1-42="" is,="" therefore,="" the="" optimal="" aβ="" fragment="" for="" establishing="" an="" ad="" model="">

H2O2 är ett oxidationsmedel och för mycket H2O2 kan orsaka oxidativ skada och inducera cellapoptos (30). I föreliggande studie behandlades PC12-celler med 25-500 µM H2O2 löst i DMEM med eller utan PBS. Resultaten visade att H2O2 löst i DMEM utan PBS orsakade en onormal proliferation av PC12-celler. Således var behandling av PC12-celler med 25 µM H2O2 löst i DMEM med PBS det optimala villkoret för att etablera AD-modellen. Den 1-42-inducerade skadan var större än H2O2-inducerad skada på grund av dålig stabilitet hos H2O2 och lösningsmedelseffekter.

När cellen är skadad ökar LDH-läckaget in i odlingsmediet avsevärt. ROS är känt för att orsaka produktion av MDA. Innehållet av MDA och LDH återspeglar därför mängden oxidativ skada. I den aktuella studien minskade skadeinducerad LDH- och MDA-aktivitet med ökande doser av PhG. Dessa resultat indikerade att PhGs har en signifikant neuroprotektiv effekt på PC12-celler. MTT-analysen visade att PhGs uppvisade en dosberoende neuroprotektiv effekt på PC12-celler.

Sammanfattningsvis har en in vitro-modell av AD som omfattar A 1-42- och H2O2-inducerad PC12-cellskada framgångsrikt etablerats. Behandling med PhG ökade cellviabiliteten och minskade LDH- och MDA-frisättning av PC12-celler behandlade med A 1-42 eller H2O2. PhGs hade en signifikant neuroprotektiv effekt på A 1-42- eller H2O2-inducerad cellskada.

Referenser

1. Qu M, Zhou Z, Xu S, Chen C, Yu Z och Wang D: Mortalin-överuttryck dämpar beta-amyloid-inducerad neurotoxicitet i SH-SY5Y-celler. Brain Res 1368: 336-345, 2011.

2. Uzun S, Kozumplik O och Folnegović-Small V: Alzheimers demens: aktuell dataöversikt. Collegium antropologicum 35: 1333-1337, 2011.

3. Brookmeyer R, Johnson E, Ziegler-Graham K och Arrighi HM: Prognostisering av den globala bördan av Alzheimers sjukdom. Alzheimers och demens 3: 186-191, 2007.

4. Castellani RJ, Rolston RK och Smith MA: Alzheimers sjukdom. Sjukdom per månad 56: 484-546, 2010.

5. Mattson MP: Vägar mot och bort från Alzheimers sjukdom. Nature 430: 631-639, 2004.

6. Goura GK, Tsai J, Naslund J, et al: Intraneuronal A 42 ackumulering i mänsklig hjärna. The American journal of pathology 156: 15-20, 2000.

7. Shen C, Chen Y, Liu H, et al: Väteperoxid främjar A-produktion genom JNK-beroende aktivering av -sekretas. Journal of Biological Chemistry 283: 17721-17730, 2008.

8. Shih PH och Wu CH, Yeh CT och Yen GC: Skyddande effekter av antocyaniner mot amyloid-peptid-inducerad skada i neuro-2A-celler. Journal of agricultural and food chemistry 59: 1683-1689, 2011.

9. Figueiredo CP, Bicca MA, Latini A, Prediger R, Medeiros R och Calixto JB: Folsyra plus -tokoferol mildrar amyloid- -inducerad neurotoxicitet genom modulering av mitokondriella komplexaktivitet. Journal of Alzheimers disease: JAD 24: 61-75, 2010.

10. Dumont M, Lin MT och Beal MF: Mitokondrier och antioxidantinriktade terapeutiska strategier för Alzheimers sjukdom. Journal of Alzheimers disease: JAD 20: S633, 2010.

11. Sonnen JA, Breitner JC, Lovell MA, Markesbery WR, Quinn JF och Montine TJ: Friradikalförmedlad skada på hjärnan vid Alzheimers sjukdom och dess transgena musmodeller. Free Radical Biology and Medicine 45: 219-230, 2008.

12. Lin MT och Beal MF: Mitokondriell dysfunktion och oxidativ stress i neurodegenerativa sjukdomar. Nature 443: 787-795, 2006.

13. Trushina E och McMurray C: Oxidativ stress och mitokondriell dysfunktion vid neurodegenerativa sjukdomar. Neuroscience 145: 1233-1248, 2007.

14. Huang SH, Lin CM och Chiang BH: Skyddande effekter av Angelica Sinensis-extrakt på amyloid-peptid-inducerad neurotoxicitet. Phytomedicine 15: 710-721, 2008.

15. Burhans WC och Heintz NH: Cellcykeln är en redoxcykel: kopplar fasspecifika mål till cellöde. Free Radical Biology and Medicine 47: 1282-1293, 2009.

16. Xue HY, Gao GZ, Lin QY, Jin LJ och Xu YP: Skyddande effekter av aucubin på HO-inducerad apoptos i PC12-celler. Fytoterapi

18. Liu, Fx Wang, Xw Luo L och Xin H, Na B och Wang Xf: Effekterna av glykosider av cistanche på inlärning och minne i beta-amyloidpeptid-inducerad Alzheimers sjukdom hos möss och dess möjliga mekanism. Chinese Pharmacological Bulletin 22: 595, 2006.

19. Bao B, Tang X, Tian H, Tong Y, Wu W och Hong Y: Antioxidantaktivitet av extrakt från ökenlevande Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wright Shanghai J Tradit Chin Med 44: 68-71, 2010 .

20. Jiang Y, Li S, Wang Y, Chen X och Tu P: Differentiering av Herba Cistanches genom fingeravtryck med högpresterande vätskekromatografi-diod array detektion-masspektrometri. Journal of Chromatography A 1216: 2156-2162, 2009.