HydroZitLa hämmar bildningen av kalciumoxalatsten hos nefrolitiska råttor och främjar livslängden hos nematod Caenorhabditis Elegans del 1

Lågt vätskeintag, låg utsöndring av citrat i urinen och hög oxidativ stress är de främsta orsakerna till kalciumoxalat (CaOx) nefrolithiasis. HydroZitLa innehåller citrat och naturliga antioxidanter och är utvecklad för att korrigera dessa tre faktorer samtidigt. Antioxidanter kan teoretiskt förlänga livslängden för organismer. I denna studie undersökte vi prekliniskt de antipatogena, livslängdsförlängande och anti-aging effekterna av HydroZitLa i HK-2-celler, Wistar-hanråttor och Caenorhabditis elegans. HydroZitLa hämmade signifikant CaOx-kristallaggregation in vitro och minskade oxidativ stress i HK-2-celler utmanade med litogena faktorer. För experimentell nefrolitiasis delades råttor in i fyra grupper: etylenglykol (EG), EG plus HydroZitLa, EG plus Uralyt-U och obehandlad kontroll. CaOx-avlagringar i njurarna hos EG plus HydroZitLa och EG plus Uralyt-U-råttor var signifikant lägre än hos EG-råttor. Intrarenalt uttryck av 4-hydroxinonenal i EG plus HydroZitLa-råttor var signifikant lägre än hos EG-råttor. Urinoxalatnivåerna hos EG plus HydroZitLa och EG plus Uralyt-U-råttor var signifikant lägre än hos EG-råttor. Urincitratnivåerna för EG plus HydroZitLa och EG plus Uralyt-U-råttor återställdes till nivån hos normala kontrollråttor. Hos C. elegans förlängde HydroZitLa-tillskott avsevärt medianlivslängden för nematoder med upp till 34 procent utan att ätförmågan förändrades. Lipofuscinackumulering i HydroZitLa-kompletterade nematoder var signifikant lägre än i icke-supplementerad kontroll. HydroZitLa hämmade dessutom telomerförkortning, p16-uppreglering och för tidig åldrande i HK-2-celler exponerade för litogena stressorer. Slutsatser, HydroZitLa hämmade oxidativ stress och CaOx-bildning både in vitro och in vivo. HydroZitLa förlängde livslängden och fördröjde uppkomsten av åldrande i C. elegans och mänskliga njurceller. Dessa prekliniska bevis tyder på att HydroZitLa är fördelaktigt för att hämma CaOx-stenbildning, främja livslängd och sakta ner åldrandet.

Glykosid av cistanche kan också öka aktiviteten av SOD i hjärt- och levervävnader och avsevärt minska innehållet av lipofuscin och MDA i varje vävnad, effektivt rensa upp olika reaktiva syreradikaler (OH-, H₂O₂, etc.) och skydda mot DNA-skador orsakade av OH-radikaler. Cistanche-fenyletanoidglykosider har en stark rensande förmåga av fria radikaler, en högre reducerande förmåga än vitamin C, förbättrar aktiviteten av SOD i spermiesuspension, minskar innehållet av MDA och har en viss skyddande effekt på spermiemembranets funktion. Cistanche-polysackarider kan öka aktiviteten av SOD och GSH-Px i erytrocyter och lungvävnader hos experimentellt åldrande möss orsakade av D-galaktos, samt minska innehållet av MDA och kollagen i lungor och plasma, och öka innehållet av elastin, har en god renande effekt på DPPH, förlänger hypoxitiden hos åldrande möss, förbättrar aktiviteten av SOD i serum och fördröjer den fysiologiska degenerationen av lungor hos experimentellt åldrande möss. Med cellulär morfologisk degeneration har experiment visat att Cistanche har den goda antioxidantförmågan och har potential att vara ett läkemedel för att förebygga och behandla åldrande hudsjukdomar. Samtidigt har echinacoside i Cistanche en betydande förmåga att avlägsna DPPH-fria radikaler och har förmågan att avlägsna reaktiva syrearter och förhindra friradikal-inducerad kollagennedbrytning, och har även en god reparationseffekt på anjonskada av tymin-fria radikaler.

Klicka på Fungerar Cistanche

【För mer information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Förkortningar

BSA Bovint serumalbumin

CaOx Kalciumoxalat

COM Kalciumoxalatmonohydrat

EG Etylenglykol

H2O2 Väteperoxid

HZL HydroZitLa

iCOCI Indolreagerat kalciumoxalatkristallisationsindex

NaOx Natriumoxalat

ROS Reaktiva syrearter

RTL Relativ telomerlängd

SIPS Stress-inducerad för tidig åldrande

TA Tokoferylacetat

TAC Total antioxidantkapacitet

4-HNE 4-Hydroxynonenal

Urinstenssjukdom är ett uråldrigt tillstånd hos människor dokumenterat sedan den egyptiska eran1,2. Denna sjukdom är fortfarande ett betydande urologiskt problem över hela världen med en progressivt ökande prevalens. Urinstenar består till övervägande del av kalciumoxalat (CaOx), som mestadels bildas i njurarna och är mycket återkommande. Även om njursten är allmänt uppfattad som ett inte livshotande tillstånd, har det en dödlig konsekvens. Stenar skadar gradvis njurarna och orsakar så småningom kronisk njursjukdom3–7. Den ekonomiska bördan av stensjukdom är betydande, eftersom kostnaden för stenbehandling och behandling är jämförbar med den kombinerade kostnaden för behandlingar för prostata- och blåscancer8. Därför behövs en ny medicinsk profylax för stenbildning.

Otillräckligt vätskeintag minskade citratutsöndringen i urinen och ökad oxidativ stress är de tre huvudsakliga orsakerna till CaOx-litogenes. Dessa faktorer bör korrigeras för att förhindra CaOx-förkalkning. Vätskeintag på 2,5–3 L/dag är en allmänförebyggande åtgärd9. Kaliumcitrat är en vanlig medicin för stensjukdom eftersom hypocitraturi är den mest kända orsaken till CaOx-stenbildning och återfall. Eftersom en långtidsbehandling med kaliumcitrat krävs för att effektivt förhindra återfall av stensjukdom, blir dålig vidhäftning ett problem på grund av dess biverkningar och dålig/salt smak10–12. Smakförbättring genom tillsats av sukralos visade sig förbättra toleransen för kaliumcitrattillskott13.

Oxidativ stress inducerad av reaktiva syrearter (ROS) är avgörande för CaOx-litogenes14–19. En diet med låg antioxidanthalt har visat sig bidra till stenbildning hos experimentråttor genom att öka ROS-produktionen, oxidativ stress och intrarenal CaOx-avsättning20. Antioxidantintervention dämpade oxidativ stress och hämmade CaOx-avsättning hos nefroliska råttor16,21–23. Medicinska växtbaserade läkemedel och traditionell medicin för stenbehandling mildrade i grunden oxidativ stress24.

Traditionell örtmedicin eller fytomedicin har fördelen av långvarig användning i samhället, och patienter betraktar dem i allmänhet som naturliga och säkra kurer. Det bör dock noteras att vetenskapliga bevis för effektivitet och säkerhet måste tillhandahållas innan klinisk implementering. Vi antog att kuren som kombinerar modern och traditionell medicin kunde vara en innovativ lösning för att minimera biverkningar utan att kompromissa med den terapeutiska effekten. Vi utvecklade en ny kombination av traditionell och modern medicin, kallad HydroZitLa (Hydrozitla eller Hyla), som en alternativ behandling för CaOx-sten.

De huvudsakliga aktiva antipatogena ingredienserna i HydroZitLa är citrat- och bananstamvattenextrakt. Bananstam (Musa spp.) är en länge känd indisk ayurvedisk traditionell medicin för behandling av urinstenar25, och dess stenhämmande aktivitet har experimentellt påvisats26–29. Poonguzhali och Chegu visade att bananstamextrakt signifikant minskade urinoxalatutsöndringen hos hyperoxaluriska urolitiska råttor30. Den preliminära kliniska studien av Pillai 1995 visade att kärnan i banans pseudostam kunde användas vid behandling av urolithiasis31. Dessutom har bananstamjuice en urindrivande effekt som kan hjälpa till att spola ut litogena kristaller och underlätta stenpassage. Medan kaliumcitrat endast korrigerar riskfaktorn för hypocitraturi genom att tillföra citrat, kan HydroZitLa-dryck samtidigt korrigera alla tre ovannämnda CaOx-riskfaktorer genom att öka vätskeintaget, återställa urincitrat och tillhandahålla naturliga antioxidanter.

I denna studie undersökte vi om HydroZitLa kunde utöva den stenhämmande effekten av CaOx in vitro och in vivo-modeller. HydroZitLas prekliniska toxicitet i humana njurceller (HK-2) och möss bestämdes. Med tanke på att HydroZitLa innehöll växtbaserade antioxidanter, försökte vi avgöra om det kunde förlänga livslängden och minska den åldrande fenotypen i en Caenorhabditis elegans-modell. Vi undersökte också om HydroZitLa kunde hämma telomerförkortning och för tidig åldrande i HK-2-celler.

Resultat

HydroZitLa: en säker dryck för konsumtion. HydroZitLa var negativ för Clostridium spp./{{0}},1 g, Salmonella spp./25 g och Staphylococcus aureus/0,1 g. Arsenik upptäcktes inte. Bly hittades på en extremt låg nivå (0.033 ppm). Nivåer av metaller, såsom Tl, As, Se, Mo, Zn, Sb, Pb, Cd, Co, Ni, Fe, Mn, Cr, Mg, V, Be, Ca, Cu, Ti, Sr och Li, i HydroZitLa, mätt med den induktivt kopplade plasmaoptiska emissionsspektrometrin (ICP-OES) visas i tilläggstabell 1. Giftiga metaller inklusive Cd, Cr, As, Ni, Tl, Sb, Co, Be, V och Li upptäcktes inte . Spårelement, som Mg, Zn, Ca och Fe, hittades vid 14.04±{{20}}.05, 2,09±0,05, 0. 86±0,02 respektive 0,16±0,001 ppm.

In vitro, cytotoxicity of HydroZitLa in HK-2 cells using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was performed and reported in our previous study32. Increased HydroZitLa   concentration gradually decreased cell survival. Te IC50 of HydroZitLa in HK-2 cells was 24.7% v/v. In vivo, acute toxicity testing revealed that all HydroZitLa-administered mice survived until the end of the experiment  (14 days). No gross lesions were found in the visceral organs in the HydroZitLa-administered group and the control group. Therefore, the LD50 of HydroZitLa was>20 ml/kg.

CaOx-aggregationshämning och antioxidantfunktion hos HydroZitLa. HydroZitLa hämmade signifikant aggregationen av frökalciumoxalatmonohydrat (COM) kristaller, men bovint serumalbumin (BSA, 1 mg/ml) gjorde det inte (Fig. 1A). Citronsyra hämmade kraftigt COM-aggregation (kompletterande fig. 1).

HydroZitLa-koncentration vid 10 procent (v/v) gav den största antioxidativa effekten med den lägsta cytotoxiciteten. Därför använde vi 10 procent (v/v) HydroZitLa för den efterföljande behandlingen i cellodlingsmodellen. ROS-produktion i HK-2-celler exponerade för H2O2 och COM ökade signifikant jämfört med kontroll, men den minskade signifikant efter HydroZitLa-sambehandling (Fig. 1B). Dessutom reducerade HydroZitLa signifikant nivåerna av proteinkarbonylhalten i HK-2-celler exponerade för H2O2 och COM (Fig. 1C). Exponeringen av HK-2-celler för H2O2 (1000 µM) och COM (150 µg/cm2) orsakade förändringar i cellmorfologi och ökad celldöd. HydroZitLa-sambehandling förhindrade morfologisk förändring, räddade celler från apoptos och återställde cellproliferation (Fig. 1D).

Hämning av CaOx-kristallavlagringar i råttnjurar. Den biokemiska profilen för urinprover efter intervention 24-h (dag 35) erhållna från experimentråttor presenteras i tabell 1. Njurar hos råttor med etylenglykol (EG) var förstorade och bleka (Fig. 2A) och deras vikter var signifikant större än för EG plus HydroZitLa och EG plus Uralyt-U råttor (Fig. 2B). Hematoxylin- och eosin- (H&E)-färgning avslöjade att njurar hos EG-råttor hade ett robust tecken på inflammation, medan njurar hos EG plus HydroZitLa och EG plus Uralyt-U-råttor verkade normala, liknande det hos normala kontrollråttor (Fig. 2A). Alla H&E-färgade njursektioner visas i tilläggsbild 2.

Dubbelbrytande CaOx-kristallavlagringar observerades markant i njursektioner av EG-råttor, men de hittades inte i njursektioner av normala kontrollråttor (Fig. 3A). Dessa CaOx-avlagringar försvann nästan i njursektioner av EG plus HydroZitLa och EG plus Uralyt-U råttor. Polariserade mikrofotografier av alla njursektioner visas i tilläggsbild 3.

Yasue-färgning bekräftade att CaOx-kristaller (svarta fällningar) till stor del ackumulerades i njurarna (i både cortex och märg) hos EG-råttor, men denna CaOx-avsättning hämmades anmärkningsvärt av HydroZitLa och Uralyt-U (Fig. 3A). Antalet svarta CaOx-utfällningar i njursektionerna av EG plus HydroZitLa och EG plus Uralyt-U råttor var signifikant lägre än de i EG-råttor (Fig. 3B). Resultat av Yasue-färgning av alla njursektioner visas i tilläggsbild 4.

Minskning av 4-hydroxynonenal (4-HNE) uttryck i njurvävnad. Det intrarenala uttrycket av 4-HNE, som en oxidativ stressmarkör, ökade markant hos EG-råttor jämfört med normala kontrollråttor (Fig. 4A). Sammantaget var uttrycken av 4-HNE i njurarna hos EG plus HydroZitLa och EG plus Uralyt-U-råttor lägre än hos EG-råttor. Men kvantitativt var andelen 4-HNE-positiva celler signifikant lägre endast i EG plus HydroZitLa-råttor än i EG-råttor (Fig. 4A). Resultat av 4-HNE-färgning av alla njursektioner presenteras i tilläggsbild 5. I denna studie utförde vi också immunhistokemisk färgning för kluvna kaspas-3, men vi observerade ingen signifikant förändring av detta apoptotikum markör bland grupperna (tilläggsbild 6).

Minskning av urinoxalat och indolreagerat kalciumoxalatkristallisationsindex (iCOCI) nivåer. Urinoxalat var förhöjt hos EG-råttor jämfört med kontrollråttor. Denna urinoxalatförhöjning minskade signifikant efter HydroZitLa- och Uralyt-U-behandlingar (Fig. 4B). Däremot minskade urincitrat hos EG-råttor jämfört med kontrollråttor. Även om HydroZitLa- och Uralyt-U-behandlingar inte signifikant ökade urincitratnivåerna i förhållande till EG-råttor, kunde de återställa urincitratnivåerna till den nivå som finns hos normala kontrollråttor (Fig. 4C). Nivåer av urinsyra jämfört med grupperna EG, EG plus HydroZitLa och EG plus Uralyt-U var inte signifikant olika (Fig. 4D). I likhet med urinoxalat var iCOCI-nivåer i urin av EG plus HydroZitLa och EG plus Uralyt-U-råttor signifikant lägre än hos EG-råttor (Fig. 4E).

C. elegans förlängning av livslängden. Komplettering med HydroZitLa (10–40 procent v/v) förlängde signifikant den maximala livslängden för vildtyp C. elegans (Fig. 5A). Den högsta livslängdsförlängande effekten var med 30 procent v/v, vilket kunde öka medianöverlevnaden för nematoder från 16,0 dagar (kontroll) till 21,5 dagar (34,4 procents ökning). Medianöverlevnaden för nematoder kompletterade med 10 procent, 20 procent och 40 procent v/v HydroZitLa förlängdes signifikant till 18,5 (15,6 procent ökning), 19,5 (21,9 procent ökning) respektive 21,0 (32,3 procent ökning) dagar. Effekten av alla testade koncentrationer av HydroZitLa (från 1 till 100 procent v/v) på överlevnaden av C. elegans återspeglas i tilläggsbild 7.

Matintagsbeteende, vilket indikeras av svalgets pumphastigheter, dagarna 0, 5, 10 och 15 var inte signifikant olika mellan HydroZitLa-tillsatt (20 procent, 30 procent och 40 procent v/v) och icke- kompletterade kontrollnematoder (Fig. 5B).

Nivån av autofluorescerande lipofuscin (åldrande markör) övervakades inuti nematoderna efter tillskott med 20 procent, 30 procent och 40 procent v/v HydroZitLa (Fig. 6A). HydroZitLa-tillskott vid alla testade koncentrationer minskade signifikant nivåerna av lipofuscinackumulering i nematoder jämfört med kontroll (Fig. 6B).

Hämning av telomernötning, p16-uppreglering och för tidig senescens i HK-2-celler. De relativa telomerlängderna för HK-2-celler behandlade med H2O2, NaOx och COM var betydligt kortare än för obehandlade kontroller (Fig. 6C). HydroZitLa-sambehandling hindrade signifikant förkortningen av telomerer i HK-2-celler behandlade med H2O2, NaOx och COM.

Dubbla färgningsresultat av senescensassocierat -galaktosidas (SA- -gal) och p16 visade att H2O2, NaOx och COM-inducerad stressinducerad prematur senescens (SIPS), vilket indikeras av den ökade andelen SA{{8 }}gal-positiva celler och p16-uppreglering i HK-2-celler (Fig. 6D). p16 märktes intensivt i dessa SA- -gal-positiva celler. HydroZitLa-sambehandling hämmade signifikant SIPS (minskad SA- -gal-positivitet) och p16-uppreglering i HK-2-celler exponerade för H2O2, NaOx och COM (Fig. 6D).

Diskussion

Framstegen i utvecklingen av läkemedel mot njurstenssjukdom är jämförelsevis långsamma och inga nya läkemedel har implementerats kliniskt på decennier33. En ersättningsterapi med alkalicitrat är fortfarande ett allmänt använt läkemedel för att förhindra återfall av sten. Gastrointestinala biverkningar och dålig smak är de största nackdelarna med kaliumcitratbehandling som orsakar dålig följsamhet11–13. EAU:s riktlinje för urolithiasis angav att det ideala läkemedlet skulle stoppa stenbildning, inte ha några biverkningar och vara lätt att administrera, och dessa element är viktiga för att uppnå god följsamhet9. I denna studie utvecklade vi HydroZitLa för att ta itu med nackdelarna med kaliumcitrat och för att uppfylla de idealiska läkemedelskriterierna så mycket som möjligt. HydroZitLa-drycken har en utsökt sur och söt smak. Vi trodde att den dåliga smakligheten hos kaliumcitrat kunde lösas av HydroZitLa liknande rapporter av Mechlin et al. som visade att tillsatsen av Splenda till kaliumcitrat bidrog till att förbättra följsamheten hos kaliumcitratterapi13.

Ett lågt vätskeintag är en viktig riskfaktor för CaOx-stenbildning. Patienter med en stensjukdom rekommenderas att öka sitt vätskeintag till 2,5–3.0 L/dag, men det är relativt svårt för dem att upprätthålla vidhäftningen, särskilt på lång sikt. Aktuella stenmediciner görs i form av antingen pulver eller tablett. Vattenintag med dessa mediciner är vanligtvis otillräckligt och varierar mellan patienter. Däremot gjorde det möjligt för patienter att dricka HydroZitLa att öka sitt vattenintag med minst 500 ml för varje påse som konsumerades. Med långvarig användning kan HydroZitLa främja förändringar i kostvanor mot att öka det dagliga vätskeintaget. Toxicitetsbedömningsdata säkerställde att HydroZitLa var säkert för konsumtion. Te HydroZitLa dryckeskoncentrat var officiellt godkänt av Tai Food and Drug Administration (FDA) och lokalt tillgängligt i Thailand sedan 2019. Såvitt vi vet har konsumenter inte rapporterat toxicitet eller allvarliga biverkningar.

HydroZitLa hämmade signifikant aggregationen av COM-kristaller in vitro. Även om albumin rapporterades som en hämmare av CaOx-aggregation34, observerade vi inte den signifikanta hämningen av CaOx-aggregation av BSA i vårt testsystem. Däremot hämmade citronsyra kraftigt COM-aggregation i vår analys. Sannolikt var citronsyra som ingår i HydroZitLa ansvarig för blockeringen av COM-aggregation.

Fenolhalten i HydroZitLa härrörde från bananstjälkar, blå ärtblommor och sappanträ. Antioxidantegenskaperna hos bananstam 35, blå ärtblommor 36 och sappan kärnvedsextrakt 37 är väl dokumenterade. Den aktuella studien visade att HydroZitLa signifikant minskade intracellulär ROS-produktion och proteinoxidation i HK-2-celler exponerade för H2O2 och COM. Dessutom räddade HydroZitLa djupt HK-2-celler från apoptotisk celldöd inducerad av H2O2 och COM. Dessa data framhävde att HydroZitLa hade en antioxidativ funktion för att mildra oxidativ stress i njurtubulära celler.

I denna studie visade vi i en råttmodell av CaOx nefrolithiasis där HydroZitLa signifikant hämmade CaOx-avsättning i råttors njurar, och dess antipatogena effekt var likvärdig med Uralyt-U-läkemedlet. Intressant nog minskade HydroZitLa signifikant intrarenalt 4-HNE-uttryck, men Uralyt-U gjorde det inte. HydroZitLa innehöll antioxidanter, men det gjorde inte Uralyt-U. Våra data antydde att lindring av oxidativ stress var en fördel med HydroZitLa framför kaliumcitrat. HydroZitLa och Uralyt-U hade jämförbar effekt på minskningen av urinoxalat hos nefrolitiska råttor, även om det var mer uttalat med HydroZitLa. Signifikant minskning av iCOCI-nivåer i urin (en indikator på urinkompetensen av CaOx-kristallisation38) observerades också hos råttor som behandlats med HydroZitLa och Uralyt-U. Dessa indikerade att potentialen för CaOx-kristallisation i urinen minskade efter HydroZitLa- och Uralyt-U-behandlingar. HydroZitLa verkade leverera antipatogen aktivitet främst genom minskning av urinoxalatutsöndring. Finansieringen bekräftades av rapporter från Poonguzhali och Chegu som visade att hyperoxaluriska råttor behandlade med vattenhaltigt bananstamextrakt avsevärt minskade utsöndringen av oxalat i urinen30. Baserat på de nuvarande fynden inducerade HydroZitLa CaOx-stenhämmande effekter motsvarande det för närvarande använda kaliumcitrat, och det kan vara kliniskt användbart som ett nytt terapeutiskt alternativ för CaOx-nefrolitiasis.

En signifikant ökning av urincitratnivåer hos nefrolitiska råttor efter HydroZitLa- och Uralyt-U-behandlingar upptäcktes inte. En trend av ökad urincitratutsöndring efter båda behandlingarna observerades dock. Detta kan förklaras av den lilla provstorleken (n=6) eller den otillräckliga dosen av citrat (2 mEq per dag, lika med 0,4 g/kg per dag i genomsnitt). Yasui et al. använde kaliumcitrat (Uralyt, Nippon Chemiphar, Japan) med 0,5 g/kg (låg dos) och 20 g/kg (hög dos) per dag i sina experiment för att hitta en signifikant ökning av urincitratnivåer i experimentråttor39. Ghaeni et al. behandlade EG-råttor med kaliumcitrat (Sepidaj, Iran) vid 2,5 g/kg per dag för att observera en signifikant ökning av urincitratutsöndringen efter behandling40. Således var en låg dos av citrat troligen en anledning till att inte hitta en signifikant höjning av urincitrat i vår råttmodell efter HydroZitLa- och Uralyt-U-behandlingar. HydroZitLa- och Uralyt-U-behandlingar kunde dock återställa urincitrat till de nivåer som observerades hos normala kontrollråttor. Denna urincitratnormalisering skulle kunna bidra, åtminstone delvis, till hämningen av CaOx-bildning.

【För mer information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】