Identifiering och biokontrolleffektivitet av antagonistiska bakterier mot stamröta av Cistanche Deserticola
Jul 30, 2026
Abstrakt
Mål:Stamröta är en stor sjukdom som begränsar odling och industriell utveckling avCistanche deserticola. För att erhålla effektiva biokontrollstammar och minska problem i samband med kemisk kontroll, syftade denna studie till att tillhandahålla mikrobiella resurser för biologisk kontroll av stamröta iC. deserticola.
Metoder:Antagonistiska bakterier isolerades från jordar som samlades inC. deserticolaodlingsområden. Kandidatstammar med stark hämning mot tre stora patogener-Fusarium oxysporum, Fusarium proliferatum, ochFusarium acuminatum-screenades riktat med hjälp av en dubbelkulturplattkonfrontationsanalys. Den utvalda stammen identifierades genom att kombinera morfologisk observation med molekylära metoder (16S rDNA-sekvensering och fylogenetisk analys). Extracellulär enzymproduktion bedömdes. Fältförsök utfördes för att utvärdera biokontrolleffektiviteten.
Resultat:En mycket effektiv antagonistisk stam, WLKYLW-9, erhölls. In vitro-inhiberingen motverkarF. oxysporum, F. proliferatum, ochF. acuminatumvar 74,36 %, 64,62 % respektive 53,85 %. I fält nådde kontrolleffektiviteten 68,97 %–77,71 %. Stam WLKYLW-9 identifierades somBacillus halotolerans. Enzymanalyser indikerade att WLKYLW-9 utsöndrade cellulas, proteas och amylas, vilket tyder på att dessa enzymer kan bidra till patogenundertryckning.
Slutsats:WLKYLW-9 hämmade signifikant de huvudsakliga patogenerna som orsakade stamrötaC. deserticolaoch visar betydande potential för utveckling och tillämpning inom biologisk bekämpning.
Nyckelord: Cistanche deserticola; stamröta; antagonistiska bakterier; antifungal aktivitet; kontrolleffektivitet
1 Introduktion
Cistanche deserticola(Rou Cong Rong) är en parasitisk medicinalväxt som växer på rötterna av halofytiska ökenväxter och är känd för toniska och endokrina reglerande funktioner. Under de senaste åren, efter att ha inkluderats i listan över medicinska och ätbara homologa resurser, har efterfrågan på marknaden ökat markant. Med mognaden av konstgjorda odlingstekniker har industrin expanderat snabbt. Bara i Minqin County har planteringsområdet nått omkring 20 000 mu, och stamröta har gradvis blivit det stora hindret för hållbar utveckling.
Baserat på isolering och identifiering av sjuka prover som samlats in från odlingsbaser runt Qingtusjön, Xiqu Town, Minqin County, Wuwei City, Gansu-provinsen, fastställde vår grupp tidigare att de viktigaste patogenerna i denna region inkluderarF. proliferatum, F. oxysporum, ochF. acuminatum[2]. Två typiska symtomtyper observeras i fält: (1) tidig epidermal svärtning och sönderfall, med vita flockiga mycelier under hög luftfuktighet som senare blir rosa; och (2) initiala mörkbruna till svarta fläckar, följt av övergripande mörkare av den köttiga stjälken; exteriören förblir fast utan tydlig mjukröta, medan inre vävnader brunnar och så småningom svartnar [2].
Denna studie fokuserade på jordar från Qingtusjöns odlingsregion och kombinerade laboratoriescreening och fältförsök för att välja ut antagonistiska bakterier med betydande undertryckande effekter på stamröta, vilket ger mikrobiella resurser och teoretiskt stöd för att utveckla biobekämpningsmedel och främja hållbar produktion.
2 Material och metoder
2.1 Material
Jordprover:Försöksplatsen var belägen i enC. deserticolaodlingsbas i Qingtusjöregionen i Minqin County, Wuwei City, Gansu-provinsen. Trettio jordprover samlades in.
Patogener:Tre patogener som tidigare isolerats och identifierats av vår grupp-F. proliferatum, F. oxysporum, ochF. acuminatum-bevarades i Key Laboratory of Fruit Tree Stress Physiology and Fruit Quality Regulation, Wuwei City [2].
Media:LB-agar, NB-buljong, PDA, CMC-medium, MH-medium (kaseinmedium) och ST-medium (stärkelsemedium) framställdes enligt de listade formuleringarna. Media justerades till pH 7,0–7,2 och steriliserades vid 121 grader i 20 minuter.
Figur 1. Plattantagonistisk effekt av stam WLKYLW-9 mot tre patogener som orsakar stamröta i Cistanche deserticola.
Notera: A representerar den hämmande effekten av stam WLKYLW-9 på Fusarium oxysporum-kolonier; B representerar normalt växande Fusarium oxysporum-kolonier; C representerar den hämmande effekten av stam WLKYLW-9 på Fusarium effusum-kolonier; D representerar normalt växande Fusarium effusum-kolonier; E representerar den hämmande effekten av stam WLKYLW-9 på Fusarium argentis-kolonier; F representerar normalt växande Fusarium argentis-kolonier.
2.2 Instrument
Optiskt mikroskop (Olympus-Cx31rtsf, Olympus, Japan); konstant temperaturinkubator (DNP-9162BS-III, Shanghai Xinmiao); skakningsinkubator (ZWY-200D, Shanghai Zhicheng).
2.3 Metoder
2.3.1 Isolering och screening av antagonister
Antagonistiska bakterier isolerades från jord med hjälp av utspädningspläteringsmetoden [3]. Screening utfördes med hjälp av dubbelkulturkonfrontation på PDA: 5 mm mycelproppar av varje patogen placerades i mitten av plattan, medan ~1 mm³ block från bakteriella enkelkolonier inokulerades 2 cm från pluggen vid fyra symmetriska punkter. Tre oberoende plattor användes som biologiska replikat för varje behandling. Plattor inkuberades vid 28 grader, inhiberingszoner registrerades och inhiberande stammar screenades på nytt. Hämningshastigheten beräknades som:
Hämningshastighet (%)=Dc−DtDc×100\\text{Hämningshastighet (\\%)}=\\frac{D_c - D_t}{D_c}\\ gånger 100Hämningshastighet (%)=DcDc−Dt×100
där DcD_cDc är kolonidiameter i kontrollen och DtD_tDt är kolonidiameter i behandlingen [4].
Tabell 1. Hämningshastighet av stam WLKYLW-9 mot tre patogener som orsakar stamröta avCistanche deserticola
| Patogen | Hämningshastighet (%) |
|---|---|
| Fusarium oxysporum | 74.36 ± 1.32ᵃ |
| Fusarium proliferatum | 64.62 ± 0.78ᵇ |
| Fusarium acuminatum | 53.85 ± 1.54ᶜ |
Obs: Olika små bokstäver i kolumnen indikerar signifikanta skillnader (P < 0,05).
Tabell 2. HC-värden för hydrolyszoner producerade av stam WLKYLW-9 på olika medier
| Medium | HC-värde |
|---|---|
| CMC | 3.89 ± 0.06ᵃ |
| MH | 2.33 ± 0.40ᵇ |
| ST | 1.52 ± 0.22ᶜ |
Obs: Olika små bokstäver i kolumnen indikerar signifikanta skillnader (P < 0,05).
2.3.2 Extracellulära enzymanalyser
CMC-, ST- och MH-media användes för att detektera cellulas-, amylas- respektive extracellulära proteasaktiviteter. Bakteriesuspensioner justerades till OD600_{600}600=0.6. Varje platta sågs med: 1 μL färska levande celler, 1 μL sterilt vatten och 1 μL värmedödade celler (121 grader, 20 min), med ytterligare ett tomt mediumområde som negativ kontroll. Efter inkubation vid 28 grader under 5 dagar, utvärderades hydrolyszoner (klara halos). CMC- och ST-plattor färgades med Kongorött respektive jod [5]. Halo- och kolonidiametrar mättes med hjälp av foton och ImageJ; HC-värdet beräknades som halodiameter/kolonidiameter [6].
2.3.3 Morfologisk och molekylär identifiering
Den valda stammen odlades på NA vid 28 grader i 24–48 timmar för att observera kolonimorfologi (färg, storlek, marginal, höjd). Gramfärgning, sporfärgning och mikroskopi utfördes. Genomiskt DNA extraherades med användning av ett kommersiellt kit (SK8255, Sangon Biotech). 16S rDNA-genen amplifierades med användning av universella primers 27F och 1492R. PCR (25 μL) bestod av 2×Taq PCR Mix 12,5 μL, primers (10 μmol/L) 1 μL vardera, DNA-mall 1 μL och sterilt vatten 9,5 μL. Cykling: 95 grader 5 min; 30 cykler på 94 grader 30 s, 55 grader 30 s, 72 grader 90 s; slutlig förlängning 72 grader 10 min. Produkterna verifierades med 1 % agarosgelelektrofores och sekvenserades dubbelriktat (Sangon Biotech). Efter trimning och sammansättning användes BLAST för att identifiera homologa sekvenser i NCBI GenBank. Fylogenetisk analys utfördes i MEGA11 efter MUSKELjustering med användning av Neighbor-Joining-metoden med 1 000 bootstrap-replikat.
2.3.4 Fälteffektivitetsprövning
Root-zon drench-behandlingar tillämpades vidC. deserticolainokuleringsställen. Varje behandling hade 6Haloxylonväxter som biologiska replikat; varje planta värd 5–8C. deserticolaindivider. Behandlingar (drench order) var:
T1 (patogenkontroll):200 mL patogensporsuspension → 200 mL steril OBS → återfyllnadssand → 5 L sterilt vatten.
T2 (förebyggande antagonist):200 mL antagonistjäsningsbuljong → 200 mL patogensporsuspension → återfyllningssand → 5 L sterilt vatten.
T3 (läkande antagonist):200 mL patogensporsuspension → 200 mL antagonistjäsningsbuljong → återfyllningssand → 5 L sterilt vatten.
Sjukdomsincidensen bedömdes 15 dagar efter ympning. Incidens (%)=(antal sjuka rötter/totalt undersökta rötter) ×100%. Kontrolleffektivitet (%)=(incidens i kontroll − incidens i behandling)/incidens i kontroll ×100%.
Antagonistjäsningsbuljong: odlad i NB vid 28 grader, 150 rpm under 3 dagar; livsdugligt antal justerat till 1×1081\\ gånger 10^81×108 CFU/mL. Oinokulerad NB fungerade som blank. Patogen sporsuspension:Fusariumspp. odlade på PDA; sporer tvättades bort, centrifugerades, filtrerades och justerades till 1 x 1061 x 10 x 61 x 106 sporer/ml för genomdränkning. Sporgroningshastigheten var större än eller lika med 90 %. Varje inokuleringsställe fick 200 ml (dvs 2 x 1082 x 10 x 82 x 108 sporer).
2.4 Dataanalys
Data analyserades med SPSS 16.0.
Figur 2. Klara hydrolyszoner producerade av extracellulära enzymer av stam WLKYLW-9
Obs: A, CMC-medium; B, MH-medium; C, ST medium.
Figur 3. Kolonimorfologi och mikroskopisk observation av gramfärgning av stam WLKYLW-9
Notera: A, kolonimorfologi för WLKYLW-9 efter 7 dagars inkubation; B, Gram-färgade celler observerade under ett 40× mikroskop.
3 resultat
3.1 Isolering, screening och antagonistisk aktivitet
Totalt 121 bakterieisolat erhölls från 30 jordprover från rhizosfären. Dubbelkulturscreening mot de treFusariumpatogener identifierade WLKYLW-9 som den mest effektiva stammen. WLKYLW-9 hämmade signifikant alla tre patogener, med den starkaste effekten motF. oxysporum(74,36 % inhibering), följt avF. proliferatum(64,62%) ochF. acuminatum(53,85%) (tabell 1). Under patogenutmaning förändrades kolonirynkdistributionen av WLKYLW-9, med färre rynkor näraF. oxysporumoch en utåtgående förskjutning under de andra två patogenerna (Fig . 1).
3.2 Extracellulära enzymaktiviteter
WLKYLW-9 växte bra på CMC-, MH- och ST-media och producerade tydliga hydrolyszoner, vilket bekräftar utsöndring av cellulas, proteas och amylas. Större halos observerades på CMC och MH, med HC-värden på 3,89 respektive 2,33 (tabell 2), vilket indikerar starka cellulas- och proteasaktiviteter. Halon på ST var mindre (HC 1,52) men tydligt synlig (Fig . 2).
3.3 Identifiering av stam WLKYLW-9
3.3.1 Morfologiska egenskaper
På LB-agar var kolonierna mjölkvita med fuktiga ytor och oregelbundna kanter; rynkor uppträdde vid långvarig inkubation. Celler var grampositiva stavar som producerade endosporer (Fig . 3), vilket tyder påBacillspp.
3.3.2 Molekylär identifiering
16S rDNA-amplikonet var 1 488 bp. BLAST och fylogenetisk analys (Fig . 4) visade 99 % likhet medBacillus halotolerans(GenBank accession NR115063), med det närmaste fylogenetiska förhållandet. Baserat på morfologi och molekylära bevis identifierades WLKYLW-9 somB. halotolerans. Sekvensen deponerades i GenBank med tillträdeOQ345825.
3.4 Fältkontrolls effektivitet
Fältresultat (tabell 3) visade att den flytande formuleringen WLKYLW-9 signifikant kontrollerade stamröta orsakad av det blandade inokulatet avF. oxysporum, F. proliferatum, ochF. acuminatum. Patogenkontrollen (T1) visade den högsta incidensen (87,20 %), signifikant högre än de förebyggande (T2) och läkande (T3) behandlingarna (P<0.05). T2 had the lowest incidence (19.44%), significantly lower than T3 (27.06%, P<0.05). Corrected control efficacy relative to T1 was 77.71% for T2 and 68.97% for T3, indicating better performance when applied preventively.
Tabell 3. Effektivitet för fältkontroll av stam WLKYLW-9 mot stamröta avCistanche deserticola
| Behandling | Sjukdomsförekomst (%) | Kontrolleffektivitet (%) |
|---|---|---|
| T1 | 87.20 ± 0.73ᵃ | - |
| T2 | 19.44 ± 1.36ᶜ | 77.71 |
| T3 | 27.06 ± 8.15ᵇ | 68.97 |
Obs: Data är medelvärde ± standardavvikelse (SD). Olika små bokstäver inom samma kolumn indikerar signifikanta skillnader (P < 0,05).
4 Diskussion
Antagonistiska bakterier är mycket använda mikrobiella resurser för biologisk kontroll och representerar nyckelkällor för utveckling av biopesticider. Studier på antagonistiska bakterier som riktar sig mot stamrötaC. deserticolaförbli begränsad. Cheng et al. [8] föreslog detFusarium sambucinumkan också vara en viktig patogen. I denna studie isolerades en mycket effektiv stam, WLKYLW-9, från jordar i Qingtusjöregionen och identifierades somB. halotolerans.
Flera studier stöder biokontrollpotentialen hosBacillspp. Till exempel,B. subtilisBs916 uppnådde 55,6 % kontroll mot tomatbakterievisskning [9], ochB. mojavensisisolerade från päronodlingar visade signifikant effekt mot päroncanker/död [10]. Biokontrollforskning på potatistorrröta är mer mogen, med flera bredspektrum- eller patogenspecifikaBacillrapporterade stammar, inklusiveB. amyloliquefaciensochB. velezensis[11]. Eftersom stamröta avC. deserticolapåverkar underjordiska ätbara organ på samma sätt som potatistorrröta, är biologisk kontroll särskilt viktig.
Klicka på bilden för att få mer information om organisk cistanchebas
B. halotoleranshar studerats för både biokontroll och främjande av växttillväxt. Yan et al. [12] isolerade en stam från salt-alkalijord som visade hög antagonism motStaphylococcus aureusochVerticillium dahliae, troligen via sekundära metaboliter eller nedbrytande enzymer, i överensstämmelse med våra fynd. Zhu et al. [13] rapporterade detB. halotoleranskan förbättra värdresistensen genom att öka antioxidantenzymaktiviteterna. Här utsöndrade WLKYLW-9 cellulas, proteas och amylas - särskilt starkt cellulas och proteas - vilket tyder på en viktig roll i antagonism, i överensstämmelse med tidigare rapporter och vårt tidigare arbete med päronsjukdom [10,14]. Fältförsök bekräftade ytterligare signifikant dämpning av stamröta orsakad av blandadFusariumpatogener. Eftersom WLKYLW-9 isolerades från salt-alkalijordar, kräver dess potentiella växttillväxtfrämjande effekter bortom sjukdomsbekämpning ytterligare undersökning.
Referenser
(以下按你原文条目保留;如你需要我把中文参考文献也统一成英文格兏/补兏/补I)
[1] Li Z, Lin H, Gu L, et al. Herba Cistanche (Rou CongRong): en av de bästa farmaceutiska gåvorna inom traditionell kinesisk medicin.Front Pharmacol, 2016, 7:41.
[2] 刘伟, 何彩, 金娜, 等. 民勤青土湖肉苁蓉茎腐病病原菌的分离鉴定. 西北农业学报, 2025, 34(1):184-190.
[3] Niemann H, Isekann T, Beer DD, et al. Nya mikrobiella samhällen i lervulkanen Haakon Mosby och deras roll som metansänka.Natur, 2006, 443(5227):854-858.
[4] 白洁, 姚拓, 雷杨, 等. 欧李多功能 PGPR 菌株筛选,鉴定及促生防病特性研究.草原与草坪, 2023, 43(1):20-28.
[5] 康兴娇, 申红妙, 贾招闪, 等. 葡萄霜霉病生防菌甲基营养型芽胞杆菌 T3 的鉴定及其防治效果. 中国生物防治学报, 2016, 32(6):775-782.
[6] 郭利娜, 朱玉, 刁明明, 等. 枯草芽孢杆菌发酵小米糠对其抗氧化肽含量与抗氧化活性的影响. 食品科学, 2015, 36(13):196-201.
[7] 柳凤, 欧雄常, 何红, 等. 红柳树内生菌 AmS2 菌株对芒果炭疽病菌的抑制作用.植物保护学报, 2010, 37(5):453-458.
[8] 程齐来, 陈君, 于晶, 等. 荒漠肉苁蓉茎腐病的初步研究. 中草药, 2005, 36(4):582-586.
[9] 乔俊卿, 陈志谊, 梁雪杰, 等. 枯草芽孢杆菌 Bs916 防治番茄青枯病.中国生物防治学报, 2016, 32(2):229-234.
[10] 何彩, 张鹏, 刘伟, 等. 梨干枯病拮抗菌的分离鉴定及田间防治效果. 经济林研究, 2019, 37(4):194-198, 220.
[11] 刘沙, 张廷富, 刘华峰, 等. 马铃薯干腐新病原的分离鉴定及贝莱斯芽孢杆菌对其抑菌活性评价. 西南农业学报, 2025, 38(5):1069-1078.
[12] 阎春兰, 余福燕, 王艺霏, 等. 耐盐芽孢杆菌 SF-18 的生防潜能与基因组学分析.华中农业大学学报, 2024, 43(4):192-203.
[13] 朱幼娇, 陈健鑫, 吴峰婧琳, 等. 耐盐芽孢杆菌对油茶炭疽病的抑制作用及机制研究. 华南农业大学学报, 2025, 46(5):659-668.
[14] Arora NK, Kim MJ, Kang SC, et al. Rollen av kitinas- och -1,3-glukanasaktiviteter producerade av en fluorescerande pseudomonad och in vitro-hämning avPhytophthora capsiciochRhizoctonia solani. Can J Microbiol, 2007, 53(2):207-212.
