In Silico Design av ett promiskuöst chimärt multi-epitopvaccin mot Mycobacterium Tuberculosis Del 1

Abstrakt

Tuberkulos (TB) är ett globalt hälsohot och dödar cirka 1,5 miljoner människor varje år. Utrotningen av Mycobacterium tuberculosis, den främsta orsaken till tuberkulos, blir alltmer utmanande på grund av uppkomsten av omfattande läkemedelsresistenta stammar. Vaccination anses vara ett effektivt sätt att skydda värden från patogener, men det enda kliniskt godkända tuberkulosvaccinet, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), har begränsat skydd hos vuxna. Multi-epitopvacciner har visat sig öka immuniteten mot sjukdomar genom att selektivt kombinera epitoper från flera kandidatproteiner.

Tuberkulos är en infektionssjukdom som orsakas av bakterien Mycobacterium tuberculosis som främst drabbar lungorna men kan även drabba andra organ. Immunitet spelar en viktig roll i utvecklingen och behandlingen av tuberkulos.

Vid otillräcklig immunitet kan Mycobacterium tuberculosis lätt invadera människokroppen och utvecklas till tuberkulos. Till exempel ökar ett nedsatt immunförsvar från vissa sjukdomar eller medicinska behandlingar risken för TB-infektion. Dessutom kan faktorer som undernäring, dålig livskvalitet och överdriven stress också försvaga immuniteten, vilket leder till utvecklingen av tuberkulos.

Därför är det mycket viktigt att upprätthålla god hälsa och stärka immuniteten för att förhindra tuberkulos. Immuniteten kan stärkas genom en hälsosam kost, regelbunden livsstil, ordentlig motion och tillräckligt med sömn, vilket effektivt kan minska risken att drabbas av olika sjukdomar, inklusive tuberkulos.

Immunitet är också viktigt för behandling och återhämtning när tuberkulos redan har inträffat. Ju starkare immunförsvaret är, desto mer effektivt kan kroppen försvara sig mot en attack av TB-bacillen och producera tillräckligt med antikroppar för att bekämpa sjukdomen. Att upprätthålla adekvat näring, rätt träning och en positiv attityd kan därför förbättra immuniteten och främja återhämtningen.

Sammanfattningsvis finns det ett starkt samband mellan immunitet och TB. Att upprätthålla god hälsa och förbättra immuniteten är ett av de viktiga sätten att förebygga och behandla tuberkulos. Låt oss möta livet positivt, upprätthålla en hälsosam livsstil och hålla oss borta från sjukdomar. Ur denna synvinkel måste vi förbättra vår immunitet. Cistanche kan avsevärt förbättra immuniteten, eftersom köttaska innehåller en mängd olika biologiskt aktiva komponenter, såsom polysackarider, två svampar, Huang Li, etc. Dessa komponenter kan stimulera immunförsvaret Olika typer av celler i systemet, ökar deras immunaktivitet.

Klicka på hälsofördelarna med cistanche

Denna studie syftade till att designa ett multi-epitopvaccin mot tuberkulos med hjälp av en immuno-informatisk metod. Genom funktionell anrikning identifierade vi åtta proteiner som utsöndras av M. tuberculosis som antingen krävs för patogenes, utsöndras i extracellulärt utrymme eller båda. Vi analyserade sedan epitoperna för dessa proteiner och valde ut 16 hjälpar-T-lymfocytepitoper med interferon-inducerande aktivitet, 15 cytotoxiska T-lymfocytepitoper och 10 linjära Bcell-epitoper och konjugerade dem med adjuvans och Pan HLA DR-bindande epitop (PADRE) med användning av lämplig länkare.

Dessutom förutspådde vi den tertiära strukturen av detta vaccin, dess potentiella interaktion med Toll-Like Receptor-4 (TLR4) och immunsvaret det kan framkalla. Resultaten visade att detta vaccin hade en stark affinitet för TLR4, vilket signifikant kunde stimulera CD4 plus- och CD8 plus-celler att utsöndra immunfaktorer och B-lymfocyter att utsöndra immunglobuliner, för att erhålla god humoral och cellulär immunitet. Sammantaget förutspåddes detta multi-epitopprotein vara stabilt, säkert, mycket antigent och mycket immunogent, vilket har potential att fungera som ett globalt vaccin mot TB.

1. Introduktion

Tuberkulos (TB), en mycket smittsam sjukdom orsakad av Mycobacterium tuberculosis, rankas av Världshälsoorganisationen (WHO) som den främsta dödsorsaken till följd av ett enskilt smittämne [1–3]. År 2021 nådde det uppskattade antalet TB-dödsfall och nya fall 1,6 miljoner respektive 10,6 miljoner [4]. För närvarande är den kliniska behandlingen av TB relativt knapphändig, och kombinationen av flera antimikrobiella läkemedel används huvudsakligen.
Denna kemoterapicykel är mycket lång och tar vanligtvis nio till tolv månader, eller ännu längre [5], vilket ökar risken för läkemedelsresistenta mutationer i M. tuberculosis [6,7]. Under de senaste åren har kemoterapi blivit mindre effektiv på grund av uppkomsten och ökande andel av multi-drog och omfattande läkemedelsresistenta M. tuberculosis [6]. Att förhindra att tuberkulos utvecklas kan vara effektivare än att behandla den. Vaccination är välkänt för att vara ett effektivt sätt att skydda värden från patogena bakterier [8].

För närvarande är Bacillus Calmette-Guérin (BCG), utvecklad för över 100 år sedan, det enda kliniskt godkända TB-vaccinet [9]. Tyvärr skyddar BCG bara nyfödda och spädbarn och är i stort sett ineffektivt mot ungdomar och vuxna [2,10], även om WHO rapporterar att 89 procent av TB-fallen 2021 var vuxna [4]. Därför finns det ett akut behov av att utveckla ett nytt och effektivt vaccin mot tuberkulos, särskilt för ungdomar och vuxna.

Utveckling av tuberkulosvaccin kompliceras av flera egenskaper hos mykobakterier, såsom latent infektion, persistens och immunundandragande [11–13]. Ett idealiskt TB-vaccin bör utformas för att rikta in sig på de proteiner/vägar som är ansvariga för dessa egenskaper i M. tuberculosis och kunna effektivt inducera CD4 plus och CD8 plus T-cellsmedierade immunsvar [14].

Dessutom bör ett effektivt vaccin också rikta in värdens viktigaste histokompatibilitetskomplex (MHC), som är mycket polymorfa [15]. Dessa egenskaper ställer mycket höga krav på vaccinets mångsidighet, vilket uppenbarligen inte kan uppnås med ett enda naturligt protein. Multi-epitopvaccin, ett rekombinant protein som består av en serie överlappande epitoper (peptider) [16], är en ny typ av vaccinkandidat som kan lösa ovanstående problem.

Under de senaste åren har multi-epitopvacciner väckt stor uppmärksamhet på grund av deras fördelar med högre immunitet och lägre allergenicitet än konventionella vacciner [17,18]. För närvarande har multi-epitopvaccin designats mot många patogena mikroorganismer, inklusive Shigella spp. [19], mul- och klövsjukevirus [20], Helicobacter pylori [21,22], hepatit B-virus [23], Toxoplasma gondii [24], Leishmania infantum [25], Nipah-virus [26], Onchocerca volvulus [27], Pseudomonas aeruginosa [28] och leukosvirus [29].

I synnerhet har uppkomsten av covid-19-pandemin stärkt tillämpningen av denna teknik [16,30–32]. När det gäller TB har flera multi-epitopvacciner designats för att rikta in sig på inneboende aktiv TB [33–39] och latent TB [40,41]. Bland dem designades tre vaccinkandidater i form av DNA [34,36,40], och två av dem inkorporerade epitoper i proteinryggraden för att generera rekombinanta vacciner [34,36].

Det bör noteras att kandidatproteinerna för några av ovanstående multi-epitopvacciner är slumpmässigt utvalda, och populationstäckningen för dessa vacciner kräver ytterligare studier.

Dessutom designades två multi-epitop TB-vaccinkandidater med bred befolkningstäckning, en epitop valdes från immunogena exosomer vesikelproteiner med patogena egenskaper [39], och den andra fokuserar inte på kandidatproteiner, utan väljer direkt mycket konserverade och experimentellt validerade epitoper från Immune Epitope Database (IEDB) [38]. Emellertid saknar dessa kandidatproteiner funktionell anrikning, och förmågan hos vaccinkandidater att inducera interferon-(IFN-)-utsöndring återstår att förbättras.

En tidigare studie har dragit slutsatsen att rationell optimering av epitoper kan uppnås genom en kombination av MHC-bindningskapacitet och epitopens förmåga att reagera med T-cellsreceptorer [42]. Dessutom förutspådde de att vacciner med cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) A1-, A2-, A3-, A24- och B7-bindande epitoper skulle ha en täckning på nästan 100 procent i de stora etniska grupperna (svarta, asiater, latinamerikaner och kaukasier).

Men hittills har det inte funnits något liknande tillvägagångssätt för att designa ett TB-vaccin. I denna studie designade vi ett mycket promiskuöst multi-epitop TB-vaccin med hjälp av olika antigena egenskaper hos åtta funktionsberikade proteiner. Den chimära vaccinkandidaten besitter 15 CTL-epitoper, 16 hjälpar-T-lymfocytepitoper (HTL) med IFN- --inducerande egenskaper och 10 linjära B-cellsepitoper. Immunoinformatikanalys visade att denna vaccinkandidat var "alltäckande", vilket gör den till en potentiell hörnsten för att uppnå "The End TB-strategin".

2. Material och metod

2.1. Proteinurval och sekvenshämtning

För att konstruera ett multi-epitopvaccin mot TB valde vi först proteiner från M. tuberculosis-komplexet, som deponeras i IEDB-databasen [43] och har validerats som MHC klass I och II bindande epitoper. Aminosyrasekvenser (primär struktur) av proteiner från M. tuberculosis H37Rv-stammen erhölls från UniProt-databasen [44]. Justeringsoberoende förutsägelser av potentiella antigener baserade på fysikalisk-kemiska egenskaper erhölls från VaxiJen 2.0-servern [45], som genomgick automatisk och kors-kovarianstransformation (ACC) av proteinsekvenser till en enhetlig vektor av huvudaminosyra egenskaper, med antigenicitetströskeln inställd på 0.4 för varje bakterieprotein [45,46].

Funktionell annotering av proteiner utvärderades med hjälp av Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) 6.8 [47]. Utsöndrade proteiner berikades ytterligare med två kategorier: extracellulärt utrymme och patogenes genom databaserna DAVID respektive BioCyc [48]. Proteomet av Homo sapiens GRCh38.p13 laddades ner i FASTA-format från National Center for Biotechnology Information (NCBI) databas [49]. BLASTp användes för att förutsäga homologi (E-värde =1e-5) mellan utsöndrade proteiner och H. sapiens-proteiner.

2.2. T-cellsepitopprediktion

Förutsägelse och urval av epitoper är avgörande steg i konstruktionen av multi-epitopvacciner. MHC I-molekyler binder korta peptider (9–11 aminosyror) eftersom den peptidbindande klyftan av MHC I-molekyler som består av en enda kedja är stängd [50]. Den fritt tillgängliga NetMHCpan-4.1 [51] användes för förutsägelse av CTL-epitoper, som använder NNAlign_MA för att generera procentsatser (procentandel) baserat på en kombination av MHC I-bindningsaffiniteter och eluerade ligander .

"Procentrankningen" för en frågesekvens bestämdes genom att jämföra dess förutsägelsepoäng med fördelningen av förutsägelsepoäng för den relevanta MHC beräknad med användning av en uppsättning slumpmässigt valda nativa peptider. Epitoper med en procentandel < 0,5 procent ansågs vara starka bindemedel, medan epitoper med en procentandel < 2 procent ansågs vara svaga bindemedel [51].

Även om upp till 12 supertyp MHC klass I-epitoper kan förutsägas på servern, använde vi bara A1, A2, A3, A24 och B7 eftersom dessa fem supertyper täcker 100 procent av de stora mänskliga raserna [42] . Vi valde starka bindemedel och förutspådde deras antigenicitet med VaxiJen2.0 [45], sedan förutspådde vi klass I-immunogenicitet med hjälp av International Epitope Database (IEDB) [52], som använder 3-faldig korsvalidering.

Slutligen ordnade vi epitoper som var både antigena och immunogena enligt procentuell rangordning och valde ut 15 lågpoängande epitoper, tre för varje supertyp och minst en för varje kandidatprotein, förutom ett kandidatprotein som inte kunde ha en stark CTL-bindande epitop som är antigen och immunogen. Slutligen förutspåddes IC50-värden för varje CTL-epitop från NetMHC-4.0 [53].
Klass II MHC-molekyler binder till antigena peptider, och det resulterande komplexet kan kännas igen av HTL. Typiskt varierar antigena peptider i längd från 12 till 20 aminosyrarester, men peptider mellan 13 och 16 rester i längd observeras ofta [54].

{{0}}mererna var de mest förekommande MHC II-epitoperna för M. tuberculosis och har deponerats i IEDB. Som ett resultat använde vi NetMHCIIpan-4.0 [51,55] för att förutsäga bindningen av 15-mer-peptider till humant leukocytantigen-DR (HLA-DR), HLADQ, HLA-DP, och H-2–1 allel. Förutsägelsen baserades också på NNAlign_MA med en procentandel på < 2 procent och < 10 procent som anses vara starka respektive svaga bindemedel [51].

Dessutom förutspådde vi 15-mer IFN-inducerande epitoper för kandidatproteiner med hjälp av IFNepitope-servern [56], som använder en stödvektormaskinhybridmetod som möjliggör virtuell screening av IFN- -inducerande peptid/epitop i en peptid bibliotek bestående av IFN- -inducerbara och icke-inducerbara MHC II-bindare som aktiverar T-hjälparceller. Vi förutspådde sedan antigeniciteten hos de IFN-inducerande epitoperna [45], och slutligen valde vi de 16 mest promiskuösa epitoperna som var starkt MHC-II-bindande, IFN-inducerande och antigena.

Det är viktigt att notera att signalpeptider togs bort från kandidatproteiner före epitopförutsägelsen. I denna studie screenades signalpeptider med SignalP 5.0 [57] och TargetP2.0 [58].

2.3. Linjär B-cellsepitopprediktion

Linjära B-cellsepitoper (16-merer) förutspåddes med användning av ABCpred [59,60] med en standardtröskel på 0.51. Dessutom, för att öka tillförlitligheten av förutsägelseresultaten, använde vi också BepiPred 2.0 [61] för att förutsäga linjära B-cellsepitoper. Epitoper erhållna från dessa två mjukvaror utsattes ytterligare för antigenicitetsförutsägelse med hjälp av VaxiJen2.0 [45]. Slutligen valde vi tio linjära B-cellsepitoper baserat på höga ABCpred-poäng och antigenicitet, med minst en epitop vald för varje kandidatprotein.

2.4. Konstruktion av multi-epitopvaccinkandidaten med chimära egenskaper

Det designade multi-epitopvaccinet innehåller en HBHA (heparinbindande hemagglutinin) adjuvans, en Pan HLA DR-bindande epitop (PADRE), 15 CTL, 16 HTL, 10 linjära B-cellsepitoper och en His × 6-tagg (Fig. 3). Länkare användes för att förena epitoper, förhindra produktionen av korsningsepitoper och förbättra processionen och regenereringen av individuella epitoper i chimära vacciner [62].

För konstruktionen av denna vaccinkandidat placerades HBHA-adjuvansen (UniProt ID: P9WIP9) vid N-terminalen och länkades till nedströms PADRE via en EAAAK-linker. Sedan länkades HTL-epitoperna samman med GPGPG-länkarna till PADRE. Dessutom kopplades CTL-epitoper samman av AAY-linkern till HTL-epitoper via HEYGAEALERAG-linkern, som också förenade CTL-epitopenheten till linjära B-cellsepitoper kopplade med KK-linkers. Slutligen fästes en His×6-tagg till C-terminalen av det chimära proteinet.

2.5. Antigenicitet, allergenicitet och fysikalisk-kemiska egenskaper

Antigeniciteten för multipelepitopvaccinet och de åtta komponentproteinerna förutspåddes av VaxiJen 2.0-servern [45], medan allergeniciteten för dessa proteiner förutspåddes av AllerTOP 2.0-servern [ 63]. AllerTOP 2.0 använder aminosyra E-deskriptorer, ACC-transformation av proteinsekvenser och k-närmaste grannar (kNN) för allergenklassificering.

Metoden uppnådde 85,3 procents noggrannhet med 5-faldig korsvalidering. För att förutsäga fysikalisk-kemiska egenskaper såsom halveringstid, isoelektrisk punkt, instabilitetsindex, alifatiskt index och det stora genomsnittet av hydropaticitet (GRAVY) för detta multipelepitopvaccin användes ExPASy ProtParam-servern [64].
Vidare utvärderades lösligheten av multi-epitopvaccinpeptid med hjälp av proteinSol (PROSO II) servern [65] baserad på en klassificerare som utnyttjar de subtila skillnaderna mellan de välkända olösliga proteinerna från TargetDB och de lösliga proteinerna från både TargetDB och PDB [ 66]. När den utvärderades med 10-faldig korsvalidering, uppnåddes 71,0 procents noggrannhet (area under ROC-kurvan=0.785).

2.6. Immunsimulering

För att karakterisera immunsvarsprofilen och immunogeniciteten hos vaccinet utfördes in silico-immunsimuleringar med C-ImmSim-servern [67]. C-ImmSim förutsäger immuninteraktioner med hjälp av positionsspecifika poängmatriser härledda från maskininlärningstekniker för peptidprediktion.
Den simulerar samtidigt tre fack som representerar tre separata anatomiska regioner som finns i däggdjur: (i) benmärgen, där hematopoetiska stamceller simulerades för att producera nya lymfocyter och myeloidceller; (ii) tymus, där naiva T-celler selekterades för att undvika autoimmunitet; och (iii) det lymfatiska organet såsom lymfkörtlar.

För att effektivt förbereda och förstärka vaccinet följde vi metoden från [68] där två injektioner administrerades med fyra veckors mellanrum. Alla simuleringsparametrar var inställda på standardvärden, med tidssteg inställda på 10 och 94 (varje tidssteg är åtta timmar).

2.7. Förutsägelse av störd region

Intrinsically disordered regions (IDR) finns i många proteiner. Den oordnade regionen förutspåddes med hjälp av DISOPRED3 [69], som använder DISOPRED2 och två andra maskininlärningsbaserade moduler tränade på stora IDR för att identifiera störda rester. De var då anno

2.8. Förutsägelse av sekundär och tertiär struktur

Den sekundära strukturen för det designade vaccinet förutspåddes av PSIPRED 4.0-servern [70], som först använder PSI-BLAST för att identifiera sekvenser som är nära relaterade till frågeproteinet. Den tertiära strukturen för detta vaccin förutspåddes med hjälp av servern Iterative Threading Assembly Refinement (I-TASSER) [71].

Det finns fyra nyckelsteg i ITASSER-modellering; a) Identifiering av gängmall; b) Iterativ simulering av struktursammansättning; c) val av modell och förfining; och d) strukturbaserad funktionell anteckning [72,73].

I-TASSER genererade fem modeller, som screenades med ProSA-web [74], och modellen med lägst Z-poäng valdes för ytterligare förfining. ProSA-web jämför modellpoängen som erhållits från experimentellt verifierade strukturer deponerade i PDB. En lokal kvalitetspoängplott hjälper till att identifiera problematiska områden i modellen, och samma poäng representerades med hjälp av en färgkod på presentationen av 3D-strukturen. Detta är användbart för tidig strukturell bestämning och förfining.

2.9. Förfining av tertiär struktur

Den "grova" 3D-modellen av vaccinkandidaten som erhölls av ITASSER förfinades i två steg med två servrar; först med ModRefiner [75] följt av GalaxyRefine [76]. ModRefiner använder C-spår för att påverka konstruktionen och förädlingen av proteiner som erhålls genom energiminimering på atomnivå i två steg.

Först användes C-spåren för att konstruera huvudkedjan, följt av förfining av sidokedjerotamerer och ryggradsatomer med hjälp av fysik- och kunskapsbaserade sammansatta kraftfält. GalaxyRefine använder flera mallar för att generera pålitliga kärnstrukturer, medan otillförlitliga loopar eller terminaler genererades av optimeringsbaserad modellering.

2.10. Tertiär strukturvalidering

Den förfinade strukturen hos vaccinkandidaten validerades av Ramachandran-diagram genererade från databaserna PROCHECK [77] och MolProbity [78]. Ramachandran-plottar utvärderar ryggradskonformationen av proteiner genom att dela aminosyrarester i två regioner: tillåtet och otillåtet. PROCHECK använder stereokemi för att bedöma nettokvaliteten av proteinstrukturer genom att jämföra dem med de raffinerade strukturerna med samma upplösning och sedan presentera regioner som kräver ytterligare analys.

Molprobity validerar lokala och globala makromolekylmodeller (proteiner och nukleinsyror) genom en blandning av röntgen-, NMR-, beräknings- och cryoEM-kriterier [79]. Kraften och känsligheten för att optimera väteplacering och allatomkontaktanalys används i stor utsträckning i en uppdaterad version av kriterierna för kovalent geometri och torsionsvinkel [80].

2.11. Diskontinuerliga B-cellsepitoper

Diskontinuerliga B-cellsepitoper i den naturliga proteinstrukturen förutspåddes med hjälp av ElliPro [81]. ElliPro implementerar tre algoritmer för att approximera proteinformen som en ellipsoid, beräknar restprotrusion index (PI) och kluster angränsande rester baserat på deras PI-värden. ElliPro förser varje utgående epitop med en poäng som beskrivs som det genomsnittliga PI-värdet för epitopresten. En ellipsoid med ett PI-värde på 0.9 består av 90 procent av de ingående proteinresterna, medan de återstående 10 procenten av resterna ligger utanför ellipsoiden. För varje epitoprest beräknas PI-värdet från restens masscentrum som ligger utanför största möjliga ellipsoid.

2.12. Molekylär dockning av chimära proteiner

Molekylär dockning av det designade vaccinet (ligand) med Toll-Like Receptor-4 (TLR4) (PDB ID: 3FXI) immunreceptor utfördes med Patchdock [82]. De 10 bästa modellerna förfinades sedan med FireDock [83]. PatchDock ersätter Connolly-punktytrepresentationen av molekylerna med konkava, konvexa och platta fläckar.

Modellerna poängsattes sedan baserat på geometrisk passform och atomär desolvation. [82]. FireDock optimerar sidokedjekonformationer och orientering av den stela kroppen och genererar en utmatning av ett 3D-förfinat komplex baserat på bindningsenergin [83]. Vi valde den första modellen av Firedock baserad på global energi som dockningskomplex. Slutligen förutspåddes bindningsenergin och dissociationsinnehållet i dockningskomplexet med hjälp av PRODIGY-servern [84].

2.13. Simulering av molekylär dynamik

Molekylär dynamiska simuleringar utfördes på proteiner med hjälp av den snabba och fritt tillgängliga webbservern, interna koordinater normallägesanalysserver (iMODS) [85], och konsekventa och optimala dockningsresultat erhölls från PatchDock-FireDock-servern. I interna koordinater genererar Normal Mode Analysis (NMA) kollektiva rörelser som är avgörande för makromolekylär funktion. iMODS presenterar mekanismer för att utforska dessa lägen som vibrationsanalys, rörelseanimationer och morphingbanor som utfördes nästan interaktivt vid olika upplösningar [85].

2.14. Omvänd translation, kodonoptimering och in silico-kloning av vaccinet

För att effektivt uttrycka vaccinkandidaten i Escherichia coli-celler genererades cDNA i silico genom kodonoptimering och omvänd translation med hjälp av Java Codon Adaptation Tool (JCAT) [86].

Optimering involverade (i) undvikande av rho-oberoende transkriptionsterminatorer, ii) undvikande av prokaryota ribosombindningsställen, (iii) undvikande av klyvningsställen för restriktionsenzymer Ncol och XhoI, som fungerar som N-terminala och C-terminala restriktionsställen för införande av cDNA mall av vaccin, och (iv) endast partiell optimering för att tillämpa platsriktad mutagenes. Codon Adaptation Index (CAI) och GC-innehåll förutspådde kvaliteten på cDNA:t med ett opalt stoppkodon (TGA) infogat efter His×6-taggen. Sedan integrerades det optimerade DNA-fragmentet av den chimära vaccinkandidaten i den omvända strängen av pET-28a(plus) med hjälp av SnapGene-verktyget [87].

For more information:1950477648nn@gmail.com