Integrativ Omics-analys avslöjar mikrovaskulära inflammationsrelaterade vägar i njurallograftbiopsier

edmund.chen@wecistanche.com

Vid transplantation av fasta organ har mikroRNA (miRNA) dykt upp som nyckelspelare i regleringen av allotransplantatcellsfunktion som svar på skada. För att få insikt i miRNA:s roll i antikroppsmedierad avstötning, en avstötningsfenotyp som histologiskt definieras av mikrovaskulär inflammation,njure allotransplantatbiopsier utsattes för miRNA men även messenger RNA (mRNA) profilering. Genom att använda en unik flerstegs selektionsprocess som är specifik för BIOMARGIN-studien (upptäckskohort, N=86;selektionskohort, N=99; valideringskohort, N=298),sex differentiellt uttryckta miRNA identifierades konsekvent: miR-139-5p (ned) och miR-142-3p/150-5p/155-5p/{ {7}}p/223-3p (upp). Deras uttrycksnivå korrelerade gradvis med mikrovaskulär inflammationsintensitet. Cellspecificiteten för miRNAs målgener undersöktes genom att integrera deras in vivo mRNA-mål med encellig RNA-sekvensering från en oberoende allotransplantatbiopsikohort. Endotelhärlett miR-139-5p-uttryck korrelerade negativt med MHC-relaterade genuttryck. Omvänt var epitelhärledd miR-222-3p-överuttryck starkt associerat med försämrad njurelektrolythomeostas och undertryckta immunrelaterade vägar. I immunceller reglerade miR-150-5p NF-kB-aktivering i T-lymfocyter medan miR-155-5p reglerade mRNA-splitsning i antigenpresenterande celler. Sammantaget gjorde integrerade omics det möjligt för oss att reda ut nya vägar involverade i mikrovaskulär inflammation och tyder på att metabolismändringar i tubulära epitelceller inträffar som en konsekvens av antikroppsmedierad avstötning, bortom det närliggande endotelfacket.

Nyckelord:njurtransplantation, mikroRNA, multi-omics, mikrovaskulär inflammation, antikroppsmedierad avstötning

CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR-/NJÖRSJUKDOMAR

INTRODUKTIONInjurtransplantation(KT), alloimmun skada delas vanligtvis upp i två typer av allotransplantatavstötning enligt den rumsliga fördelningen av immuninfiltration och information om närvaro eller frånvaro av donatorspecifika anti-HLA-antikroppar. Diagnosen förlitar sig på allotransplantatbiopsi med gradering av histologiska lesioner enligt Banff International Consensus-klassificering(1). Tubulit ("t" lesion) och interstitiell inflammation ("I" lesion) är kännetecknande histologiska kännetecken för T-cellsmedierad avstötning (TCMR) och är relaterade till direkt cytotoxicitet till tubulointerstitiellt utrymme. Antikroppsmedierad avstötning (ABMR) är oftast förknippad med cirkulerande anti-HLA-antikroppar med inflammation som riktar sig mot det mikrovaskulära utrymmet. Aktiva ABMR histologiska lesioner inkluderar närvaron av mononukleära celler i glomerulära kapillärer ("g"lesion) och i peritubulära kapillärer ("ptc" lesion), kombinerat kallad "mikrovaskulär inflammation" (MVI). Vid kronisk aktiv ABMR bidrar kronisk vävnadsskada som transplantationsglomerulopati eller arteriell intimal fibros till dessa akuta lesioner(1). Genom att använda de nuvarande T'-cell-inriktade immunsuppressiva medlen anses TCMR ha en begränsad prognostisk effekt, medan ABMR är en viktig orsak till transplantatfel, vilket relaterar till bristen på effektiva terapeutiska metoder (2).

För att hitta bättre terapier för MVI och ABMR behövs bättre insikt i de biologiska mekanismer som ligger bakom dessa skadeprocesser. Omics-tekniker med hög genomströmning verkar vara lämpliga för ändamålet eftersom de tillåter exakt och samtidig screening av tusentals gener, proteiner och metaboliter(3). Heltranskriptomförhör avnjureallotransplantatbiopsier har visat djupgående mRNA-genuttrycksförändringar i de skadade bosatta cellerna eller i infiltrerande cellpopulationer under ABMR(4). Under tiden har mikroRNA (miRNA) dykt upp som nyckelspelare i cellmetabolism, genom att reglera budbärar-RNA (mRNA) på posttranskriptionell nivå. Faktum är att miRNA revolutionerade vår förståelse av finjusteringen av kroppens fysiologiska processer involverade i proliferation, apoptos, differentiering och utveckling(5). Inte överraskande resulterar dysregulerat miRNA-uttryck i utvecklingen av många patologier inklusivenjursjukdom(6). Eftersom miRNA-uttrycksprofiler skiljer sig mellan sjuka och friska tillstånd, har många studier analyserat miRNA antingen ensamma eller i kombination med andra mer traditionella markörer, inte bara för att diagnostisera sjukdom och prognosticera sjukdomsprogression utan också för att utforma potentiella terapeutiska tillämpningar (7).

I samband med transplantation av fasta organ kan miRNA vara inblandade i avstötning genom sin roll i regleringen av immuncellsfunktion och i svaret hos celler som bor i allotransplantat på skada (6,8). Flera studier har undersökt allograft-miRNA som biomarkörer och/eller effektorer i TCMR-miljöer (8,9), men ingen har hittills fokuserat på MVI och ABMR. I denna studie syftade vi till att integrera olika omics-nivåer frånnjureallotransplantatbiopsier, för att få insikt i miRNA:s roll i denna skadliga avstötningsfenotyp.

MATERIAL OCH METODER StudiedesignDen här studien är en del av de FP7-finansierade BIOMArkers ofNjurGraft Injuries forskningsprogram (BIOMARGIN, https://cordis.europa. eu/project/id/305499, ClinicalTrials.goy, nummer NCT02832661), ledd av ett europeiskt forskningskonsortium på jakt efter biomarkörer för allograftimmunskador injurtransplantationmottagare, med diagnostiskt och/eller prognostiskt värde. BIOMARGIN är en multicenter, prospektiv flerfasstudie, utförd vid fyranjurtransplantationcentra i Europa (Necker Hospital, Paris, Frankrike; Universitetssjukhus, Leuven, Belgien; Hannover Medical School, Hannover, Tyskland; och Universitetssjukhuset, Limoges, Frankrike). Prover togs prospektivt vid tidpunkten för screening och indikationsbiopsier mellan april 2013 och juni 2015 (Figur IA). Alla transplantationer utfördes med negativa komplementberoende cytotoxicitetskorsmatchningar. I dessa fyra kliniska centra utfördes protokollbiopsier vid 3,12 och ibland 24 månader efter transplantation, enligt lokal praxis, utöver indikationsbiopsierna. Den institutionella granskningsnämnden på varje plats godkände studien och alla patienter gav skriftligt informerat samtycke.

StudiekohorterStudien var uppdelad i tre faser (Figur 1A). I ​​den första fasen för upptäckt av fallkontroll användes N=88-biopsiprover för global miRNA-expressionsanalys (N=754 miRNA, exklusive potentiellt normaliserande miRNA) . Vi valde prover baserat på tillgänglighet och histologiska kriterier (exklusive fall med en diagnos av glomerulonefrit eller polyomavirus-associerad nefropati och fall med en oklar diagnos). Baserat på lokala biopsiavläsningar gjordes ett första urval som ytterligare förfinades genom central läsning av en grupp patologer, oberoende av det ursprungliga centret. Statistisk analys (se miRNA-val) användes för att välja den utökade listan av miRNA, mest differentiellt uttryckt mellan histologiska fenotyper, som därefter kvantifierades i den andra fasen.

En liknande fall-kontrollstudiedesign användes för den andra (selektions)fasen, där målinriktad miRNA-expressionsanalys (N=143) utfördes på N=99 biopsiprover. Samma statistiska pipeline användes för att välja en ännu mer begränsad lista av miRNA, som därefter kvantifieras i den tredje fasen. Slutligen, i den tredje (validerings)kohorten, samlades alla prover prospektivt och i följd enligt BIOMARGIN-protokollet mellan 24 juni 2014 och 2 juli 2015, och med adekvatanjureallotransplantatbiopsikvalitet, bedömdes för de 38 miRNA som valts ut som ett resultat av den andra urvalsfasen. I denna kohort i verkligheten gjordes inget urval baserat på histologi, demografi, tid eller någon annan faktor än provtillgänglighet och kvalitetskontrollkriterier (tillräcklighet för biopsi och RNA-utbyte).

urval av miRNAEn robust statistisk pipeline utvecklades specifikt för BIOMARGIN-studien i R(R Core Team(10), version 1.0.44), som en förlängning av biosignal R-paketet(1l). Kortfattat, i upptäcktsfasen genomförde vi en funktionsvalstrategi inklusive univariata och multivariata tillvägagångssätt. För univariat urval använde vi ett icke-parametriskt test (Wilcoxon-Mann-Whitney-test) och ett parametriskt test (Students t-test) och en Discovery-kohort (BIOS-03-0023, BIOS-06-0238). Förutsägelsepoängen för varje miRNA-transkript i varje multivariatmodell integrerades för att ge en "multivariatpoäng". Genom att kombinera resultaten av dessa univariata och multivariata analyser kunde vi rangordna och välja en undergrupp av miRNA-kandidater för att vara en del av den utökade listan som ska kvantifieras under nästa fas.För denna posthoc-analys med fokus på VMI-vägar jämfördes mediannormaliserade uttrycket av varje miRNA mellan fall och kontroller med Wilcoxon-testet i alla tre kohorter. Vi kontrollerade för flera tester med Benjamini & Hochbergs metod för falsk upptäcktsfrekvens (FDR).

Klinisk patologisk bedömningDe individuella histologiska lesionspoängen utvärderades semikvantitativt enligt Banff 2019-kriterierna(16). Termen "mikrovaskulär inflammation" (MVI) användes för att hänvisa till vilken grad av kombination som helst av glomerulit (g) och/eller peritubulär kapillärinflammation (ptc). Alla ABMR-fall uppfyllde de två första kriterierna i klassificeringen Banf 2015 eller Banff 2017 (histologiska bevis på akut vävnadsskada och bevis på aktuell/nylig antikroppsinteraktion med vaskulärt endotel), men alla uppfyllde inte det tredje kriteriet [serologiska bevis för donatorspecifika antikroppar (DSA) och/eller CAd-färgning]. DSA efter transplantation bestämdes per lokalt centrumpraxis, med DSA-positivitet definierad som detekterbara donatorspecifika anti-HLA-antikroppar i serum med medelvärde för fluorescensintensitet (MFI) på 500 vid tidpunkten för biopsi eller någon gång tidigare.

RNA-extraktion från biopsiprover för mRNA- och miRNA-profileringTvånålskärnor togs vid varjenjureallotransplantatbiopsi. Den ena användes för konventionell histologisk gradering och minst hälften av den andra förvarades omedelbart i Allprotect Tissue Reagent (Qiagen Benelux BV, Venlo, Nederländerna). Allprotect-rören förvarades vid 4C (minst 24 timmar till maximalt 72 timmar) , och lagras sedan vid -20 grad tills RNA-extraktion. Totalt RNA isolerades frånnjureallograft biopsiprover med Allprep DNA/RNA/miRNA Universal Kit (Qiagen Benelux BV) på ett QIAcube-instrument (Qiagen Benelux BV). Kvantiteten (absorbans vid 26{{20}} nm) och renhet (förhållandet mellan absorbansen vid 230 260 och 280 nm) av det isolerade RNA:t mättes med hjälp av NanoDrop ND-1000-spektrofotometern (Thermo) Fisher Scientific/Life Technologies Europe BV, Gent, Belgien). RNA-integritetsnummer (RIN) utvärderades med Eukaryote nano/pico RNA Kit (Agilent Technologies Belgium NV, Diegem, Belgien) på Bioanalyzer 2100-instrumentet (Agilent Technologies BelgiumNV). Kvalitetskontrollindex skilde sig inte signifikant mellan VMI och No. MVI-grupper [RIN(medel±SD):5,6±1,96vs5,4±1,97,P=0.66;260/280-förhållande (medel±SD):1,87±0,06 vs 1,87±0,1l,P{{26 }}.40]. För RNA-prover med lågt RIN(<6.5), we="" excluded="" samples="" with="" a="" 260/280=""><1.6. the="" extracted="" rna="" was="" subsequently="" split="" and="" stored="" at="" -80℃℃.half="" of="" the="" rna="" extract="" was="" used="" for="" mirna="" profiling="" and="" the="" other="" half="" for="" mrna="" transcriptomic="" analysis.="" the="" associated="" data="" are="" available="" from="" the="" gene="" expression="">

CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR/NJURDIALYS

miRNA profileringSpecific reverse transcription of 150ngof total RNA was performed using Megaplex"RT Primers Human Pool A v2.1(Step 1)or Custom RT Primers Human Pool (Step 2 and 3)(Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France), on a Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). No complementary(c)DNA preamplification was required. miRNA expression was assessed by qPCR, using TaqManArray Cards (Applied Biosystems", Thermo Fisher Scientific), where the primers and probe of each miRNA were spottedanddried in duplicate wells of a microfluidic card. We used TaqMan"Array Human MicroRNA A +B Card Sets v3.0 for the discovery cohort(a two-card set enabling quantitation of 754 unselected human miRNAs)and Custom TaqManArray MicroRNA Cards for the selection and validation cohorts. Data analysis was performed by using Expression Suite software version 1.0.3. Assays with a cycle threshold(CT) values >35 ansågs inte vara uttryckta. RNU44 och RNU48 visade konsekvent uttryck i alla provens medelvariationskoefficient (RNU44 plus RNU48) var 3,73 procent i Array Card A och 3,79 procent i Array Card B] och användes som hushållningsgener för datanormalisering i alla delstudier.

mRNA-transkriptomisk analysTranskriptomisk analys utfördes med mikroarray som redan beskrivits (17). Kortfattat, totalt RNA extraherat från biopsiproverna amplifierades först och biotinylerades till komplementärt RNA(cRNA) med hjälp av GeneChip 39 IVT PLUS Reagent Kit (Affymetrix) och hybridiserades till Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays( Affymetrix), som omfattade 54 675 probuppsättningar som täckte hela genomet. Vi använde en Robust Multichip Average (RMA)-normalisering. Mediannormaliserat uttryck för varje mRNA jämfördes mellan fall och kontroller med Wilcoxon-testet. Vi kontrollerade inflationen av risk alfa på grund av flera tester genom att använda Benjamini & Hochbergs metod för falsk upptäcktsfrekvens (FDR). Mikroarraydata hanterades i enlighet med riktlinjerna för minimiinformation om mikroarrayexperiment.

I Silico AnalyserBiologisk tolkning av Multiomics EXperiments (BIOMEX)-mjukvara användes för transkriptomisk datadifferentiell analys, med hjälp av Ensembl ID-anteckning(18). Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Bygg: 478438M Innehållsversion: 44691306, Qiagen) och OMICSnet(19) användes för att bestämma uppsättningar av gener som regleras av de utvalda miRNA:erna. OMICSnet användes för att utföra Gene Ontology-analys med Reactome-vägdatabasen, med hjälp av hela vägen (20). Byggandet av gennätverk var helt oövervakat och förlitade sig på antalet rapporterade molekylära interaktioner av varje enskild gen med alla andra gener i nätverket. Gener som presenterade det högsta antalet interaktioner placerades automatiskt i mitten av nätverket, medan generna med ett lägre antal interaktioner spreds ut i periferin. Det cellulära ursprunget för utvalda miRNA undersöktes med Fantom5-projektet(21), som tillhandahåller en cap-analys av genuttryck i mänskliga celler och vävnader. För miRNA-uttrycksanalys ansåg vi allanjure-relaterade strukturella celler och alla cirkulerande hematopoetiska celler, utan ytterligare selektion.

Encellig RNA-sekvenseringsdataanalysTidigare publicerade humana encelliga RNA-sekvenseringsdata (siRNA-seq) från två ABMR-biopsier och fyra friska referenser motsvarande transplantationsövervakningsbiopsier användes. De associerade råräkningarna eller matriserna laddades ner från GEO (GSE145927, https://www.ncbi.nlm. nihgov/geo)(22) ochNjurePrecisionsmedicinprojekt (KPMP, https://atlas.kpmp.org/repository). Rå genuttrycksmatriser genererade per prov slogs samman och analyserades med Seurat V4-paketet (23). Parametrarna som användes för att skapa och filtrera Seurat-objekt var följande: inkludering av celler som uttrycker mellan 500 och 10 000 detekterade gener och mindre än 25 procent mitokondriella transkript. Efter filtrering integrerades alla objekt med SCTransforms integrationsarbetsflöde på Seurat (24). Kortfattat användes 3000 funktioner för integration med PrepSCTIntegration-funktionen, och FindIntegrationAnchors-funktionen användes för att begränsa batcheffekten. En fullständig Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) datauppsättning genererades med hjälp av DimPlot-funktionen och de 16 främsta huvudkomponenterna. Kluster byggdes med funktionerna FindNeighbors och FindClusters med en upplösning på 0,6. Klusteridentifiering utfördes med hjälp av FeaturePlot-funktionen genom att utvärdera uttrycket av specifika markörer i varje kluster. Punktdiagram genererades med hjälp av DotPlot- och FeaturePlot-plotningsfunktionerna, med normaliserade räkningar i RNA-analysen som indata.

CISTANCHE KOMMER ATT FÖRBÄTTRA NJUR-/NJURINFEKTION

Statistisk analysPatient- och donatoregenskaper beskrevs med siffror, procentsatser och frekvenser för kategoriska variabler. Vi rapporterade kontinuerliga variabler med hjälp av medelvärden och standardavvikelser (SD) om normalfördelade, medianer och interkvartilintervall (IQR) för variabler med en skev fördelning. Vi jämförde deras egenskaper med Fisher- eller Wilcoxon-testet när så var lämpligt. Vi använde Kruskal-Wallis-testet för att jämföra medianmiRNA-uttrycket enligt MVI-intensitet och Spearman-testet för korrelationsanalys. Vi övervägde statistisk signifikans för P-värden mindre än 0.05. Vi använde GraphPad Prism (version 8; GraphPad Software, San Diego, CA) och RStudio (version 4.0.3) för statistisk analys och datapresentation. Följande R-paket användes: heatmap3 (heatmap3_1.1.9) för heatmap-analyser, fmsb(fmsb_0.7.0) och skalor (scales_1.1.1)paket för radarplots, ggplot2 (ggplot2_3.3.5) för stapeldiagram och complot(corrplot_0.90) för korrelationsmatrisanalys.

RESULTAT

Flerstegsidentifiering av MVI-associerade miRNABetween April 2013 and July 2015,646 patients enrolled in the BIOMARGIN study provided 716 indication or surveillance biopsies. Inadequate biopsies (N=49), biopsies with no paired sample for research use(N=135)or samples not passing molecular biology QC(N=49) were excluded, leaving 483 samples from 441 individuals available for this study (Figure 1A). Baseline and clinical characteristics of the study groups are provided in Supplementary Tables S1-3, and the histological characteristics of the biopsies are provided in Supplementary Tables S4-6. In the discovery cohort, a total of 27 patients met the MVI composite endpoint(MVI+), defined as clinical ABMR diagnosis and/or any level of MVI(g and/or ptc>0). De övriga 59 patienterna (MVI-) uppvisade olika diagnoser innefattande T-cellsmedierad avstötning (TCMR, N=8), interstitiell fibros och tubulär atrofi (IFIA,N=20), och normala biopsier (N{{6} }}), men ingen MVI. Från de 754 miRNA-kandidaterna uttrycktes 18 miRNA differentiellt mellan MVI plus- och MVI-grupper (Figur 1B). I urvalskohorten kvantifierades en begränsad lista med 143 miRNA i 99 prover. I denna urvalskohort uttrycktes 14 miRNA differentiellt mellan fall med (N=28) och utan (N=71)ABMR (Figur 1C). Slutligen, i den största transsektionella kohorten, kvantifierades 38 miRNA i 298 prover, varav 12 miRNA uttrycktes differentiellt mellan ABMR(N=29) vs inga ABMR (N=269) biopsier (Figur 1D) ).

Konsekvent identifiering av 6 MVI-associerade MiRNA och korrelation till histologiDärefter korsade vi de 3 listorna med differentiellt uttryckta miRNA och identifierade 6 miRNA som var konsekvent associerade med MVI eller ABMR över de 3 oberoende kohorterna (Figur 2A). miR-142-3p,miR-150-5p,miR -155-5p, miR-222-3p och miR-223-3p överuttrycktes i MVI/ABMR, medan miR-139-5p-uttrycket minskade. Radarplots (Figur 2B) visar för varje steg det differentiella uttrycket mellan fall och kontroller av de 6 miRNA och stödjer robustheten hos miRNA-profilerna över de tre oberoende kohorterna. Därefter studerade vi hur uttrycket av 6 miRNA är associerat med individuella histologiska lesioner över alla 483 allotransplantatbiopsier tillsammans. Uttrycket av de 5 uppreglerade miRNA:n ökade gradvis med MVI-lesionsintensiteten, medan uttrycket av miR-139-5p var negativt korrelerat (Figur 2C).MiR-139-5p/142-3p/ 150-5p/155-5p/223-3p var inte bara starkt associerade med ABMR-relaterade egenskaper (g, ptc, C4d-deposition), utan också med TCMR-relaterade lesioner(i, t ) och IFTA-lesioner (ct, ci), vilket tyder på deras inblandning i vanliga, icke-ABMR-specifika, inflammatoriska och ärrbildningsprocesser. Alternativt kan viss inre kollinearitet av naturen existera mellan lesionerna, vilket resulterar i vår oförmåga att identifiera verklig specificitet för en lesion. MiR-222-3p korrelerade inte med histologiska lesioner av TCMR eller IFTA (Figur 2D).

Multi-Omics-integration: mRNA-miRNA-samspel i MVDärefter utvärderade vi de differentiellt uttryckta generna mellan MVI plus och MVI-fall, i den tidigare publicerade upptäcktsuppsättningen (25). Av de 54 675 sonderna identifierades totalt 2755 differentiellt uttryckta gener (DEG) mellan MVI plus och MVI-

grupper, innefattande 1085 nedreglerade och 1670 uppreglerade gener (Figur 3A). De mest differentiellt uttryckta mRNA i MVI plus-prover var CXCL9 och CXCL10, i linje med tidigare rapporter (17,26) att dessa gener är de mest överuttryckta i ABMR. Därefter använde vi IPA och OMICSnet för att i silico identifiera de förmodade målgenerna för varje miRNA. Totalt 4504 mRNA förutspåddes vara målinriktade av minst en av de 6 miRNA:erna. Sedan integrerade vi dessa 4504 förutsagda mål med DEG i allotransplantatbiopsier. Integrerad miRNA/mRNA-analys identifierade 61 DEG riktade mot miR-139-5p som ökade signifikant i MVI plus biopsier. Den identifierade också 28, 58, 52, 43 och 27 DEG signifikant minskade i MVI plus biopsier som var respektive målinriktade av miR-142-3p, miR-150-5p, miR-155-5p, miR{ {22}}p,och miR-223-3p (Figur 3B).

Cellulärt ursprung för de MV-associerade miRNA:ernaDet cellulära ursprunget för de sex miRNA:n karakteriserades i olikanjur-cell- och hematopoetiska cellsubtyper med hjälp av miRNA-atlas tillgänglig online [Fantom-databas (27)]. Oövervakad klustring diskriminerasnjur-cellhärledda miRNA från immuncellshärledda miRNA (Figur 4A). Det avslöjade också en eller två dominerande celltyper för varje miRNA. MiR-139-5p verkade huvudsakligen uttryckas av glomerulära endotelceller (EC). MiR-222-3p, även om dess uttryck inte var korrelerat med tubulär inflammation (Banff lesions"t", figur 2D), var främst relaterat tillnjur-epiteliala celler. De fyra återstående miRNA:n uttrycktes primärt i perifera mononukleära blodceller (PBMC) eller granulocyter, med miR-142-3p anrikat på NK-celler och monocyter, miR-150-5p i CD4 plus och CD8 plus T-celler,miR -155-5p i CD19 plus B-celler och makrofager, ochmiR-223-3p i neutrofiler.

Encellig RNA-sekvensering identifierade alla njurceller och infiltrerande immunceller För att karakterisera den potentiella rollen för varje MVI-associerad miRNA, analyserade vi offentligt tillgängliga sc-RNAseq-data från tvånjur-allotransplantatbiopsier med ABMR och höga MVI-poäng (g2, ptc3)(22). Dessa datauppsättningar integrerades med 4 friska referensbiopsier utan MVI. Efter kvalitetskontroll och filtrering upptäcktes 31545 celler och oövervakad klustring avslöjade 12 kluster (Figur 4B). Vi använde väletablerade markörer (28) för att identifiera alla de huvudsakliga bosatta och infiltrerande cellsubtyperna och märka dem (kompletterande figur S2). Därefter fokuserade vi på cellpopulationerna från vilka våra sex miRNA troddes komma från. I detta syfte stratifierade vi cellerna i 4 stora kluster som motsvarar endotelet, epitelet, lymfocyterna och APC:er (Figur 4C). I linje med tidigare analys av dessa data (22) upptäcktes varken neutrofila eller NK-cellpopulationer i sc-RNASeg-datauppsättningarna.

miR-139-5p Styr EC-aktivering och antigenpresentationsväg under MVIMiR-139-5p var det enda nedreglerade miRNA:t i vår studie i fall med MVI/ABMR (Figur 2A) och visade sig huvudsakligen härröra från glomerulär EC (Figur 4A). Sextioen av dess målgener bekräftades vara uppreglerade i bulkmikroarray från MVI plus-fall (Figur 3B) och deras uttryck undersöktes ytterligare vid encellsupplösning i de tre tidigare identifierade EC-subklusterna (Figur 4B, C). Såsom visas i figur 5A var det aktiverade ECclustret endast detekterbart i MVI plus-prover. Dessutom ökade hälften av de 61 generna (N=30) konsekvent i sc-RNAseq MVI plus biopsier, oavsett de tre EC-subklusterna. Bland dessa var GBP5 den mest ökade genen. Därefter identifierade genontologianalys med användning av dessa 30 endotelhärledda transkript UBE2D1 och YWHAG som centrala aktörer i gennätverket (Figur 5B). Mer specifikt anrikades immunrelaterade vägar och major histocompatibility complex (MHC)-medierad antigenbearbetnings- och presentationsvägar (Figur 5C). Pseudotidsanalys utfördes för att bättre karakterisera genuttrycksförändringar under förloppet av EC-aktivering, över cellers tillståndsbana (Figur 5D, E), UBE2D1, YWHAG och GBP5 ökade kontinuerligt under MVI-associerad endotelaktivering. Mycket liknande banor hittades för MHC-relaterade gener HLA-A,-B och -DRA men också för bonafide endotelaktivering och inflammationsmarkörer såsom VCAM1, CXCL9 och CXCL10, vilket tyder på att alla dessa gener uttrycks samtidigt under endotelaktivering. Sammantaget tyder dessa resultat på att miR-139-5p minskar under MV-lesioner och inte längre undertrycker MHC-antigenpresentationsvägen i aktiverad EC.

miR-222-3p försämrar bådaNjurFysiologiska och immunrelaterade vägar i epitelceller under MVI Därefter fokuserade vi på miR-222-3p, ett uppreglerat miRNA i MVI-prover med ennjur-epitelcellsursprung och en mer exklusiv korrelation till ABMR-relaterade histologiska lesioner (Figur 2A, D, 4A). I ​​bulk allograftvävnad nedreglerades uttrycket av 43 av dess målgener (Figur 3B) och utvärderades ytterligare vid en enkel- cellupplösning i de olikanjur-epitelpopulationer som vi tidigare identifierat (figur 4B, C). En massiv minskning av 41 av dessa 43 (95 procent) gener över alla identifieradenjur-epitelcellskluster antyder en gen-tystnad

profil i VMI (Figur 6A). Intressant nog är fyra gener involverade injur-fysiologiska vägar (ERBB4, ATPIB1, TIMM50 och KIF3B), men även immunrelaterade gener (TRAPI och PEBPI) identifierades som centrala gener i nätverket (Figur 6B). Genontologi för the43-generna avslöjade anrikning i ErbB-signalvägar men också i immunrelaterade vägar och cytokinsvar (Figur 6C) och ERBB4-uttryck bekräftades ytterligare över allanjur-celler (Figur 6D). Sammantaget tyder dessa resultat på att under VMI, en hög nivå av-222-3p innjur-epitelceller är associerad med starkt undertryckande av gener involverade i bådenjur-elektrolythomeostasvägar och immunrelaterade vägar i epitelet.

miR-150-5p reglerar NF-kB-aktivering i T-lymfocyter under MVI På liknande sätt undersökte vi den reglerande rollen av (ökad) miR-150-5p under MVI i T-cellsklustret, där det var mest dominant uttryckt (Figur 4A). Vi plottade de 58 minskade MVI-associerade DEG som identifierats i bulk-allotransplantatbiopsiprover (Figur 3B) och vi konfronterade det med genuttryck i sc-RNAseq T-cellsklustret (Figur 7A). Andelen gener både målinriktade av miR150-5p och specifikt underuttryckta i T-celler under MVI var förvånansvärt låg (15/58,25,9 procent), vilket tyder på att den globala minskningen av dessa gener in vivo inte uteslutande berodde på T-lymfocytfack. Icke desto mindre, från denna mycket utvalda lista med 15 gener och med hjälp av OMICSnet-plattformen, konstruerade vi ett gennätverk (Figur 7B) och utförde genontologianalys (Figur 7C). Vi observerade att miR-150-5p-överuttryck var associerat med NF -KB-reglering i T-lymfocyter under MVI.

miR-155-5p Reglerar mRNA-splitsning i APC:er under MV Slutligen tillämpades exakt samma strategi för 52miR-155-5p-målgenerna, underuttryckta under MVI (Figur 3B). Till skillnad från miR-150-5p i T-lymfocyter observerade vi att nästan två tredjedelar av de miR-155-5p riktade generna minskade konsekvent i APC sc-RNAseq-klustret (31/52, 59,6 procent, figur 8A). Gennätverksanalys visade att AIFMI och CIAO1 var centrala gener (Figur 8B). Dessutom avslöjade genontologi stark anrikning i vägar relaterade till mRNA-splitsning (Figur 8C).

DISKUSSIONGenom sin unika design är BIOMARGIN-studien det typiska ramverket för multiomisk dataintegration. I själva verket användes mycket robusta pipelines i både upptäckts-, urvals- och valideringskohorter som omfattade ett stort antal patienter från olika transplantationscentra. I de tre oberoende kohorterna observerade och bekräftade vi samtidigt den märkliga uttrycksprofilen för 6 miRNA under MVI: miR-139-5p minskade medan miR-142-3p/150-5p/{{5} }p/222-3p och miR-223-3p ökades. Viktigt är att nivån av var och en av dessa 6 miRNA korrelerades med MVI-graden, vilket tyder på en dosberoende regleringsmekanism. Vi använde sedan i kiselplattformar för att undersöka varje miRNA-cellulärt ursprung. Påfallande nog observerades två distinkta grupper av miRNA: en första härrörande från infiltrerande immunceller och en andra mer specifik för boendenjur-celler. Sedan mättes både miRNA och mRNA i samma upptäcktsuppsättning biopsiprover, vilket möjliggör en integrerad analys av in vivo-validerade differentiellt uttryckta mRNA/miRNA associerade med MVI. Slutligen, efter att ha beskrivit mRNAs / miRNAs association vid bulkvävnadsupplösningen, bekräftade vi mRNAs / miRNAs samspel vid encellsupplösningen för fyra av de 6 identifierade miRNA:erna.

Intressant nog var miR-139-5p det enda miRNA som var negativt korrelerat med MVI-lesioner. Det härstammar huvudsakligen från EC och har rapporterats reglera MHC-relaterade gener. Bland dess målgener var UBE2D1 starkt uppreglerad under endotelaktivering associerad med MVI. UBE2D-familjen är en E2 ubiquitin-konjugerande enzymfamilj i ubiquitin-proteasom-systemet (29, 30) och UBeD1 visade sig förbättra March-I-ubiquitination, vilket leder till uppreglering av MHC klass II-proteiner (31). Dessutom var GBP5 den mest representerade geninaktiverade EC under MVI, vilket är i linje med våra senaste rapporter som visar att GBP5 är starkt uppreglerat i ABMR-biopsier(17) men även i blodprov(32). Intressant nog visades GBP5-uttryck vara inducerbart av typ II-interferon i humana uterina mikrovaskulära endotelceller, tillsammans med CXCL9 och CXCL10(33). Den tidiga rollen av dessa två proinflammatoriska kemokiner i akuta avstötningsprocesser är väl dokumenterad och deras nivå i urin föreslås för att övervaka risken för akut avstötning vid rutinövervakning av njurtransplanterade mottagare (34). Ett annat miR-139-5p-mål är YWHAG.YWHAG kodar för proteinfamiljen av HLA-F och har beskrivits som differentiellt uttryckt under den aktiva profibrotiska processen vid diabetisk nefropati (35). Den möjliga rollen för miR-139-5p i fibros, en sista vanlig väg efter inflammation, är desto mer relevant att IFTA nyligen har inkluderats i en sammansatt poäng för att förutsäga överlevnad av njurallotransplantat efter ABMR(36). Sammantaget tyder dessa resultat på att miR-139-5p inte längre undertrycker MCH-antigenuttryck vid Anethum-ytan under MVI och skulle delta i kemoattraktions- och fibrosprocesser, men dessa mekanismer återstår att experimentellt bekräfta uttryck vid endotelytan under MVI och kan delta i kemoattraktions- och fifibrosprocesser, men dessa mekanismer återstår att experimentellt bekräftas.

Den andranjur--härlett miRNA som vi identifierade är miR-222- 3p, vars uttryck visade sig vara mer specifikt för MVI-lesioner: det är associerat med g- och PTC-poäng såväl som med C4d-avsättning, men inte med i- eller t-lesioner. Det härstammar dock främst från epitelceller. Efter multiomisk integration vid cellupplösning fastställde vi att miR-222-3p huvudsakligen undertrycker ErbB-signalering som är avgörande för grundläggande cellulära funktioner, såsom proliferation, migration, tillväxt och differentiering (37). Inom humanbiologi behövs fysiologisk ErbB-signalering förnjur-elektrolythomeostas och underhåll av njurintegritet (38). Våra resultat identifierade också ADAM22, NRG1, ZNF91 som ErbB-signalrelaterade gener, särskilt undertryckta i epitelet under MVI. Andra gener väsentliga för njurfysiologi såsom ATP1B1 och KIF3B undertrycktes också i njurepitel av miR-222-3p under MVI. Tidigare har Baker et al. visade att ATP1B1 (b1 subenhet av Na plus /K plus -ATPas) drivernjur-tubulär reabsorption av natrium (39). Dessutom har Aguado-Fraile et al. har identifierat Kinesin Family Member 3B (KIF3B) som involverad i cellhandel i proximala tubuliceller från råtta. KIF3B framstår som en nyckelförmedlare av proximala epitelial tubuli cellrespons på ischemi/reperfusion med potentiell tillämpning injur-hantering av ischemiska skador (40). Vi kan alltså spekulera i att miR-222-3p undertrycker väsentliga fysiologiska vägar under MVI i epitelet. Dessutom regleras immunrelaterade vägar också av miR-222-3p-överuttryck: viktiga gener som TRAP1 och PEBP1 inhiberades totalt i prover med stark MVI. Intressant nog visades TRAP1 förbättrasnjur-tubulointerstitiell fifibros hos möss med unilateral ureterobstruktion genom att skyddanjur-tubulära epitelcellsmitokondrier (41). Dessutom ger PEBP1 antiinflammatoriska effekter genom hämning av både MAPK- och NF-kB-vägar under homeostatiska/basala tillstånd (42). Injur-epitel, en studie av Marko et al. visade elegant att post-ischemisk NF-kB-aktivering förvärrar tubulär skada och förvärrar inflammation (43). I våra händer förträngdes PEBP1 helt av miR-222-3p, vilket tyder på att NF kB-vägen släpps lös under MVI. Sammantaget visar dessa resultat att epitelbiologin störs under MVI ochnjur-epitelceller svarar aktivt på MVI-skador medan involveringen av denna vävnad i MVI sällan behandlas. Dessa molekylära fynd kan kasta nytt ljus över akuta tubulära skador, ett väletablerat, men länge försummat ABMR-kriterium. Dessutom har det visats att epitelceller kan utsöndra exosomal miR-222-3p och inducera M2-fenotyp i makrofager (44). Under tiden har Li et al. rapporterade nyligen att M2-makrofager överuttrycker miR-155 och levererar detta miRNA i mikromiljön, även genom utsöndrande exosomer. Vid njurtransplantation ökade miR-155 vid olika tillstånd (IFTA, akut avstötning och TCMR) och i kroppsvätska eller vävnader (45). Intressant nog kan miR- 155 främja epitelial-mesenkymal övergång genom att rikta in sig på RASSF4 i epitelceller (46). Denna miRNA-baserade överhörning mellan makrofager ochnjur-epitelceller återstår att bedöma injurtransplantationoch i synnerhet i samband med MVI. I linje med dessa fynd observerade vi att miR-155-5p huvudsakligen uttrycktes av APC:er som omfattar monocyter och makrofager. I denna speciella delmängd avslöjade miR- 155-5p-target-genes ontologi anrikning i premRNA-splitsningsvägar. Intressant nog, Janssen et al. rapporterade att lunginflammation inducerade pre-mRNA-splitsningsvägar i alveolära makrofager. Dessutom skilde sig pre-mRNA-splitsningsaktivering i vävnadsbosatta makrofager jämfört med (blodrekryterade) monocythärledda makrofager. Förändringar i kärnmetabolism i rekryterade makrofager rapporterades, med ökat utflöde genom glykolys och minskat utflöde genom trikarboxylsyracykeln (TCA-cykeln, dvs Krebs-cykeln) (47). När det gäller miR-150-5p fann vi att dess överuttryck under MVI var associerat med NF-kB-vägen i lymfocytklustret som omfattar både medfödda NKT-celler och adaptiva T-celler. Intressant nog är miR-150-5p avgörande för att generera mogna och funktionella NK-celler (48) och miR-150-5p-bristiga CD8 plus T-celler rapporterades vara mindre cytotoxiska (49). Dessutom kan CD8 T-celler också utsöndra miR-150-5p i exosomer (50) som i sin tur kan främja fibroblastaktivering i tubulära epitelceller och efterföljandenjur-fifibros som föreslagits av nyare rapporter (51, 52).

CISTANCHE KOMMER FÖRBÄTTRA NJUR/NJURFUNKTIONEN

Vår studie har vissa begränsningar. Vi fokuserade vår forskning på 6 miRNA, konsekvent identifierade i vår flerstegsdesign. Men vi fortsatte med ett steg-för-steg-miRNA-selektion, med endast en bråkdel av alla kända miRNA kvantifierade i valideringskohorten. Den statistiska vägen för val av miRNA förlitade sig på BIOMARGINs initiala design, lämpad för att identifiera diagnostiska biomarkörer för flera endpoints (ABMR, men också TCMR och IFTA). Därför, även om den ökade signifikant i upptäckts- och urvalskohorter (Figur 2A), kvantifierades inte miR-146a i valideringskohorten. Därmed uteslöts miR-146a de facto från vår urvalsprocess, även om litteraturen tyder på en roll i ischemi/reperfusion vid njurtransplantation (53) och i Treg-medierad kontroll av alloimmuna svar (54). Dessutom kan vi inte utesluta att en mer kraftfull provstorlek skulle ha gett fler miRNA, såsom miR-138 (ner) och miR-511 (upp) som uttrycktes differentiellt i ABMR-fall av urvalskohorten och visade en trend i samma riktning i upptäcktskohorten. Dessutom utförde vi inte sc-RNAseq-analys på våra egna biopsiprover utan använde en online tillgänglig sc-RNAseq-datauppsättning. Vid tidpunkten för studiedesign och insamling av biopsiprover var scRNAseq-teknologin verkligen inte tillgänglig ännu, och behovet av nyinsamlade prover tillät inte retrospektiv användning av frysta eller paraffininbäddade prover. På liknande sätt gjordes mRNA-profilering med hjälp av mikroarrayer, den dåvarande benchmarkteknologin som nu har överträffats av nästa generations RNA-seq. Användningen av en online tillgänglig sc-RNAseq-datauppsättning begränsar vår förmåga att rapportera de grundläggande demografiska egenskaperna hos patienterna. Denna saknade information kan skapa oro angående representativiteten hos befolkningsgrupper. Dessutom kontrollerade vi inte någon teknisk aspekt av sekvenseringen. Därför upptäckte inte vår sc-RNAseq-analys vid den valda upplösningen någon neutrofil eller NK-cellkluster i dessa prover. Därför var våra nedströmsanalyser av miR-142-3p och miR-223-3p begränsade till att bygga deras respektive målgennätverk och ontologi (kompletterande figur S2) och tillät inte någon encellsupplösningsutforskning. Gennätverket och ontologin för de 27 målgenerna av miR -223-3p avslöjade emellertid anrikning av TCA-cykeln (kompletterande figur S2) tillsammans med ERBB-signalering. Vi kan alltså spekulera i att både miR-155-5p i monocyter och miR-223-3p i neutrofiler spelar en roll i den metabolism och inflammatoriska respons som dessa celler engagerar under MVI. Dessutom har miR-142-3p redan visat sig öka vid avstötning av njurtransplantat (9, 55, 56), men hade hittills inte specifikt associerats med ABMR. En annan begränsning av vår studie är att specifika genuttrycksförändringar i de sällsynta infiltrerande cellerna kan maskeras i bulkgenexpressionsanalys. Ytterligare studier inklusive fler prover krävs därför för att möjliggöra korrekt undersökning av alla, även sällsynta cellsubtyper, men är för närvarande begränsade av teknikens relativt höga kostnad.

Sammanfattningsvis undersökte vi här de molekylära vägarna associerade med MVI, den huvudsakliga histologiska skadan relaterad till ABMR. Den integrerade omics-metoden som användes gjorde det möjligt för oss att reda ut nya vägar involverade i MVI och antyder att tubulära epitelial metabolismändringar inträffar som en konsekvens av ABMR, bortom det närliggande endotelfacket. Vår studie illustrerar den stora potentialen hos multiomics för att reda ut sjukdomsmekanismer och banar väg för nya undersökningar för att ytterligare belysa korssamtalet mellannjur-bosatta och allotransplantat-infiltrerande cellundergrupper.