Jabuticaba (Myrciaria Jaboticaba) Peel som en hållbar källa till antocyaniner och ellagitanniner som levereras av fosfolipidvesiklar för att lindra oxidativ stress i mänskliga keratinocyter Del 2
Mar 20, 2022
Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information
2.3. In vitro-studier med keratinocyter
2.3.1.Biokompatibilitet hos vesiklar
Studien som utfördes för att utvärdera de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos transfersomer, särskilt de som berikats med polymererna, bekräftade deras större stabilitet och idealiska storlek för att appliceras på huden. Alla viktiga skillnader detekterades som en funktion av polymerkoncentrationerna (1 eller 2 mg/ml). För att bedöma detta användes vesiklarna modifierade med den högsta polymerkoncentrationen (2 mg/ml) för att utföra de efterföljande studierna. Deras biokompatibilitet utvärderades med användning av keratinocyter och den för extraktet i vattenhaltig dispersion utvärderades också och användes som en jämförelse. Keratinocyter har valts ut eftersom de är de mest representativa cellerna i överhuden och en lager-för-lager-uppsättning användes eftersom de i sin speciella differentiering utgör huvudbarriären i huden, som reglerar hudens återfuktning och förhindrar exogena ämnen från att tränga in i och genom det. Keratinocyter behandlades i 48 timmar med extraktet i dispersion eller inkorporerades i vesiklarna vid fyra olika spädningar, varefter cellviabiliteten mättes (Figur 3). Viabiliteten för celler inkuberade med extraktet i dispersion var ~88 procent (s<0.05 versus="" the="" viability="" measured="" using="" extract="" loaded="" vesicles),="" indicating="" that="" the="" extract="" is="" not="" toxic.="" the="" viability="" of="" cells="" treated="" with="" extract-loaded="" transfersomes="" and="" hyaluronan-transfersomes="" at="" higher="" dilutions="" was~100%="" (p="">0.05 bland denna grupp). Behandlingen med HEcellulosa-transfersomer och hyaluronan-transfersomer förbättrade cellviabiliteten ytterligare. Alla formuleringar var mycket biokompatibla oavsett vilken polymer och utspädning som användes. Faktum är att cellviabiliteten var lika med eller högre än 100 procent, vilket till och med visade upp en proliferativ effekt associerad med vesikelladdning.
2.3.2. Skyddande effekt av extraktet, i dispersion eller laddat i vesiklar, mot skador inducerade i keratinocyter av väteperoxid
Keratinocyterna stressades med väteperoxid och behandlades sedan med extraktet antingen i dispersion eller laddades i transfersomer. Cellviabiliteten mättes efter 4 timmar och detta användes för att utvärdera den skyddande effekten av formuleringarna mot oxidativ stress (Figur 4). Proverna späddes med cellmediet för att nå två olika koncentrationer (4 och 0,4 ug/ml). Väteperoxidstressen orsakade hög celldödlighet och minskade livsduglighet med upp till ~50 procent (s<0.05 versus="" the="" viability="" of="" cells="" treated="" with="" the="" extract="" in="" dispersion="" or="" loaded="" in="" vesicles)[35].="" hydrogen="" peroxide="" is="" considered="" one="" of="" the="" most="" dangerous="" oxidative="" molecules="" among="" the="" different="" reactive="" oxygen="" species,="" capable="" of="" promoting="" apoptosis="" and="" cell="" death.="" the="" treatment="" of="" stressed="" cells="" with="" the="" aqueous="" dispersion="" of="" the="" extract="" was="" capable="" of="" reducing="" the="" damaging="" effect="" of="" hydrogen="" peroxide="" as="" the="" viability="" increased="" up=""><0.05 versus="" the="" viability="" of="" cells="" treated="" with="" the="" extract="" loaded="" in="" hecelluose-transfersomes="" at="" a="" higher="" dilution="" and="" hyaluronan-transfersomes),="" although="" the="" complete="" restoration="" of="" normal="" conditions="" was="" not="" achieved="" (figure="" 4).="" treatment="" with="" the="" extract-loaded="" transfersomes="" protected="" the="" cell="" to="" the="" same="" extent="" as="" the="" extract="" in="" dispersion="" (~82%,p="">0.05 kontra livsdugligheten hos celler behandlade med dispersion). Behandlingen med bäst resultat var extraktet laddat med HEcellulosatransfersomer (vid en högre utspädning) och hyaluronantransfersomer, vilket uppnådde en livsduglighet på ~104 procent (p<0.05 versus="" the="" values="" of="" other="" treatments).="" the="" restored="" normal="" conditions="" and="" even="" slightly="" promoted="" cell="" proliferation,="" probably="" due="" to="" the="" synergic="" effect="" of="" the="" extract="" and="" the="" polymer-immobilized="" vesicles.="" the="" vesicle="" behavior="" was="" not="" affected="" by="" the="" dilution="" levels="" of="" the="">
2.3.3. In vitro sårläkningseffekter
In vitro-scratchanalysen utfördes med ett monolager av keratinocyter för att verifiera förmågan hos extraktet i vattenhaltig dispersion eller införlivades i vesiklar för att stimulera cellförökningen och migrationen. Tomma vesiklar testades inte eftersom i en tidigare studie ingen förbättring av sårläkning upptäcktes när tomma hyalurosomer användes [37]. Tillslutningen av det utförda såret övervakades under 48 timmar (Figur 5) och procentandelen förslutning beräknades genom att mäta lesionsområdena (Figur 6). Sårförslutningen av obehandlade celler skedde mycket långsamt – 13 procent vid 24 timmar, 28 procent vid 36 timmar och endast 40 procent vid 48 timmar. Behandling med extraktet i vattendispersion förbättrade processen något och förde tillslutningen vid 48 timmar till 50 procent. Behandling med de extraktladdade vesiklerna vid 48 timmar uppnådde 90 procent stängning vid användning av transfersomer och HEcellulosa-transfersomer och cirka 100 procent stängning vid användning av hyaluronan-transfersomer. Som vi kan se var sårförslutningen nästan fullständig, vilket bekräftar de återställande egenskaperna hos de extraktladdade hyaluronantransfersomerna.
Våra övergripande resultat bekräftade den höga biokompatibiliteten hos hyaluronan-transfersomer, som också var de mest effektiva för att stimulera proliferation och migration av hudceller och motverka skador som induceras i huden av oxidativ stress.
3. Material och metoder 3.1. Material
Lipoid S75 (bestående av ~70 procent sojafosfatidylkolin, 9 procent fosfatidyletanolamin och 3 procent lysofosfatidylkolin) köptes från Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Tyskland). Natriumhyaluronat med låg molekylvikt (200-400 kDa) och en polydispersitet på 1,4 Mw/Mn, köptes från DSM Nutritional Products AG Branch Pentapharm (Schweiz). Tween 80, glycerol, DPPH-radikal (2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl), järn(III)kloridhexahydrat, gallsyra, klorogensyra och askorbinsyra, katekin, tetrazoliumsalt, 3-(4,{ {15}}dimetyltiazol-2-vl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid(MTT), quercetin, Neosporin, Folin-Ciocalteus fenolreagens,2,4,6-tris( 2-pyridyl)-S-triazin(TPTZ) och pvrokatekolviolett köptes från Sigma-Aldrich (Milano, Italien). Kaliumhexacyanoferrat (ⅢI) erhölls från Merck (Darmstadt, Tyskland). Vattenfritt natriumacetat, kopparsulfatpentahydrat och kopparkloriddihydrat erhölls från VWR Chemi-cals BDH⑧ (Frankfurt, Tyskland). Cyanidin 3-O-glukosid (större än eller lika med 95 procent) och delfinidin 3-O-glukosid (mer än eller lika med 95 procent) köptes från Extrasynthese (Lyon, Frankrike). Isättika och fosforsyra (85 procent) förvärvades från JTBaker (Mallinckrodt Baker Inc., Utrecht, Nederländerna). Alla reagenser och plaster för cellodling köptes från Life Technologies Europe (Monza, Italien).
3.2. Jabuticaba Pees: Extraktion, kemisk karakterisering och antioxidantaktivitet
Jabuticaba-frukter (Myrciaria jabuticaba (Vell.)O.Berg)cv. Sabara skördades i ett moget mognadsstadium i Araucaria stad, Paranå, Brasilien (geografiska koordinater∶25 grader 2924,7" S49 grader 2637,8"W) i december 2018. Frukterna tvättades och desinficerades (NaOCl vid 100 mg/L/15 min), sköljs och pulpas manuellt. Skalen torkades vid 35 grader i 50 timmar, maldes till 42 Tyler mesh och extraherades i en accelererad lösningsmedelsextraktor (ASE-350, Dionex, Sunnyvale, CA, USA), med ett tryck på 100 bar (98,7) atm) i två extraktionscykler vid 50 grader . Vatten surgjort med citronsyra (pH 2,10) användes som lösningsmedel och extraktioner upprepades fyra gånger. Därefter filtrerades extrakten med användning av kvalitativt papper och frystorkades under vakuum i 120 timmar. Därefter beräknades extraktionsutbytet, uttryckt i procent, avseende den råvara som användes i förfarandet.
Cistanche kan förbättra immuniteten
Den totala fenolhalten (TPC, mg gallussyraekvivalent per 100 g, mg GAE/100 g)totalt kondenserat tannin (TCT, mg katekinekvivalent per 100 g, mg CE/100 g), totala flavonoider (TF, mg CE) /100 g) och totalt orto-difenolinnehåll (TOD, mg klorogensyraekvivalent per 100 g, mg CAE/100 g) mättes i tre exemplar med användning av UV-Vis-spektrofotometri enligt de procedurer som fullständigt beskrivs av do Carmo et al. [20].
Antocyaniner (cyanidin {{0}}O-glukosid och delfinidin 3-O-glukosid) kvantifierades med högpresterande vätskekromatografi (HPLC) med en Agilent 110{{37} }(Agilent Technologies Inc., Esbo, Finland) enhet utrustad med diode array detection (DAD). Separation utfördes med en Gemini C18-kolonn (150 mm×4,6 mm, 5 μm) med en gradienteluering av acetonitril surgjort med myrsyra vid 5 procent. Totalt innehåll av ellagitannin bestämdes efter syrahydrolys, enligt Mattila och Kumpulainen [38], och gallsyra bestämdes med hjälp av en Inertsil ODS-3 kolumn (150 mm ×4.0 mm , 3 μm) med en gradienteluering av acetonitril till 50 mmol/L H3PO4 (pH 2,5). Analyser utfördes i tre exemplar och resultaten uttrycktes som mg/100 g. Ultrahögpresterande vätskekromatografi (UHPLC) kombinerat med högupplöst masspektrometri (MS) användes för karakterisering av stora ellagitanniner och antocyaniner. En Acquity UPLC-Xevo G2 QTOF-masspektrometer (Waters, Milford, MA, USA) var utrustad med en Waters Acquity BEH C18 （1,7 μm, 2,1 mm × 150 mm）-kolonn och separationen utfördes med en gradient av acetonitril till vatten surgjort med 0,1 procent myrsyra, enligt Santos et al. [39]. Flödeshastigheten var 0,55 ml/min, temperaturen i kolonnugnen var 45 grader och injektionsvolymen var 1,0 μL. En elektrospraygränsyta (ESI) i negativ och positivt läge användes med kapillärspänningar på -1 kV respektive plus 0,5 kV. Argon användes som kollisionsgas. MS-analyser utfördes av dataoberoende förvärv (MSE) centroiddatamodell i en full scan m /z 50-1500 med 0,2 s skanningstid. I MSE-funktionen fragmenterades prekursorjonerna till MS med hjälp av hög kollisionsenergi rampad upp från 25 till 45 V.
Extraktets antioxidantaktivitet analyserades i tre exemplar genom att använda olika analyser: friradikalfångande aktivitet i förhållande till DPPH-radikalen, ferri-reducerande antioxidantkraft (FRAP), koppar-jon-reducerande antioxidantkapacitet (CUPRAC), reducerande kraft och Cu2 plus kelaterande förmåga. Resultaten uttrycktes som mg GAE/100 g (reducerande effekt), mg askorbinsyraekvivalent per 100 g, mg AAE/100 g (DPPH, FRAP och CUPRAC) respektive mg EDTA-ekvivalenter/100 g (metallkelering). . Alla använda metoder har beskrivits djupt tidigare av do Carmo et al. och Fidelis et al. [9,20].
3.3. Vesikelförberedelse
Transfersomer, hydroxietylcellulosaberikade transfersomer (HEcellulosa-thansferomer) och natriumhyaluronatberikade transfersomer (hyaluronan-transfersomer) framställdes genom att dispergera fosfolipid (S75, 180 mg/ml), Tween 80 (20 mg/ml), extrakt (40 mg/ml) och polymer (hydroxietylcellulosa eller natriumhyaluronat 1 och 2 mg/ml), när så är lämpligt, i vatten och låt blandningarna hydratiseras i några timmar. Efter detta sonikerades dispersionerna (4 cykler 2 på 5 av 15,0 μ amplitud) och väntade 5 minuter mellan varje cykel för att främja kylning och undvika överhettning av provet. En högpresterande Soniprep 150 sonikator (MSE Crowley, London, Storbritannien) användes för att sonikera alla dispersioner för att erhålla ett homogent system med liten storlek [15]. Denna procedur undviker förlusten av komponenterna som används för beredningen, vilket leder till bildandet av presterande vesiklar som kan inkorporera stora mängder av extraktet.
3.4. Karakterisering av vesiklarna
Medeldiametern och polydispersitetsindexet (ett dimensionslöst mått på storleksfördelningens bredd) för vesiklarna mättes genom fotonkorrelationsspektroskopi med användning av en Zetasizer Ultra (Malvern Instrument, UK). Samma utrustning användes för att mäta zeta-potentialen hos vesiklar genom att mäta partiklars elektroforetiska rörlighet [40]. Proverna späddes på lämpligt sätt före mätning för att vara optiskt klara och undvika minskningen av spritt ljus som kan detekteras. För att utvärdera mängden extrakt som faktiskt införlivats i vesiklarna, renades dispersionerna från det icke-inkorporerade extraktet genom dialys. Vesikeldispersioner (1 mL) sattes in i dialysrör av polykarbonat (Spectra/Pormembranes: 12-14 kDa MW cut-off, med porer 3 nm; Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez, CA, USA) och nedsänktes i destillerat vatten (2 L) vid 25 grader i 2 timmar under omrörning. Vattnet förnyades efter en timme, varvid man sålunda använde 4 L vatten för att solubilisera de bioaktiva molekylerna som inte var inkorporerade i 1 ml vesikeldispersion (40 mg). Mängden extrakt i vesikelsuspensionerna före och efter dialysen kvantifierades genom att mäta deras antioxidantaktivitet med användning av DPPH-analysen. Infångningseffektiviteten för extraktet inuti vesiklarna beräknades som ett procentuellt förhållande mellan antioxidantaktiviteten hos proverna före och efter reningsprocessen [41-43].
3.5. Stabilitet hos vesiklar vid lagring
Stabiliteten hos vesiklarna i dispersionen utvärderades genom att övervaka deras medelstorlek, polydispersitetsindex och ytladdningen under 90 dagar medan dispersionerna hölls vid rumstemperatur (25±1 grad).
3.6. Mätning av antioxidantaktiviteten hos prover med användning av det kolorimetriska DPPH-testet Antioxidantaktiviteten hos jabuticaba-skalextrakt laddat i vesiklar mättes som en funktion av dess förmåga att avlägsna DPPH. Dispersionerna (10 μL) späddes (1∶100) med en metanolisk lösning av DPPH (0,4 ug/ml). De utspädda proverna förvarades vid rumstemperatur och i mörker under 30 minuter, sedan mättes absorbansen av lösningarna vid 517 nm med användning av en UV-spektrofotometer. Antioxidantaktiviteten för formuleringarna beräknades enligt ekvation (1): (1)Antioxidantaktivitetsprocent =[(ABSDPPH-ABSample)/ABSpPPH]×100
3.7.Biokompatibilitet och skyddande effekt av prover mot oxidativ stress i keratinocyter
Immortaliserade mänskliga keratinocyter (HaCaT) odlades som monolager vid 37 grader, med 100 procent luftfuktighet och 5 procent CO2 med Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) högt glukos kompletterat med fetalt bovint serum, penicillin och streptomycin som ett tillväxtmedium. För att utvärdera biokompatibiliteten hos formuleringar såddes celler i 96-brunnsplattor med en densitet av 7,5 × 10 graders celler/brunn. Efter 24 timmar behandlades cellerna i 48 timmar med jabuticaba-extrakt i vattendispersion eller laddades i vesiklar ordentligt utspädda med DMEM för att nå olika koncentrationer av extraktet (40, 4, 0,4 och 0,04 ug/ml). I slutet av inkubationen, MTT [3(4,5-dimetyltiazolyl-2)-2, 5-difenyltetrazoliumbromid] (100 μL, 0,5 mg/ml slutkoncentration ） sattes till varje brunn, och efter tre timmar löstes de bildade formazankristallerna med dimetylsulfoxid. Absorbansen för varje brunn mättes vid 570 nm med användning av en mikroplattläsare (Synergy 4 Reader, BioTek Instruments, AHSI SpA, Bernareggio, Italien). Alla experiment upprepades minst tre gånger, varje gång i tre exemplar. Resultaten visas som procent av cellviabilitet i jämförelse med obehandlade kontrollceller (100 procent viabilitet).
Den in vitro skyddande effekten av formuleringar mot skador orsakade av oxidativ stress utvärderades också. Celler såddes i {{0}}brunnsplattor med en densitet av 7,5 × 10 celler/brunn. Efter 24 timmars inkubation stressades cellerna med väteperoxid (30 procent utspädd 1:40,000 v/o med PBS) och behandlades med extraktet i vattenhaltig dispersion eller laddades i vesiklar och späddes för att nå två olika koncentrationer (4 och 0,4 ug/ml). Celler stressade med endast väteperoxid användes som en negativ kontroll, medan obehandlade celler användes som en positiv kontroll. Efter 4 timmars inkubation tvättades cellerna med ett färskt medium och deras livsduglighet bestämdes med MTT-analysen. Resultaten rapporteras som procentandelen obehandlade celler (100 procent viabilitet).
3.8. In vitro sårläkningsegenskaper
Förmågan hos jabuticaba-peelingsextraktet som laddats in i vesikler att omforma hudskadorna och främja deras läkning utvärderades genom att mäta cellexpansionen på en lesion i ett cellmonolager. Cellerna odlades i plattor med 6 brunnar tills ett fullständigt och homogent monoskikt uppnåddes. Ett linjärt sår genererades med användning av en steril plastpipettspets. De spridda fragmenten av celler avlägsnades genom försiktig tvättning med ett nytt medium. Extraktvattendispersion eller extraktladdade vesiklar späddes med cellmedium upp till 4 ug/ml extrakt och användes för att behandla de skadade cellmonoskikten. Cellskadorna observerades och bilderna togs vid 24, 36 och 48 timmars inkubation med hjälp av ett optiskt mikroskop med ett 10x objektiv. Obehandlade celler användes som en negativ kontroll. Områdesskadorna i de tagna bilderna mättes med Javas bild J-programvara (http://rsb.info.nih.gov, tillgänglig i april-juni 2021). Förslutningen av såren beräknades med hjälp av ekvation (2):
där ao är det sårade området omedelbart efter repning, och a är det sårade området mätt vid 24, 36 och 48 timmar [44].
3.9. Statistisk analys
Resultaten uttrycks som medelvärdet ± standardavvikelsen och signifikansen testades vid sannolikhetsnivån 0.05 (p). För storlek, zetapotential, viskositet, läkemedelsackumulering och cytotoxicitet användes envägsvariansanalys (ANOVA) för att underbygga statistiska skillnader mellan grupper följt av Tukeys test, medan Students t-test användes för jämförelse mellan två prover med XLStatistic för Excel.
4. Sammanfattningar
Det lyofiliserade jabuticaba-skalextraktet inkorporerades i transfersomer och polymerberikade transfersomer (hydroxietylcellulosa och natriumhyaluronat) i syfte att stabilisera extraktet och förbättra dess terapeutiska effektivitet. De erhållna vesiklarna var små i storlek och homogent dispergerade. Tillsatsen av båda polymererna ledde endast till bildandet av något större vesiklar utan skillnader mellan de använda polymerkoncentrationerna. Polymerberikade vesiklar verkade vara idealiska för topisk administrering och kunde inkorporera det bioaktiva rika extraktet i stora mängder. Speciellt har kombinationen av en fosfolipid, Tween 80, och natriumhyaluronat för att erhålla Hyaluronan-transfersomer, valts ut som den bästa formuleringen när det gäller stabilitet och förmåga att interagera med keratinocyter, eftersom endast dessa vesikler kunde effektivt motverka skadan induceras i celler vid användning av väteperoxid och för att främja sårläkning i mänskliga keratinocyter. Sammantaget antydde våra resultat att hyaluronan-transfersomer kan representera ett lovande system för behandling av hudsjukdomar eller hudsår kopplade till oxidativ stress. Dessutom visar vi för första gången användningen av jabuticaba peelingsextrakt i ett dermatologiskt tillförselsystem.
Författarbidrag:DG, MLM, MM: konceptualisering, formell analys, datakurering, skrivning och granskning; IC, MA, JH: formell analys och skrivande. Alla författare har läst och samtyckt till den publicerade versionen av manuskriptet.
Finansiering:Denna forskning fick ingen extern finansiering. Utlåtande av institutionell granskningsnämnd: Ej tillämpligt. Informerat samtycke: Ej tillämpligt.
Datatillgänglighetsförklaring:Rådata finns tillgängliga och kan begäras direkt till författare.
Intressekonflikt:Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Exempeltillgänglighet:Prover av jaboticaba-skalextraktet finns tillgängliga från författarna.
Den här artikeln är extraherad från Molecules 2021, 26, 6697. https://doi.org/10.3390/molecules26216697 https://www.mdpi.com/journal/molecules
