Del 3-studier har visat att autofagi spelar en viktig roll i regleringen av cellulär LD-deposition
Apr 25, 2022
Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information
ABSTRAKT
Nya bevis tyder på att oväntad avsättning av lipiddroppar (LD) och peroxidation kan påskynda organellstress och spelar en avgörande roll i patogenesen av neurodegenerativa sjukdomar (NDD). I vår tidigare studie bekräftade vi att kaempferol (Ka), en naturlig liten flavonoidmolekyl, uppvisade neuroprotektiva effekter på möss med LPS-inducerad Parkinsons sjukdom (PD). Dessutom har tidigare studier visat att autofagi spelar en viktig roll i regleringen av cellulär LD-deposition. I den aktuella studien visade vi att Ka skyddade mot TH plus neuronal förlust och beteendestörningar hos MPTP/p-inducerade PD-möss, åtföljd av minskad lipidoxidativ stress i substantia nigra pars compacta (SNpc). I odlade neuronala celler uppvisade Ka ett relativt säkert koncentrationsområde och undertryckte signifikant LD-ackumulering och cellulär apoptos inducerad av MPP plus. Ytterligare studier indikerade att den skyddande effekten av Ka var beroende av autofagi, speciellt lipofagi. Kritiskt sett främjade Ka autofagi för att förmedla LD-nedbrytning i lysosomer, vilket sedan lindrade lipidavsättning och peroxidation och den resulterande mitokondriella skadan, vilket minskade neuronal död. Dessutom avskaffade AAV-shAtg5-förmedlad Atg5 knockdown de neuroprotektiva effekterna av Ka mot lipidoxidation i PD-möss.Cistanche för att förbättra minnetDetta arbete visar att Ka förhindrar dopaminerg neuronal degeneration i PD via hämning av lipidperoxidationsmedierad mitokondriell skada genom att främja läppautofagi och ger en potentiell ny terapeutisk strategi för PD och relaterade NDD.
Introduktion
Parkinsons sjukdom (PD) är en vanlig neurodegenerativ sjukdom (NDD) som patologiskt kännetecknas av den progressiva förlusten av dopaminerga (DA) neuroner i substantia nigra pars compacta (SNpc)[1]. Även om den exakta etiologin och det naturliga förloppet för denna sjukdom ännu inte helt klarlagts, har många processer och dysfunktioner på systemnivå, inklusive mitokondriella funktioner, dopaminhomeostas, neuroinflammation och autofagi, varit inblandade i patogenesen av PD [1, 2]. Färska rapporter avslöjade att lipiddroppsrelaterad lipotoxicitet kan delta i PD-patologi [3,4]. LD är mycket dynamiska organeller som kommer ut från det endoplasmatiska retikulummembranet (ER) och normalt fungerar som intracellulära platser för neutral lipidlagring [5 ].LD har nyligen visat sig spela en mycket bredare roll än lagring av fettsyror (FA) och deltar i många sjukdomar. (cistanche para que serve) Till exempel bildar myeloidceller, inklusive makrofager, leukocyter och eosinofiler, LD som svar på inflammation och stress,cistanche på kinesiskaoch LD är platser för inflammatorisk cytokinproduktion och lagring och är vidare involverade i antigenpresentation och patogenclearance [6]. Viktigt är att vid åderförkalkning har LD-rika skumceller visat sig vara skadliga i alla stadier av sjukdomen [7].
Cistanche kan förbättra immuniteten
Men LD har inte studerats i det centrala nervsystemet (CNS), med få artiklar som rapporterar den histologiska närvaron av LD i mänsklig hjärnvävnad [8,9]. Trots det kan LDs ha viktiga funktioner i hjärnan, eftersom nya studier bekräftade att aggregerade LDs i glia accelererade neurodegeneration i en Drosophila-modell [10]. Det har nyligen rapporterats att i möss, oljeröda O-positiva lipid-laddade celler, inklusive neuroner, gliafibrillärt surt protein (GFAP)t-astrocyter och joniserad kalciumbindande adaptermolekyl-1 (IBA{{7} })t mikroglia, finns i många hjärnregioner och har visat sig delta i åldersrelaterade processer [11]. Vårt tidigare arbete visade också ökad LD-ackumulering i hjärnan i en PD-musmodell [12]. Sammantaget tyder dessa studier på att LDs kan vara involverade i patogenesen av PD, såväl som andra NDD.
Normalt bryts intracellulära LDs ned i lysosomer och levererar FA till mitokondrier för deras konsumtion som en alternativ energikälla under perioder med utarmning av näringsämnen [13]. Emellertid har nervceller en låg kapacitet för mitokondriell FA-konsumtion för energiproduktion [14]. Denna egenskap gör neuroner särskilt känsliga för LD-ackumulering och peroxidation. Dessutom ökar ackumuleringen av LDs FA-oxidationshastigheten och utövar ett ihållande tryck på den mitokondriella elektrontransportkedjan, vilket ökar produktionen av reaktiva syrearter (ROS) av elektrontransportkedjekomplex I och III [15] för att förstärka oxidativ stress. Lipidöverbelastning leder också till ROS-produktion av extramitokondriella källor såsom nikotinamidadenindinukleotidfosfat (NADPH) oxidaser och andra oxidativa enzymer. I kombination med det minskade uttrycket av antioxidantenzymer och den låga kapaciteten för FA-konsumtion i neuroner, medierar LD-ackumulering oxidativ stress och kan ytterligare leda till mitokondriell skada, lysosomal dysfunktion, defekt autofagi och aktivering av inflammatoriska svar [16,17]. Om inte de ackumulerade LDs kan hämmas eller avlägsnas, genomgår högaktiva neuroner patofysiologi, vilket ger upphov till neurodegeneration [17]. (cistanche penis) Bevis indikerar att den lysosommedierade kataboliska processen som kallas autofagi spelar en avgörande roll för att upprätthålla cellulär LD-homeostas i flera vävnader [17,18]. I detalj,cistanche penis tillväxtLD kan selektivt sekvestreras i autofagosomer och levereras till lysosomer för nedbrytning av lysosomala sura lipaser, en process som specifikt kallas lipofagi [19]. Därför kan inriktning på LD och deras autofagiska borttagningsväg representera en ny metod för att hantera neurodegeneration.
Studiet av naturliga produkter och dietmedel som källor för potentiella NDD-behandlingar och strategier har fått ett enormt intresse de senaste åren [20]. Kaempferol (Ka) är en naturlig polyfenolisk liten molekyl som kan hittas i ett antal kinesiska medicinska örter och kostkällor [21]. Ka har rapporterats utöva antibakteriella, anti-aging och immunmodulerande effekter, såväl som antioxidant och neuroprotektiva aktiviteter [20,22,23]. Tidigare rapporterades Ka hämma inflammation i BV2 mikrogliaceller in vitro [24] och öka motståndet hos DA-neuroner mot neuroinflammation in vivo [25]. Effekten av Kaon LDs vid PD har dock ännu inte undersökts.
Med tanke på vikten av LD och den intima kopplingen mellan LD, mitokondrier och autofagi [16], som alla är involverade i PD, antar vi att Ka hämmar LD-peroxidation och förhindrar DA-neurodegeneration vid PD. I den föreliggande studien visade vi att Ka avsevärt skyddade mot neurodegeneration i en murin PD-modell genom att hämma LD-ackumulering. (cistanchepulver) Ytterligare studie visade att Ka utlöste autofagi och minskade ackumuleringen av oxiderade LDs för att lindra mitokondriell dysfunktion och mitokondriell ROS (mtROS) produktion, och därigenom förhindra neuronal apoptotisk död.cistanche propiedadesResultaten som erhållits i denna studie kan hjälpa till att styra kliniska beslut angående användningen av den naturliga molekylen Ka i NDDs som PD.
2. Material och metoder
2.1. Försöksdjur
C57BL/6J-möss (hanar, 4-månader gamla) erhölls från Nanjing Medical University Animal Core (Nanjing).cistanche tubulosa beneficiosMöss upprätthölls och föddes upp i djurresurscentret vid medicinska fakulteten, Nanjings medicinska universitet och i djuranläggningen vid Nanjing Drum Tower Hospital. Möss har fritt tillgång till mat och vatten i ett rum med en omgivningstemperatur på 22 grader ±2 grader och en ljus/mörkercykel på 12:12 timmar. Alla djurförsök utfördes strikt i enlighet med riktlinjerna från National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals.
2.2.Reagens
MPTP(M0896),3-MA(M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%) for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>99,0 procent,96,353) för in vitro-experiment erhölls från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). BODIPY 493/503 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861) och DHE (D11347) köptes från Thermo Fisher Scientific. För djurförsök löstes Ka i en lösning av 10 procent DMSO i 16 procent SBE- -CD i steril koksaltlösning. För cellexperiment framställdes Ka i DMSO (Sigma-Aldrich) och PBS (slutlig DMSO-koncentration är 0,01 procent), pH 7,4.
2.3. Induktion och behandling av metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP)-inducerad PD-musmodell
För att utvärdera effekterna av Ka i PD-modellen för MPTP/p-toxicitet, delades möss (hanar, 4-5 månader gamla) slumpmässigt in i saltlösningsbehandlade grupper, MPTP-behandlade grupper, MPTP plus Ka-behandlade grupp , och Ka ensam behandlad grupp. I den MPTP-behandlade gruppen fick möss kronisk MPTP-administrering med ett protokoll liknande det som beskrivits tidigare [26]: MPTP löstes i saltlösning och injicerades subkutant med 25 mg/kg följt av 250 mg/kg probenecid (upplöst i dimetylsulfoxid) intraperitoneal (ip) injektion med intervaller om 1 timme var 3,5:e dag under en period av 5 veckor. (cistancherot) Kontrollmöss fick saltlösning och probenecidinjektion. I den MPTP plus Ka-behandlade gruppen fick möss Ka (50 mg/kg, en enda injektion/dag under experiment, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, Kina) intraperitonealt (ip) dagligen 3 dagar före behandling med MPTP och över 5 MPTP injektionsveckor. En vecka efter den sista MPTP-injektionen, utsattes möss för beteendetestning förblindade för grupper. Därefter bedövades alla möss med 40 mg/kg natriumpentobarbital och avlivades för upptäckt av hjärnproteiner och immunhistokemi eller qPCR-analys.
2.4. In vivo stereotaktisk kirurgi och experimentella behandlingar
Stereotaxisk kirurgi under natriumpentobarbitalbedövning (40 mg/kg, ip) utfördes enligt beskrivningen [25]. Mus Atg5 och kontroll shRNA transfekterades med förpackningsvektorer (AAV-U6-CMV-she-NA-EGFP) för att generera AAV. För mikroinjektion placeras sövda möss i en stereotaktisk apparat. De injicerades med 1 μL AV med glaselektrod med sikte på DG (AP:-0.3 mm; ML: ±0.13 mm; DV:-0.45 mm) med en hastighet på 0,25 μL/min. Sedan hölls nålen kvar i ytterligare 2-min 2 veckor efter virusmikroinjektion, möss utsattes för MPTP-inducerad PD-modellledning och (eller) Ka-behandling.
Atg5 shRNA erhölls från Hanbio Biotechnology (Shanghai, Kina) Co., Ltd. För Atg5-tystnaden visades primrarna i tilläggstabell 1.
2.5. Beteendeanalys
En vecka efter den sista injektionen av MPTP eller koksaltlösning utfördes rotarodtestet och poltestet som beskrivits tidigare [27]. För rotarod-testet acklimatiserades möss till rotarod i två försök (6 min med en accelererad hastighet på 12-20 rpm) per dag under 2 på varandra följande dagar innan experimentets början. Därefter testades mössen vid 20 rpm under 300 s under andra 3 dagar i följd. Latensen att falla registrerades med hjälp av Rotarod Analysis System (Jiliang, Shanghai, Kina). För stolptestet placerades möss med huvudet upp på toppen av en vertikal trästolpe (ojämn yta, höjd 50 cm, diameter 1 cm). Alla möss var vana vid apparaten 2 dagar före testning och testades sedan tre gånger på den tredje dagen. Den totala tiden (T-total, tills musen nådde golvet med sina fyra tassar) och vändtiden (T-sväng, för musen att vända huvudet nedåt helt) registrerades. Experimentet blindades för musgrupper för varje beteendetest och testet utfördes tre gånger.
2.6. Samling av hjärnprov
Efter de sista beteendetesterna bedövades mössen med natriumpentobarbital (40 mg/kg, ip). För qPCR, western blotting och högpresterande vätskekromatografi (HPLC) analys, extraherades hela hjärnan snabbt från djur, sedan dissekerades mellanhjärnan och striatumvävnaderna snabbt, förfrysta av flytande kväve. Alla prover lagrades vid -80 grad fram till analys.
För immunhistokemisk analys perfunderades möss transkardialt med 4 procent paraformaldehyd (PFA). Hjärnor extraherades, efterfixerades, dehydrerades, inbäddades i OCT (Tissue-Tek), och seriella sektioner av hjärnorna kryosnittades (30 μm per skiva) genom varje hela stratum och mellanhjärnan med hjälp av en frysmikrotom (Leica CM1950, Nussloch, Tyskland ). Alla sektioner samlades in i sex separata serier och hjärnskivor lagrades i 50 procent glycerin och frystes i -20 grad fram till analys.
För TEM perfunderades möss med 2,5 procent glutaraldehyd och 2 procent paraformaldehyd enligt beskrivningen 【12】. En liten portion (<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4="" ℃.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">
2.6. Immunhistokemisk analys
Hjärnskivor sköljdes i PBS följt av 3 procent H2O2 i 10 min och inkuberades sedan med 0.3 procent Triton X-100 i PBS kompletterat med 5 procent BSA i 1 timme. Därefter inkuberades objektglasen med de primära antikropparna vid 4 grader över natten i PBS innehållande 5 procent BSA vid 4 grader över natten, tvättades sedan och inkuberades i sekundära antikroppar i 1 timme vid rumstemperatur, följt av inkubering med diaminobensidin (DAB) eller montering i DAPI (Life Technologies, Cat P36931) som immunfluorescerande färgning i 5 min. För Nissl-färgning slogs objektglasen samman i kresylviolett (CV)-lösning (0,1 g kresylviolett, 99 ml H20 och 1 procent ättiksyra 1 ml) under 30 minuter vid rumstemperatur och dehydrerades sedan med alkohol och xylen. Bilder observerades och fotografier togs under ett Olympus BX52-mikroskop (Olympus America Inc., Melville, NY, USA). Det totala antalet TH-positiva och Nissls-positiva neuroner i SNpc erhölls serologiskt genom att använda den optiska fraktioneringsmetoden med MicroBrightField Stereo-Investigator-mjukvara (MicroBrightField, Williston, VT, USA).
2.7.Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) analys
Striatalprover från möss homogeniserades med {{0}},1 M perklorsyra (1 mg vävnader i 100μL perklorsyra) och 0,1 mM EDTA, behandlade med ultraljud och centrifugerades vid 20,000 rpm under 30 minuter som rapporterats [27]. Sedan uppsamlades supernatantvätskor för mätning. Den mobila fasen är en blandad lösning bestående av 90 mM monobasiskt natriumfosfat, 1,7 mM 1-oktansulfonsyra, 50 mM citrat, 50 uM EDTA, 10 procent acetonitril med en flödeshastighet på 0,2 ml/min. Parallellt, för kvantitativ standardkurva beräkning, bereddes stamstandardlösning för dopamin och dihydroxi-fenylättiksyra (DOPAC) (Sigma-Aldrich, USA) i 0,1 M HClO4. En mängd av 10 ul beredd supernatant eller standardlösning injicerades in i den mobila fasen och testades av ESA Coulochem III elektrokemisk detektor (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific). Prover mättes och toppar kvantifierades. Koncentrationerna av monoaminer kvantifierades genom att jämföra med standarden med programvaran ClarityChrom (Knauer, Tyskland) och sedan innehållet i stratumet omvandlades enligt utspädningsförhållandet Standardkurvan för DA och DOPAC visades i tilläggsfigur 1a och b.
2.8. Cellkulturer och behandlingar
Mesencefaliska primära neuronkulturer utfördes som beskrivits tidigare [12]. I korthet, de mesencefaliska vävnaderna från C57BL/6-möss på embryonal dag 14/15 (E14/15) avlägsnades försiktigt, dissocierades mekaniskt för att ta bort membranen och stora blodkärl, och sedan dissekerades. Därefter digererades de med trypsin-EDTA (Amresco, Solon, OH, USA) och filtrerades sedan genom ett 100-um-filter för att erhålla en encellssuspension. Därefter ströks cellerna ut på poly-L-lysin-förbelagda 12-/24-brunnsplattor med 2,5 × 10 graders celler/ml innehållande neurobasalt medium (Cat 21103049, GibcoTM , Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA) kompletterat med B27 (2 procent v:v, Cat 1750404, GibcoTM) och penicillin/streptomycin (0,5 procent v:v). Kulturerna hölls i en fuktad kammare (37 grader, 5 procent CO2-inkubator). Odlingsmediet byttes var tredje dag och cellerna kan användas vid 7-10 dagar.
Cellinjer: SH-SY5Y-cellinjer odlades i 10 procent FBS och 1 procent penicillin/streptomycin i en fuktad inkubator vid 37 grader och 5 procent CO2. I experimenten behandlades SH-SY5Y-celler med MPP plus (200 μM) eller olika doser av Ka (0,3,30,60,100,300,600uM) under 24h.Ka(3,10,30,60μM,3h)primad-SH- SY5Y-celler stimulerades med MPPt (400 μM) i 24 h. Ka (30 μM, 3 h) med (eller utan) 3-MA (3 mM, 1 h) eller -tokoferol (50 μM, 73 h, Sigma-Alrich, 73 h, 4h ）primade-SH-SH5Y-celler stimulerades med MPPT（200μM） i 24 timmar.
2.9. Cellviabilitet CCK8-analys
Den förändrade cellviabiliteten för Ka-behandling upptäcktes av Cell Counting Kit-8 (CCK-8 Kit, Selleck, Houston, TX, USA). Kort sagt, SHSY5Y-celler såddes i en 96- brunnsplatta och sedan behandlad med olika koncentrationer av Ka（3,30,60,100,300,600,600 uM）i 24 timmar. Sedan sattes 10 ul CCK-8-reagens till varje brunn under 4 timmar. Slutligen detekterades absorbansen av Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) vid 450 nm.
2.10. ATP-analys
De cellulära ATP-nivåerna detekterades av ett ATP Bioluminescence Assay Kit (Beyotime Biotechnology Co., Kina) enligt tillverkarens instruktioner. Efter behandling lyserades cellerna och centrifugerades vid 12, 000 rpm under 5 minuter vid 4 grader och supernatanterna samlades upp. Arbetslösning (100 μL) sattes till 20 μL prov i 96-brunnsplattan, och luminescensen mättes omedelbart på en automatiserad mikroplattläsare. Mätningar från alla prover normaliserades till proteinkoncentration.
2.11. Na plus -K plus -ATPas-analys
För mätning av Nat-K plus -ATPas (A070-2-2, Jiancheng, Nanjing, Kina) sonikerades cellerna och centrifugerades vid 600 rpm under 10 minuter för att erhålla supernatant. Reaktionslösningar av Nat-Kt-ATPas-detektion tillsattes och inkuberades enligt tillverkarens instruktioner. Sedan detekterades absorbansen vid 660 nm. Mätningar av alla prover normaliserades till proteinkoncentration.
2.12. Western blotting-analys
Celler eller hjärnvävnader lyserades i RIPA-bufferten (50 mM Tris (pH 7,4),cistanche คือ150 mM NaCl,1 procent NP-40 (FNN0021,Thermo),0,5 procent natriumdeoxicholat (D6750, Sigma),0,1 procent SDS (74255, Sigma) kompletterat med proteas och fosfatasinhibitorer (Roche, Shanghai, Kina). Proteinkoncentrationer bestämdes med Micro BCA Kit (Beyotime, Shanghai, Kina). Ett 30-ug-protein från varje prov separerades med SDS-PAGE med användning av polyakrylamid-TGX-geler (Bio-Rad, Hercules, Kalifornien, USA) och överfördes sedan till polyvinylidendifluorid (PVDF)-membran (Millipore, Bedford, MA). Efter blockering inkuberades PVDF-membran med olika specifika primära antikroppar i TBST vid 4 grader över natten och tvättades sedan och inkuberades i motsvarande pepparrotsperoxidas (HRP) konjugerade sekundära antikroppar i 1 timme vid rumstemperatur. Immunoreaktiva band visualiserades och detekterades med förstärkt kemiluminescens (ECL) plus detektionsreagens (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) och analyserades med hjälp av ImageQuantTM LAS 4000 avbildningssystem (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA).
2.13. Kvantitativ (Q)- och omvänd transkription (RT)-PCR i realtid
Totalt RNA extraherades från hjärnvävnader och odlade celler med användning av Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Omvänd transkription utfördes med användning av TAKARA PrimeScript RT-reagenskit (TaKaRa, Japan). Realtime qPCR utfördes med SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) i ett StepOnePlus-instrument (Applied Bio-systems). Primerna köptes och validerades av generalen (Shanghai, Kina). De primrar som används för qPCR visades i tilläggstabell 2.
Den här artikeln är extraherad från Redox Biology 41 (2021) 101911
