Tarmskydd av proantocyanidiner involverar antioxidativa och antiinflammatoriska åtgärder i samband med en förbättring av insulinkänslighet, lipid- och glukoshomeostas Del 1
Apr 28, 2022
Vänligen kontaktaoscar.xiao@wecistanche.comför mer information
Mag-tarmkanalen (GI-kanalen är ett komplext system som fyller viktiga funktioner i människokroppen-3. Det säkerställer matsmältning och absorption av näringsämnen, bidrar till övergripande immunologisk kompetens genom att ge skydd mot patogener, producerar flera peptidhormoner som verkar på flera vävnader och vägar, och hyser mikrobiella samhällen som interagerar med värden och påverkar den metabola hälsan45. Dessutom skyddar tarmepitelet från främmande patogeninvasion och fungerar som den första försvarslinjen, vilket är avgörande för att förebygga flera sjukdomar6.
Mag-tarmkanalen utsätts kontinuerligt för skadliga stimuli som kan orsaka oxidativ stress (OCS), inflammation och skador. Intraluminalpro-oxidanter från intagna näringsämnen innehåller varierande koncentrationer av lipidoxidationsprodukter, såsom kolesteroloxider',8. Det intestinala epitelet är också föremål för flera oxidantangrepp från
Figur 1. Effekter av PAC på cellintegritet och livsduglighet för Caco2/15-celler. Integriteten för Caco 2/15-monoskiktet bestämdes av cellviabilitet, differentiering och tight junction-analyser i ett helt differentierat tillstånd.
Proantocyanidiner (PACs, 250 ug/ml) sattes till den apikala cellavdelningen i 24 timmar före behandling med Fe/Asc (200 uM/2 mM) i 6 timmar vid 37°C.cistancheextraktpulver(A) MTT användes för att analysera cellviabilitet, och (B) transepitelial resistens bestämdes också. (C) Villain, (D) Occludin och (E) Claudin proteinuttryck bedömdes med Western blot. Resultaten representerar medelvärdet ±SEM för 3 oberoende experiment, vart och ett i tre exemplar. En representativ Western blot visas, som illustrerar ett experiment i tre exemplar på samma gel och vid samma exponering.
katalasnegativa bakterier, oxidasproducerande desquamerade celler (t.ex. xantinoxidas) och saliv innehållande hypotiovansyra, som ökar reaktiva syrearter (ROS) i tarmens lumen. Viktigt är att ROS kan skada cellmembranen, störa barriärens integritet. och leder till förbättrad tarmpermeabilitet, inflammation och endotoxemi. Kombinationen av OCS och inflammation i tarmen äventyrar immunförsvaret, endokrina och nervösa funktioner. I synnerhet framkallar det en minskning av insulinkänsligheten (IS), vilket utlöser metabola störningar12,13.
Nyligen har växande bevis tyder på att polyfenoler och derivat har potential att förebygga och behandla kroniska sjukdomar'4. Dessa sekundära växtmetaboliter uppvisar olika biologiska egenskaper och får ett växande intresse bland forskare. De kan minska ROS-generering, neutralisera OCS-utveckling och bekämpa inflammation5,16.cistanche genghis khan,Verkningsmekanismerna som leder till fördelaktiga resultat förblir dock svårfångade. Dessutom, med tanke på deras begränsade absorption och biotillgänglighet, var undersökningar av deras fysiologiska funktioner begränsade till polyfenoltransport och katabolism i tarmen.
Cistanche kan förbättra immuniteten
Huvudsyftet med studien är att bestämma moduleringen av OxS och inflammation av proantocyanidiner (PAC), som är rikligt med flavan-3-oler i dietfrukter, grönsaker, nötter och spannmål. Eftersom OCS och inflammation är två avgörande processer som främjar IS, utvärderas insulinsignalering som svar på PAC. Effekten av dessa polyfenoler bedöms också på fettsyror (FA) -oxidation och lipogenes,cistanche i byxornavilket gör det möjligt att uppskatta lipidhomeostas. Mekanismerna bakom PAC-påverkan utvärderas genom att fokusera på centrala transkriptionsfaktorer. För detta ändamål har vi använt den väletablerade mänskliga odödliga cellinjen Caco-2/15. Dessa tarmceller är kända för att genomgå en spontan celldifferentiering som leder till bildandet av ett cellmonoskikt som uttrycker flera morfologiska och funktionella egenskaper hos mogna mänskliga enterocyter7-19.
Resultat
Caco 2/15 cellintegritet efter olika behandlingar. Innan vi utvärderade effekten av polyfenoler på olika processer ville vi se till att Caco-2/15-celler bibehöll sin integritet som svar på järn/askorbat (Fe/Asc) och PAC-behandling. Cellviabiliteten påverkades inte som observerats från den oföränderliga 3-(4,5-dimetyldiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT)-analysen (Fig. 1A) . Bekräftelse av integritetsbevarande erhölls efter analys med trypanblått-uteslutning (data visas ej). Vidare avslöjade inte mätning av transepitelial elektrisk resistans någon signifikant modifiering av barriärens integritet
Figur 2. Effekter av PAC på lipidperoxidation, endogena antioxidanter och oxidativ stress nyckeltranskriptionsfaktorer i Caco-2/15-celler. Proantocyanidiner (PACs, 250 ug/mL) tillsattes till det apikala cellutrymmet i 24 timmar före behandling med Fe/Asc (200μM/2 mM) i 6 timmar vid 37 grader C. Lipidperoxidation bestämdes genom att mäta (A)MDA-nivåer genom HPLC. Proteinuttrycket av (B)SOD2, (C) GPx, (D)NRF2 och (E)Keep 1 bestämdes med Western blot. (F) Förhållandet NRF2/Keapl beräknades. Resultaten representerar medelvärdet ±SEM för 3 oberoende experiment, vart och ett i tre exemplar. En representativ Western blot visas som illustrerar ett experiment i tre exemplar på samma gel och med samma exponering.*P<><0.001 ys="" untreated=""><><><0.001 vs="" fe/asc-treated="" cell.mda="" malondialdehyde,="" sod2="" superoxide="" dismutase="" 2,="" gpx="" glutathione="" peroxidase,="" nrf2="" nuclear="" factor="" erythroid="" 2-related="" factor="" 2,="" keap1="" kelch-like="" ech-associated="">
Effekter av PAC på Fe/Asc-inducerad OCS.cistanche nära migVi uppskattade sedan induktionen av OCS efter Fe/Asc-administrering. Bedömning med HPLC av malondialdehyden (MDA), som en biomarkör för lipidperoxidation, visade ett förhöjt MDA-innehåll jämfört med kontroll Caco-2/15-celler (Fig. 2A). Konsekvent reducerades proteinuttrycket av antioxidanten superoxiddismutas 2(SOD2)- och glutationperoxidas(GPx)-enzymer av Fe/Asc jämfört med obehandlade celler (Fig.2B, C). Icke desto mindre motverkade närvaron av PAC Fe/Asc-medierad lipidperoxidation, vilket framgår av MDA-minskning såväl som SOD2- och GPx-höjning. Eftersom transkriptionsfaktorn nukleär faktor erytroid-2-relaterade faktor 2(NRF2) är avgörande för regleringen av endogena antioxidanter, utvärderade vi dess proteinuttryck (Fig.2D). Inga förändringar i NRF2 upptäcktes i Caco-2/15-celler behandlade med Fe/Asc och PAC, men proteinuttrycket av dess negativa regulator Kelch-liknande ECH-associerat protein 1(Keap1), en biosensor för oxidativ och elektrofil spänningar, uppreglerades av Fe/Asc och nedreglerades av PACs (Fig.2E). I synnerhet följde det viktiga förhållandet NRF2/Keap1, som är en indikator på transkriptionell aktivering av NRF2, samma trend (Fig.2F). Sammantaget är PAC effektiva för att motverka Fe/Asc-medierad OCS.
PAC-effekter och verkningsmekanismer med avseende på den inflammatoriska processen. Pro-inflammatoriska cytokiner utlöses i tarmepitelceller vid OCS-tillstånd. Våra experiment bekräftade denna observation genom att demonstrera en Fe/Asc-medierad tumörnekrosfaktor-alfa(TNF)-induktion (Fig. 3). I linje med dessa data ökade proteinuttrycket av cyklooxygenas-2(COX2), ett enzym som utövar en mångfacetterad roll i inflammationsfrämjande och vidmakthållande, av prooxidanten Fe/Asc. I alla fall,cistanche para que servePAC-administration kompenserade TNF- och COX2-proteinnivåer framkallade av Fe/Asc (Fig. 3A, B). Eftersom nukleär faktor kappa-B(NF-KB) representerar en kraftfull mediator av inflammatoriska svar, testade vi dess implikation i transkriptionen av de tidigare nämnda inflammatoriska komponenterna (Fig. 3C). Medan Caco-2/15-celler som utmanats av Fe/Asc uppvisade en hög NF-KB-signal troligen genom att aktivera NF-KB/IkB-förhållandet (Fig. 3E) och fosforylering av dess inhibitor
Figur 3. Effekter av PAC på inflammatoriska markörer och nyckeltranskriptionsfaktorn NF-kB i Fe/Asc-inducerad inflammation i Caco-2/15-celler. Proantocyanidiner (PACs, 250 ug/ml) sattes till den apikala cellavdelningen i 24 timmar före behandling med Fe/Asc (200 uM/2 mM) i 6 timmar vid 37 grader. Proteinuttryck av (A)COX2 och (B)TNFa,(C)NF-kB,(D)IkB och dess (F)fosforylerade form (gädda) bestämdes med Western blot. Förhållandena (E) NF-kB/IkB och (G)plan/IkB beräknades. Resultaten representerar medelvärdet ±SEM för 3 oberoende experiment, vart och ett i tre exemplar. En representativ Western blot visas som illustrerar ett experiment i tre exemplar på samma gel och med samma exponering.*P<><0.01 vs="" untreated=""><><0.01 vs="" fe/asc="" treated="" cells.="" cox2="" cyclooxygenase-2,="" tnfα="" tumor="" necrosis="" factor-alpha,="" nf-xb="" nuclear="" transcription="" factor-kappa="" b,="" ikb="" inhibitor="" of="" kappa="">
Reglering av intracellulär lipidmetabolism av PAC. Nästa steg var att utvärdera effekten av PAC på lipidhomeostas genom att fokusera på nyckelproteiner som reglerar FA-oxidation och lipogenes. Vi undersökte först uttrycket av karnitinpalmitoyltransferas I(CPT-la) eftersom detta protein är det hastighetskontrollerande enzymet för FA-oxidationsvägen. En lägre nivå av proteinuttryck karakteriserade CPT-1 som svar på Fe/Asc-behandling, medan förinkubationen med PAC förhindrade dess nedgång jämfört med obehandlade celler (Fig. 4A). Dessa fynd fick oss att bestämma de potentiella verkningsmekanismerna genom att granska proteinmassan av peroxisomproliferatoraktiverad receptor alfa (PPARa) och peroxisomproliferatoraktiverad receptor-gammakoaktivator 1-alfa (PGC-la) eftersom de representerar två transkriptionsfaktorer som är nödvändiga för högnivåuttryck av mitokondriell FA-oxidation. Western blot-analys visade en lätt nedreglering av PPARa utan förändringar i PGC-1a(Fig.4B, C). Icke desto mindre förhindrade närvaron av PAC Fe/Asc-medierad PGC-1a och PPAR-nedgång. Därefter vände vi oss mot de reglerande enzymer som kontrollerar lipogenesprocessen. Som visas i Fig. 4 noterades en viktig droppe av fosforylerat acetyl CoA-karboxylas (ICC) och en markant ökning av fettsyrasyntas (FAS) efter Fe/Asc-administrering, vilket indikerar aktiveringen av lipo-genes (Fig. 4D, E). Dessa förändringar berodde troligen på induktionen av transkriptionsfaktorerna PPARy och sterolregulatoriskt elementbindande protein lc (SREBP1c) i (aco-2/15-celler (Fig, 4EG) Närvaron av PAC var fördelaktig eftersom det vände pro-lipogeneseffekter av Fe/Asc Eftersom AMP-aktiverat proteinkinas alfa (AMPKa) representerar en central regulator av FA-oxidation och lipogenes, undersökte vi dess proteinuttryck, som visade sig vara förhöjt som svar på Fe/Asc medan det normaliserades Som svar på PACs. På det hela taget upprätthåller de flesta av dessa fynd en skyddande roll för PAC i lipidhomeostas (Fig. 5).
Inverkan av PAC på intracellulär glukosmetabolism och insulinresistens. Glukoneogenesen kontrolleras strikt av aktiviteten hos hastighetsbegränsande enzymer såsom fosfoenolpyruvatkarboxykinas (PEPCK) och glukos-6-fosfatas (G6Pase). Vi undersökte statusen för dessa enzymer genom att analysera deras pro-
Figur 4. Effekter av PAC på FA-oxidation och lipogenes i Caco-2/15-celler. Proantocyanidiner (PAC, 250 ug/mL),cistanche penissattes till den apikala cellavdelningen i 24 timmar före behandling med Fe/Asc (200 μM/2 mM) i 6 timmar vid 37 grader C. Proteinuttrycket av specifika markörer för FA-oxidation:((A) CPTla,( B) PPARa och (C) PGCl såväl som av lipogenes: (D) ACCfosforylering, (E) FAS, (F) PPARy och (G) SREBP1) bedömdes med Western-blot. Resultaten representerar medelvärdet ± SEM för 3 oberoende experiment, vart och ett i tre exemplar. En representativ Western blot visas, som illustrerar ett experiment i tre exemplar på samma gel och med samma exponering.*P<><0.01 vs="" untreated="" cells=""><><0.01 vs="" fe/asc="" treated="" cells.="" cpt="" carnitine="" palmitoyltransferase="" alpha,="" ppar="" peroxisome="" proliferator-activated="" receptor,="" pgcia="" peroxisome="" proliferator-activated="" receptor="" gamma="" coactivator="" 1-alpha,="" accacetyl-coa="" carboxylase,="" fas="" fatty="" acid="" synthase,="" srebp1-c="" sterol="" regulatory="" element-binding="">
Figur 5. Effekter av PAC på AMP-aktiverat proteinkinas alfa(AMPKa) som reglerar fettsyraoxidation och lipogenes i Caco-2/15-celler. Proantocyanidiner (PAC, 250 ug/ml) sattes till den apikala cellen
kompartment i 24 timmar före behandling med Fe/Asc (200 μM/2 mM) i 6 timmar vid 37 grader C. Proteinuttrycket av AMPKa utvärderades med Western Blot. Resultaten representerar medelvärdet ±SEM för 3 oberoende experiment, vart och ett i tre exemplar. En representativ Western blot visas som illustrerar ett experiment i tre exemplar på samma gel och med samma exponering.*P<0.05 vs="" untreated="" cells(ctrl).=""><><0.01 vs="" fe/asc="" treated="">
Denna artikel är extraherad från Scientifc Reports|(2021) 11:3878|https://doi.org/10.1038/s41598-020-80587-5
