Karnovskys fixativ förhindrar att artefakter uppträder som vakuolering härrörande från vävnadsbearbetning i njurar behandlade med antisensoligonukleotid Ⅱ
Apr 03, 2024
Makroskopiskt observerades inga onormala förändringar. Dessutom, i blodkemi, visade njurparametrar (dvs. BUN och CRE) inga signifikanta förändringar i någon grupp (tabell 1).
Cistanche Supplement Njurfunktion Support Supplement PhGs75% Ech 30% Act 12%
En sammanfattning av de histopatologiska fynden i njurar fixerade med 10 % NBF visas i Tabell 2. Mikroskopiskt observerades basofila granuler och vakuoler i de proximala tubuli, särskilt i S1- och S2-segmenten, i både ASO-1W och ASO-2W-grupper för njurar fixerade med 10 % NBF (Fig. 1A). Dessa förändringar var allvarligare i ASO-2W-gruppen än i ASO-1W-gruppen. Ansamlingen av basofila granuler observerades huvudsakligen på borstkanten av de proximala tubuli som aggregat och/eller punktformiga strukturer. Eftersom basofila granuler rapporteras vara närvarande både inom endosomerna eller lysosomerna och fritt i cytoplasman av det proximala tubulära epitelet14, kan dessa olika former återspegla deras ackumulerade yta; det vill säga aggregaten och punktstrukturerna kan ackumuleras i lysosomer respektive cytoplasman. Vakuolerna i de proximala tubuli var runda och grova till formen, och de flesta var sammansmälta med intilliggande vakuoler. Dessutom innehöll några av vakuolerna svaga basofila granuler (Fig. 1E), vilket tyder på att vakuolerna var relevanta för ackumuleringen av ASO. Immunhistokemiskt var LAMP-2 positiv på membranytan av vakuolerna (Fig. 1G och 1H). Resultaten indikerade att vakuoleringen var dilatationen av lysosomer. Skillnaden i graden av vakuolering mellan ASO-1W- och ASO-2W-grupperna kan indikera skillnaden i antalet ASO:er ackumulerade i lysosomer. Vi spekulerar i att mängden ASO ackumulerade i lysosomer ökar med ökande exponeringstid för ASO. Följaktligen uppträdde lysosomal expansion som vakuolering på grund av vävnadsbearbetning.
Tabell 1. Blodkemidata
Tabell 2. Histopatologiska fynd i njurarna fixerade med 10 % N
Även om måttlig vakuolering observerades, var proximal tubulär degeneration inte uppenbar, och majoriteten av de vakuolerade epitelet var negativa för KIM-1 vid immunhistokemisk färgning (Fig. 1D). För prover fixerade i Karnovskys fixativ var däremot vakuoler i de proximala tubuli frånvarande hos alla individer, medan basofila granuler ofta observerades (Fig. 1B). De basofila granulerna var mer framträdande än de i prover som utsattes för 10% NBF-fixering eftersom cellstrukturen var välbevarad (Fig. 1F). I prover som utsattes för 4 % PFA-fixering observerades vakuoler och basofila granuler; emellertid var svårighetsgraden av vakuolering något lägre än den i prover som utsatts för 10% NBF-fixering (Fig. 1C).
Oligonukleotider är mycket vattenlösliga molekyler och extraheras från vävnader under bearbetning på grund av misslyckande med att helt tvärbinda de cellulära komponenterna.
Baserat på dessa resultat drog vi slutsatsen att vakuoler i proximala tubuli påverkades av fixeringsmetoden och att de morfologiska förändringarna som observerades i vävnader som utsatts för 10% NBF- och 4% PFA-fixering kan vara artefakter i området för ASO-ackumulering under vävnadsbearbetning. Med andra ord kan vakuolering vara toxikologiskt obetydlig eftersom ingen tubulär degeneration, ökat uttryck av KIM-1 eller onormala förändringar i njurparametrar observerades. Därför föreslår vi att man använder Karnovskys fixativ som den valfria fixeringsmetoden för noggrann patologisk undersökning av njuren hos ASO-behandlade djur.
Sammanfattningsvis avslöjade våra nuvarande fynd den möjliga överskattningen av vakuolering vid användning av den konventionella NBF-fixeringsmetoden. Karnovskys fixativ kan vara ett användbart verktyg för att skilja artificiella vakuoler från verklig nefrotoxicitet.
Fig. 1. Representativa mikrofotografier av njurarna behandlade med antisensoligonukleotid (ASO). Histopatologiska förändringar i 2-veckans låst nukleinsyra innehållande antisensoligonukleotid (LNA-ASO)-behandlad grupp (ASO-2W) för njurar fixerad med (A) 10 % neutralbuffrad formaldehydlösning (NBF), ( B) Karnovskys fixativ, eller (C) 4% paraformaldehydfosfatbuffert (PFA). (D) Immunhistokemisk färgning för njurskademolekyl-1 (KIM-1) av ASO-2W för njurar fixerad med 10 % NBF.Histopatologiska förändringar i den 1-veckors LNA-ASO-behandlade gruppen (ASO-1W) för njurar fixerade med (E) 10 % NBF och (F) Karnovskys fixativ. Immunhistokemisk färgning för lysosomalt associerat membranprotein 2 (LAMP-2) av (G) ASO-1W och (H) ASO-2W för njurar fixerade med 10 % NBF. (A) Basofila granuler (svarta pilar) och vakuoler (svarta pilspetsar) observeras i de proximala tubuli. Hematoxylin och eosin (H&E) färgning. Bar=20 μm. (B) Vakuoler observeras inte, men basofila granuler (svarta pilar) observeras. H&E-färgning. Bar=20 μm. (C) Basofila granuler (svarta pilar) och vakuoler (svarta pilspetsar) observeras. Emellertid var svårighetsgraden av vakuolering lägre än den i prover som utsatts för 10 % NBF-fixering. H&E-färgning. Bar=20 μm. (D) Majoriteten av de vakuolerade proximala tubuli är negativa för KIM-1. Bar=20 μm. (E, F) Några av vakuolerna som observerades i proximala tubuli innehöll basofila granuler svagt (gröna pilar). De basofila granulerna observeras tydligt och cellstrukturen bevaras (gröna pilspetsar). H&E-färgning. Staplar=20 μm. (G, H) Vakuolernas membranyta är positiv för LAMP-2 (blå pilar). Staplar=20 mm.
Avslöjande av potentiella intressekonflikter: Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt.
Tack: Författarna är tacksamma mot Keisuke Yoshikawa och Tetsuya Ohta för deras vänliga råd.
Referenser
1. Rinaldi C och Wood MJA. Antisensoligonukleotider: nästa gräns för behandling av neurologiska störningar. Nat Rev Neurol. 14:9–21. 2018. [Medline] [CrossRef]
2. Uemura Y och Kobayashi K. Inriktning på murina alveolära makrofager genom intratrakeal administrering av låst nukleinsyra innehållande antisensoligonukleotider. Drug Deliv. 26: 803–811. 2019. [Medline] [CrossRef]
3. Bennett CF. Terapeutiska antisensoligonukleotider börjar bli myndiga. Annu Rev Med. 70: 307–321. 2019. [Medline] [CrossRef]
4. Frazier KS. Antisense oligonukleotidterapier: löftet och utmaningarna från en toxikologisk patologs perspektiv. Toxicol Pathol. 43: 78–89. 2015. [Medline] [CrossRef]
5. Engelhardt JA. Jämförande renal toxikopatologi av antisensoligonukleotider. Nukleinsyra Ther. 26: 199–209. 2016. [Medline] [CrossRef]
6. Frazier KS, Sobry C, Derr V, Adams MJ, Besten CD, De Kimpe S, Francis I, Gales TL, Haworth R, Maguire SR, Mirabile RC, Mullins D, Palate B, Doorten YPS, Ridings JE, Scicchitano MS , Silvano J och Woodfine J. Artspecifika inflammatoriska svar som en primär komponent för utveckling av glomerulära lesioner hos möss och apor efter kronisk administrering av en andra generationens antisensoligonukleotid. Toxicol Pathol. 42: 923–935. 2014. [Medline] [CrossRef]
7. Sy S, Gubler M, Gérard R, Avignon B, Mueller Y, Braendli-Baiocco A, Odin M och Moisan A. GalNAc-konjugering dämpar cytotoxiciteten hos antisensoligonukleotidläkemedel i njurtubulära celler. Mol Ther nukleinsyror. 14: 67–79. 2019. [Medline] [CrossRef]
8. Kakiuchi-Kiyota S, Koza-Taylor PH, Mantena SR, Nelms LF, Enayetallah AE, Hollingshead BD, Burdick AD, Reed LA, Warneke JA, Whiteley LO, Ryan AM och Mathialagan N. Jämförelse av hepatiska transkriptionsprofiler för låsta ribonukleinsyra-antisensoligonukleotider: bevis på distinkta vägar som bidrar till icke-målmedierad toxicitet hos möss. Toxicol Sci. 138: 234–248. 2014. [Medline] [CrossRef]
9. Hagedorn PH, Yakimov V, Ottosen S, Kammler S, Nielsen NF, Høg AM, Hedtjärn M, Meldgaard M, Møller MR, Ørum H, Koch T och Lindow M. Hepatotoxisk potential för terapeutiska oligonukleotider kan förutsägas utifrån deras sekvens och modifieringsmönster. Nukleinsyra Ther. 23: 302–310. 2013. [Medline] [CrossRef]
