Karnovskys fixativ förhindrar att artefakter uppträder som vakuolering som härrör från vävnadsbearbetning i njurar som behandlats med antisensoligonukleotid Ⅰ

Abstrakt: Antisensoligonukleotid(ASO) terapier har identifierats som en ny behandlingsmodalitet försvårlösta sjukdomar. Injurar behandlade med ASOVakuoler, förutom basofila granuler, observeras ofta i de proximala tubuli. Vissa rapporter har beskrivit att dessa vakuoler sannolikt är ett sekundärt fenomen till följd avutvinning av ASO:erunder vävnadsbearbetning. I denna studie jämförde vi njurmorfologi efter fixering med Karnovskys fixativ eller 4% paraformaldehydfosfatbuffert (PFA) med den för 10% neutralbuffrad formaldehydlösning (NBF). Sprague-Dawley-råttor av honkön, intravenöst behandlade fyra gånger med 50 mg/kg låst nukleinsyra innehållande antisensoligonukleotider (LNA-ASOs) under 1 eller 2 veckor, undersöktes. Mikroskopiskt observerades vakuoler och basofila granuler i de proximala tubuli i njurarna fixerade med NBF. Basofila granulat tyder på ackumulering av ASO. Dessutom innehöll några av vakuolerna också svaga basofila granuler, vilket tyder på att vakuolerna var relevanta för ackumuleringen av ASO. Även om måttlig vakuolering observerades i de proximala tubuli, var majoriteten av de vakuolerade epitelet negativa för njurskademolekylen -1 vid immunhistokemisk färgning. Vakuoler i de proximala tubuli observerades inte i prover som utsatts för Karnovskys fixering, även om basofila granuler observerades. I prover som utsatts för PFA-fixering observerades vakuoler och basofila granuler i de proximala tubuli, liknande de i prover som utsatts för NBF-fixering. Sammantaget visade våra fynd möjligheten av överskattning av vakuolering på grund av artefakter under vävnadsbearbetning vid användning av konventionell NBF-fixering. Karnovskys fixativ anses vara ett användbart alternativ för att skilja artificiella vakuoler från verklig nefrotoxicitet. (DOI: 10.1293/tox.2021-0007; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

Nyckelord:antisense oligonukleotid, artefakt,Karnovskys fixativ, vakuolering, basofil granulat, njure

Cistanche Supplement Njurfunktion Support Supplement PhGs75% Ech 30% Act 12%

Nyligen har antisensoligonukleotidterapier (ASO) etablerats som nya metoder för behandling av svårbehandlade sjukdomar1, 2. ASO:er är korta, syntetiska, enkelsträngade oligodeoxinukleotider som binder till ribonukleinsyra och undertrycker genuttryck3.

Toxikologiskt kategoriseras ASO-inducerade toxiciteter i hybridiseringsberoende toxiciteter, som är relaterade till ASO-sekvensen, och hybridiseringsoberoende toxiciteter, som är relaterade till kemisk modifiering. Hybridiseringsoberoende toxiciteter induceras av tre huvudmekanismer: 1) ASO-ackumulering, 2) pro-inflammatoriska effekter och 3) aptameriska bindningseffekter4. Ansamlingen av ASO observeras främst i levern och njurarna, och överdriven ackumulering leder till dysfunktion av dessa organ5. Den pro-inflammatoriska effekten induceras av stimulering av det medfödda immunsystemet via bindning till Toll-liknande receptorer hos gnagare och apor eller aktivering av den alternativa komplementvägen via hämning av faktor H av ASO hos apor6. Den aptameriska bindningseffekten inducerar trombocytaktivering och aggregation/trombocytopeni för att binda den trombocytspecifika receptorn7. Dessutom anses aptamerisk bindning till intracellulära proteiner i hepatocyter vara en av orsakerna till hepatotoxicitet8–10. För att upptäcka dessa toxiciteter har forskare utvecklat flera icke-kliniska analyser; bland dessa är histopatologisk undersökning ett av de mest känsliga testerna för att upptäcka ASO-ackumulering.

Histopatologiskt observeras ackumuleringen av ASO vanligtvis som basofila granuler i cytoplasman hos Kupffer-cellerna i levern eller de proximala tubuli i njurarna. Den framträdande ansamlingen av basofila granuler är korrelerad med en ökad förekomst eller svårighetsgrad av degenerativa förändringar, vanligtvis observerade som vakuolering eller degeneration/nekros av det proximala tubulära epitelet i njurarna4. Enbart basofila granuler anses inte vara toxikologiskt signifikanta11; därför är differentieringen av basofila granulatackumulering från degenerativa förändringar viktig för att utvärdera ASO-relaterade toxiciteter.

Vakuoler, som ofta observeras i de proximala tubuli i njurarna hos cynomolgusapor som behandlats med ASO, innehåller basofilt material och uppvisar samma allmänna fördelning inom cellerna som basofila granuler11, 12. Ett fåtal rapporter har antytt att fixeringsprocessen kan påverka uppkomsten av ASO-ackumulering i det fagolysosomala utrymmet5, 11. Dessutom, Henry et al. och Engelhardt beskrev att vakuoler i de proximala tubuli sannolikt är ett sekundärt fenomen som är ett resultat av extraktion av ASO under bearbetning eftersom vakuolerna saknas i paraformaldehyd/glutaraldehyd perfusionsfixerade njurar5, 11. Vakuoler i de proximala tremoluerna hos apor. med mipomersen spekulerades att dyka upp under fixeringsprocessen13.

Således, även om vakuolering på grund av ASO-behandling kan vara en artefakt i vissa fall, har denna hypotes inte bevisats tydligt, och inga rapporter har identifierat den lämpliga fixeringsmetoden för toxikologisk utvärdering. Följaktligen jämförde vi i denna studie njurmorfologi efter fixering med Karnovskys fixativ eller 4% paraformaldehydfosfatbuffert (PFA) med den för 10% neutralbuffrad formaldehydlösning (NBF). Dessutom visade vi användbarheten av Karnovskys fixativ som ett alternativt fixativ för att förhindra artefakt-härledd vakuolation.

Fyra veckor gamla Sprague-Dawley-honråttor köptes från Charles River Laboratories Japan Inc. (Kanagawa, Japan) och acklimatiserades till laboratorieförhållanden. Djuren hölls under kontrollerade förhållanden (12-timmars ljus/mörkercykel, temperatur på 23 ± 2 grader, relativ fuktighet på 50 ± 25%) och fick fri tillgång till en kommersiell standarddiet (autoklaverad CR-LPF; Oriental Yeast Co., Ltd., Tokyo, Japan) och kranvatten. Tjugo djur tilldelades följande fyra grupper (med fem djur vardera): den 1-veckors saltlösningsbehandlade gruppen (Control- 1W), 2-veckors saltlösningsbehandlad grupp (Control{ {14}}W), den 1-vecka låsta nukleinsyran innehållande antisensoligonukleotid (LNA-ASO)-behandlad grupp (ASO-1W), och 2-veckors LNA ASO-behandlad grupp (ASO-2W). Djuren var 5 veckor gamla vid tidpunkten för initiering av 50 mg/kg LNA-ASO-administrering. LNA-ASO administrerades intravenöst fyra gånger totalt enligt följande regim: dag 1, 4, 8 och 11 i ASO-2W-gruppen; och dag 1, 2, 3 och 4 i ASO-1W-gruppen. Djuren i kontroll-1W- och ASO-1W-grupperna avlivades på dag 7. Djuren i kontroll-2W- och ASO-2W-grupperna avlivades på dag 14. Vid varje terminal obduktion togs blodprover för klinisk patologi från bukvenen cava under djup anestesi med isofluran. Efter blodprovstagning avlivades alla råttor genom avblodning genom att omedelbart skära av den abdominala aortan. Den yttre kroppsytan, bröst- och bukhålorna samt inälvorna undersöktes makroskopiskt och de vänstra njurarna avlägsnades och bearbetades för mikroskopisk undersökning. Alla procedurer utfördes i enlighet med reglerna för utfodring och förvaring av försöksdjur och djurförsök från Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation.

Serumprov erhölls genom centrifugering av blodproverna vid 4 grader. Serumbiokemisk analys utfördes med ett TBA-2000FR-instrument (Canon Medical Systems Corporation, Tochigi, Japan) för att bedöma nivåerna av ureakväve i blodet (BUN) och kreatinin (CRE)

Njurarna fixerades med hjälp av tre fixativa lösningar enligt följande: Efter att ha delat njuren på tvären i tre segment fixerades den mellersta delen inklusive njurbäckenet i 10% NBF under 5 dagar; kranialdelen fixerades i Karnovskys fixativ (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Tokyo, Japan); och den kaudala delen fixerades i 4 % PFA under 17 timmar vid 4 grader och placerades sedan i 10 % NBF under 24 timmar. Varje fixerat prov dehydrerades och bäddades in i paraffin. Vävnadssektioner preparerades för hematoxylin och eosin (H&E) färgning. Immunhistokemisk färgning utfördes med användning av antikroppar riktade mot njurskademolekyl-1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA; 1:300 spädning) och lysosomalt associerat membranprotein 2 (LAMP{{ 13}}, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA; Histofine Simple Stain Rat MAX PO (Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Japan) användes som den sekundära antikroppen.

Supporttjänst från Wecistanche:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Handla för fler specifikationer:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-butik